8/17/2019 Extragerea Adn

1/5

2.2.2 Extragerea ADN-ului

Extragerea ADN-ului se efectuiază astfel:

1g material vegetal ( de preferat proaspăt colectat sau înghe at i păstrat înț ș

azot lichid se înghea ă în azot lichid i se mărun e te într-un mo!ar" #a pudraț ș ț ș

o$ inută se adaugă %-& ml solu ie tampon pentru extrac ie ( 1&&m' ris-)*l+ p)ț ț ț

,". /", m' EDA+ p) "0. 0"2 ' Na*l. 1"&&3 sarcos4l-Na+ 1"&&3 5-

mercaproetanol"

6ig"%" 7udra de masă vegetală cu solu ie tamponț

8mogenatul se transfera în tu$uri

Ependorf marcate cu inscrip ii după ceț

dezghea ă" 9e incu$ează 2 minute înț

 $aia cu apă la /2;*+ tu$urile se

inversează fiecare 10 minute pentru a

rezulta o liză i separare a pigmen ilor ș ț

mai efectivă" După $aie la amestec se

6ig" &" 8mogenatul după $aia cu apă formică- alcool izoamilic (%

8/17/2019 Extragerea Adn

2/5

9e centrifughează 2 minute la

8/17/2019 Extragerea Adn

3/5

lăsînd un spa iu li$er de 0"2-1"0 mm între parte de !os a măsu ei i pieptene"ț ț ș

7olimerizarea gelului durează %0-

8/17/2019 Extragerea Adn

4/5

 pentru 7*= în volum de &0 @l con ine: %@l de ADN vegetal (10-&0ng. 1@l deț

 primer cu concentra ia de 2 pmol@l. & @l (1m' dN7+ 0"12@l ( 2u@l aH-ț

 polimeraza. &@l 7*=-solu ie-tampon (/,0m' ris-)*l+ p) ". 1// m'ț

(N)* J203+ tK1-& minute. >*L203+ tKpînă laș

10 minute" emperatura de aliniere (m a primerilor se selec ionează conformț

formulei:

mK *%M(A i se determină empiric (>avrilă #"+ %00&" impulș

de elongare pentru produsul de 7*= cu lungimea pînă la %B$ este de 1 minut+ cu o

lungime mai mare se ia 1B$min" Numarul de cicluri depinde de cantitatea de ADN

în 7*= solu ie i volumul de produsul 7*= după amplificare care se dore te deț ș ș

o$ inut" 7rodusele amplificării se analizează cu a!utorul electroforezei în gel deț

agaroză"

8/17/2019 Extragerea Adn

5/5

6ig /" 9etarea

Amplificatorului >enset ,00 CApplied ?ios4stemC