7. Enzime7.1. Aspecte generaleEnzimele sunt substane chimice complexe de natur organic-proteine coloidal solubile - elaborate de plante, animale i microorganisme, capabile s mreasc viteza reaciilor chimice ce se desfoar n sistemele biologice, fr s se consume n cursul lor. Sunt deci, o clas special de proteine dotate cu activitate catalitic; se mai numesc i biocatalizatori. Denumirea de enzime a fost dat de ctre Kuhne (1878) i provine de la expresia "en zima = n levur" (n 1. greac), pornind de la faptul c din drojdii s-au extras pentru prima dat enzime. Procese enzimatice, cum sunt fermentaia vinului, dospirea pinii, acidifierea laptelui etc. sunt cunoscute din cea mai ndeprtat antichitate. Dar cunotine sistematice n acest domeniu s-au obinut ncepnd cu identificarea primelor enzime: amilaza din mal (Kirchoff, 1814), amilaza salivar (Leuchs, 1831) i pepsina (Schwann, 1836). Ulterior, progrese importante s-au realizat prin lucrrile privind cataliza i biocataliza ale lui Berzelius i Liebig, prin studiile asupra cineticii ale lui Michaelis i Menten (1912), prin obinerea enzimelor n stare cristalizat (Sunner, 1926). Enzimologia, domeniu al biochimiei care se ocup cu studiul enzimelor, s-a dezvoltat exploziv pe baza unor cercetri ample privind structura enzimelor, mecanismele de reacie studiate la nivel electronic i cuantic, reglarea proceselor enzimatice n cadrul metabolismului intermediar. Ca urmare, enzimologia constituie studiul bazelor moleculare ale vieii. Prin aciunea lor catalitic, enzimele fac posibil, n condiii compatibile

Biochimia produselor alimentare cu viaa, realizarea unei ntregi serii de reacii chimice, care n vitro nu se pot realiza dect n condiii foarte dure, improprii vieii celulare. Astfel, hidroliza proteinelor pe cale chimic se realizeaz la 37C, numai n mediu puternic acid i ntr-un interval de timp foarte lung (3 luni); n organism, n stomac, aceast degradare are loc extrem de rapid i n mediu mai slab acid. Pentru a realiza "in vitro" tot att de repede aceast hidroliz sunt necesare o temperatur de 120- 140C i o mare aciditate, deci condiii absolut incompatibile cu viaa organismelor. n mod similar, arderea glucozei n organismele vii cu producerea apei, a dioxidului de carbon i a energiei se realizeaz prin intermediul enzimelor n condiii specifice vieii celulare. n absena enzimelor, aceleai transformri necesit temperaturi de 180-200C. Ca urmare, rolul enzimelor este fundamental n procesele vieii, iar studiul acestora apare astfel ca problem central a biochimiei. Conform definiiei lui Haldane, "enzima este un catalizator organic, solubil i coloidal produs de celula vie". Ca urmare, enzimele sunt prezente n toate celulele esuturilor, organelor. Organismele vii trebuie s fie capabile s-i sintetizeze singure enzimele de care au nevoie pentru desfurarea normal a activitii vitale. Biosinteza enzimelor este similar cu cea a proteinelor fiind dirijat de acizii nucleici i de substanele specifice din fiecare organism. Dei sinteza lor se face numai n interiorul organismului, enzimele i pot exercita aciunea lor atunci cnd sunt extrase din organism, i n afara acestuia. Numrul enzimelor este foarte mare i mereu se identific altele noi.. n principiu, se poate spune c pentru fiecare substan proprie organismului trebuie s existe cel puin o enzim care s catalizeze, fie reacia de formare a ei dintr-o substan inferioar sau superioar ca structur, fie transformarea ei. n multe cazuri enzima care particip la sinteza substanei este diferit de cea care efectueaz degradarea ei. Substana care este transformat printr-o reacie catalizat de o enzim se numete substrat. Natura i cantitatea de enzime variaz n funcie de genul organismului, de vrsta lui. Animalele sunt mai bine dotate din punct de vedere enzimatic dect plantele. Unele enzime sunt sintetizate de celul sub form inactiv -proenzimedar trec n stare activ cnd celula are nevoie; aceasta constituie o form de reglare deosebit de important pentru viaa celulei. n felul acesta se evit autodistrugerea unor esuturi, organe sau se pot evita o serie de tulburri cu consecine deosebit de grave pentru organism. Dup formarea lor, enzimele (sau proenzimele) sunt difuzate la locul lor din celula respectiv (intracelulare) sau sunt excretate (extracelulare) la locul unde i vor manifesta activitatea lor catalitic.

180

Enzime Enzimele intracelulare sunt acele enzime care sunt produse i i desfoar activitatea chiar n celulele n care sunt biosintetizate. Ele sunt legate puternic de structura celulei i nu pot fi extrase dect prin distrugerea acesteia pe cale mecanic (nghe-dezghe, mojarare cu nisip de cuar etc.). Extragerea se face cu ap, glicerin, soluii saline, meninndu-i activitatea ca i n celule. Enzimele intracelulare pot fi legate prin adsorbie i n acest caz se numesc bioenzime, iar cnd sunt legate profund de celule, de protoplasma celulei, prin legturi chimice, se numesc desmoenzime. Acestea se separ numai dup autoliza substanei celulare i nu prin distrugerea mecanic. Dup autoliz, enzimele se extrag cu ap, glicerin etc., pstrndu-i activitatea. Enzimele extracelulare sunt enzimele care, dei biosintezate n celule, sunt eliminate n lichidele din organism sau n mediile de cultur, exercitndu-i aciunea la acest nivel. Aceste enzime se extrag cu uurin de la locul de aciune, iar activitatea lor este deplin. n organism exist enzime fie independent de prezena substratului (enzime constitutive), fie enzime care sunt sintetizate n caz de nevoie i cnd substratul respectiv este prezent (enzime adaptive sau enzime inductibile). Sisteme enzimatice. Exist reacii catalizate de o singur enzim; n celul ns majoritatea cilor metabolice au un numr de etape intermediare, adic ntre substana iniial (A) ce urmeaz a fi transformat i produsul final (D) iau natere o serie de produi intermediari. Fiecare etap intermediar este catalizat de o anume enzim(E) iar reacia n total este catalizat de un sistem enzimatic:

ntr-un astfel de sistem nu toate enzimele au aceeai importan funcional; cele care au rolul principal se numesc enzime limitative sau enzime "cheie". Sistemul enzimatic este riguros coordonat, etapele se succed ntr-o ordine anumit n aa fel ca produsul unei reacii s serveasc ca substrat pentru etapa urmtoare. Aceast succesiune de reacii trebuie s fie nentrerupt deoarece blocarea uneia conduce la blocarea ntregului sistem. De asemenea, unii intermediari pot fi utilizai n alte ci metabolice. Este necesar deci o coordonare cantitativ pentru fiecare sistem enzimatic.

7.2. Structura enzimelor181

Biochimia produselor alimentare

7.2.1. Constituenii enzimelorToate enzimele sunt de natur proteic i au un nalt grad de structurare posednd o structur primar, imprimat de secvenializarea aminoacizilor n catena polipeptidic fundamental, o structur secundar, o structur teriar i o structur cuaternar, determinate de modul n care catenele polipeptidice se pot plia i asocia ntre ele. Numeroase enzime ns au o structur binar care const dintr-o component proteic, denumit apoenzim i una sau mai multe componente neproteice, denumite cofactori. Complexul apoenzim+cofactor este denumit holoenzim i este activ din punct de vedere catalitic. Prin ndeprtarea cofactorului, rmne componenta proteic inactiv n forma liber. n structura holoenzimei, cofactorul imprim specificitate de aciune, respectiv determin tipul i viteza reaciei catalizate, n timp ce apoenzima imprim specificitate de substrat, respectiv determin substana asupra creia acioneaz enzima. Apoenzima fiind de natur proteic, manifest proprietile generale ale proteinelor; este termolabil i nedializabil; stabilete legtura enzimei cu substratul; manifest grade diferite de afinitate pentru cofactor; este susceptibil de modificri conformaionale n anumite limite. Cofactorii enzimatici reprezint componente neproteice de natur chimic foarte diferit, care sunt indispensabili pentru manifestarea activitii catalitice a numeroase enzime. Dup natura chimic i modul lor de legare la apoenzim, cofactorii se clasific n: coenzime, grupri prostetice, ioni metalici. coenzimele sunt compui organici - majoritatea derivai de la vitamine care se ataeaz temporar la apoenzim prin legturi necovalente i care sunt uor disociabili de aceasta. Ele pot trece uor de la o apoenzim la alta putnd astfel participa la transformarea altor molecule de substrat dup terminarea unei anumite reacii. Dintre acestea fac parte: NAD+, NADP+, ATP, CTP, acidul lipoic etc.

gruprile prostetice sunt substane organice fIxate pe apoenzim i care disociaz greu deoarece sunt legate prin legturi covalente; dintre aceste grupri se pot meniona FAD, FMN, TPP, piridoxalfosfatul, hemul. Gruparea prostetic imprim mecanismul unor procese enzimatice ca: transportul de electroni, de grupri NH2, acetil etc. De exemplu, hemul coninnd ionul Fe2+ este o component a citocromilor (enzime ce transport electroni) puternic legat de apoenzim prin legturi chimice de tip covalent.

182

Enzime

ionii metalici sunt indispensabili pentru exercitarea funciei catalitice a unor enzime, participnd n calitate de cofactori sau de componente structurale ale acestora. Aceste enzime se numesc i metal-enzime iar printre ionii care ndeplinesc rol de cofactor se pot meniona: Mg2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+(3+), Mo2+. Unele enzime pot conine chiar doi ioni metalici.

7.2.2. Centrul activ al enzimein interaciunea dintre enzim i substratul su, enzima particip cu o poriune limitat din structura sa. Pe aceast poriune exist grupri reacionale capabile s atrag i s fixeze molecula substratului ntr-o poziie privilegiat i ntr-un loc strict determinat; ansamblul acestor grupri chimice i al ncrcrilor electrice constituie centrul activ al enzimei sau centrul catalitic. Astfel, centrul activ al unei enzime reprezint ansamblul regiunilor funcionale ale enzimei, respectiv ansamblul gruprilor chimice active care particip efectiv la reacia catalizat. n cazul enzimelor care nu necesit pentru activitatea lor catalitic prezena unui cofactor, acest centru activ este reprezentat de o secven de aminoacizi i este condiionat de configuraia tridimensional a moleculei. Eficacitatea centrului activ nu depinde numai de gruprile funcionale ce se combin cu substratul ci de integritatea configuraiei moleculei proteice care determin poziiile spaiale relative ale acestor grupri funcionale. Acest fapt subliniaz importana structurii teriare a proteinei pentru activitatea enzimatic. Pentru acest tip de enzime centrul activ coincide cu zona, denumit situs catalitic, unde se gsete secvena de aminoacizi implicai n activitatea catalitic. n cazul enzimelor care conin cofactori enzimatici, centrul activ include situsul catalitic i regiunea din molecul la care este ataat cofactorul (coenzima, metal), adic: centru activ = situs catalitic + cofactor

7.2.3. Organizarea structural a enzimelorn funcie de organizarea lor structural ca molecule proteice, enzimele se ncadreaz n urmtoarele grupe principale: enzime monomere, enzime oligomere, izoenzime. Enzimele monomere au o structur constituit dintr-un singur lan polipeptidic n care este inclus situsul catalitic. Sunt ntr-un numr restrns,

183

Biochimia produselor alimentare nu pot fi disociate n subuniti i posed mase moleculare relativ mici (13.000 - 35.000). Enzimele oligomere sunt agregate moleculare constituite din dou sau mai multe subuniti (protomeri) asociate ntr-o structur compact dotat cu proprieti catalitice. Au mase moleculare mari, cuprinse ntre 35.000 i cteva sute de mii. Marea majoritate a enzimelor care catalizeaz diferite reacii biochimice ale metabolismului sunt enzime oligomere. Izoenzimele reprezint forme moleculare multiple ale unei enzime care catalizeaz aceeai reacie, au originea n aceeai celul, esut sau lichid biologic, dar difer ca structur (configuraie spaial) i proprieti fizico-chimice (pH optim de aciune, cinetic de reacie, mobilitate electroforetic). Izoenzimele apar datorit diferenelor la nivelul structurilor cuaternare, respectiv combinrilor variate ale unor subuniti structurale de natur polipeptidic. De exemplu, lactat dehidrogenaza din muchi este un tetramer care are dou lanuri polipeptidice de tipul H i dou de tipul M. Cuplarea lanurilor este diferit, ceea ce d natere la 5 forme izomere ale acestei enzime: H H H H; H H H M; H H M M; H M M M; M M M M.

7.3. Specificitatea enzimelorEnzimele difer de catalizatorii neproteici prin una din cele mai remarcabile i caracteristice proprieti ale lor i anume specificitatea. Se nelege prin specificitatea unei enzime proprietatea sa de a aciona preferenial numai asupra unui anumit substrat sau grup de substrate cu caractere chimice comune. Specificitatea enzimatic se poate manifesta la nivelul tipului de reacie catalizat de enzim i la nivelul substratului. Specificitatea de reacie (de aciune) se manifest asupra unui singur substrat de ctre mai multe enzime, fiecare cataliznd o anumit reacie. De exemplu, un - aminoacid poate constitui substratul de reacie pentru mai multe enzime care catalizeaz reacii diferite - ns specifice - de transformare a sa n produi de reacie diferii:

184

Enzime

Fiecare enzim manifest o anumit specificitate de aciune, cataliznd un anumit tip de reacie biochimic. Specificitatea de substrat. Aceasta se refer la activitatea pe care o manifest enzimele fa de anumite substrate. Gradul specificitii de substrat variaz foarte mult. Se deosebesc astfel: specificitate absolut. Unele enzime nu acioneaz dect asupra unui singur substrat fiind inactive fa de alte substane cu structur asemntoare; de exemplu ureaza hidrolizeaz numai ureea, nu i derivatul su metilat:

Arginaza numai arginina:

H2N -C-NH2 ONH2 C NH NH CH2 3 CH NH2 COOH arginin

ureaza H2O

CO2

+ 2 NH3

hidrolizeaz

NH2 arginaz H2O CH2 3 CH NH2 COOH ornitin

NH2 C O + NH2 uree

specificitatea de grup o au enzimele care acioneaz asupra unei serii de substane apropiate ca structur chimic. Astfel, pepsina nu atac dect proteinele, dar toate tipurile de proteine, amilaza atac amidonul, dextrinele, glicogenul; hexokinaza catalizeaz fosforilarea unei serii de hexoze n prezen de ATP. Stereospecificitatea. Unele enzime au stereospecificitate fa de izomeria

185

Biochimia produselor alimentare cis-trans. Astfel, fumaraza acioneaz numai asupra acidului fumaric i este inactiv asupra izomerului su cis, acidul maleic:

HOOC C=C H acid fumaric

H fumaraza COOH H2O

HOOC C C

H

H H OH COOH

acid malic n cazul substanelor optic active, enzimele manifest o aciune specific fa de o anumit form stereoizomer a substratului; de exemplu, L-aminoacidoxidazele nu recunosc dect L-aminoacizii iar pentru transformarea Daminoacizilor este necesar prezena D -aminoacid - oxidazelor.Unele enzime fac distincie ntre conformaiile i din legturile glicozidice. Maltaza, de exemplu, hidrolizeaz numai legtura (1 4) glicozidic din molecula de maltoz, i nu atac legtura (1 4) glicozidic din celobioz.

7.4. Mecanismul de aciune al enzimelorMecanismul general de aciune al enzimelor este cel al tuturor catalizatorilor i anume: - intervin numai n acele reacii care sunt posibile din punct de vedere termodinamic; - nu modific echilibrul unei reacii, ci fac ca acest echilibru s fie atins mai repede; - cantitatea lor rmne neschimbat la sfritul reaciei. Enzimele au i ele aceste proprieti, la care se mai adaug urmtoarele: - natura lor proteic le confer un grad mare de specificitate; - activitatea enzimatic este supus unui control i acest fapt are mare importan pentru reglarea metabolismului celular; - micoreaz energia de activare n reacia respectiv ceea ce determin creterea vitezei acesteia. n general, pentru ca o reacie s aib loc cu o vitez apreciabil, moleculele reactanilor trebuie s fie activate. Energia de activare poate fi furnizat de temperatur ns, n cazul organismelor vii, utilitatea ei este limitat. Enzima are capacitatea de a cobor nivelul energetic care condiioneaz reacia, ceea ce permite moleculelor s reacioneze cu o vitez apreciabil n condiii n care n absena enzimei nu ar reaciona dect cu o vitez extrem de mic.

186

Enzime Deci, enzimele scad nivelul "energiei de activare" necesar ca o reacie s poat avea loc. Aceast scdere a energiei de activare se datoreaz formrii unui complex activat ntre enzim i substrat (ES) care apoi se transform cu vitez mare n produi finali de reacie i enzim, ultima fiind capabil s se combine cu o alt molecul de substrat. Ipoteza formrii complexului intermediar ES a K3 K1 fost emis pentru prima dat de Michaelis i E-S E+S E + P Menten. K2 Reacia de formare a complexului enzimsubstrat este reversibil, constantele de echilibru fiind K1 i K2. La formarea complexului activat, substratul se fixeaz pe centrul catalitic al enzimei. ntre centrul catalitic i molecula substratului exist complementariti conformaionale i chimice (ipoteza "lact-cheie") care permit asamblarea lor (fig. 7.1).

Fig. 7.1. Schema modului de aciune a enzimei Fixarea substratului pe enzim i imprim acestuia o stare de tensiune molecular care are drept consecin labilizarea lui i facilitarea reaciei biochimice. Deci rolul complexului enzim-substrat n procesele de cataliz enzimatic este de a micora energia de activare a reaciei. Astfel, se consider c un substrat S se poate transforma n compusul P att direct, fr enzim (1), ct i prin cataliz enzimatic (2). Energia medie a moleculelor substratului este Er. Prin ocuri se poate ajunge la energia El necesar pentru ca S s dobndeasc o stare activat S l care s-i permit trecerea n P. Energia maxim El necesar transformrii este energia de activare n absena enzimei. n prezena enzimei ns, prin formarea complexului enzim-substrat este nevoie de o energie de activare mult mai mic E2 pentru transformarea substratului. Energia eliberat n ambele reacii este ns aceeai, E (fig. 7.2).

187

Biochimia produselor alimentare

Fig. 7.2. Nivelele de energie ale moleculelor n cursul unei reacii fr enzim (1) i cu enzim (2)

7.5. Cinetica reaciilor enzimaticeStudiul cineticii enzimatice este deosebit de important deoarece permite cunoaterea mecanismelor reaciilor enzimatice, nelegerea i clasificarea proceselor metabolice i importana lor fiziologic pentru organism. Msurarea activitii enzimatice se reduce la 'studiul cineticii sau vitezei reaciei catalizate.

7.5.1. Viteza de reacieEste caracteristica esenial a unei enzime, reprezint cantitatea de substrat (S) transformat n unitatea de timp (t) i se exprim prin relaia:

v=

dS dt

Dac se reprezint grafic variaia cantitii de substrat transformat (sau de produs obinut) n unitate a de timp, se obine o curb format dintr-o parte rectilinie (n care viteza este constant) i una curb n care

188

Enzime viteza scade (datorit faptului c rmne o cantitate tot mai mic de substrat netransformat). Pentru studiul cineticii se ia n considerare numai prima parte a curbei care indic viteza iniial a reaciei i ea este definit prin panta maxim a curbei (fig. 7.3): vo = tgo. Pentru un timp t1, v1 = tg1.

7.5.2. Factorii care influeneaz cinetica reaciilor enzimaticeViteza de reacie, respectiv cinetica reaciilor enzimatice este dependent de o serie de factori, i anume: concentraia enzimei, concentraia substratului, temperatur, pH, efectorii enzimatici. a. Concentraia enzimei n condiiile n care concentraia substratului este constant, viteza de reacie iniial (vo) este direct proporional cu concentraii crescnde ale enzimei ntre anumite limite; la concentraii crescute de enzim viteza de reacie rmne constant ca urmare a transformrii ntregii cantiti de substrat (fig. 7.4).

b. Concentraia substratului Meninnd constant cantitatea de enzim i mrind concentraia substratului are loc o cretere a vitezei de reacie pn la o limit (Vmax). Crescnd n continuare concentraia substratului viteza de reacie rmne constant, ceea ce denot c la concentraii mari de substrat, toate situsurile catalitice ale moleculelor de enzim sunt complet saturate cu substrat; deci nu mai exist enzim disponibil (fig. 7.5). Dependena vitezei unei reacii enzimatice de concentraia substratului a fost studiat iniial de Michaelis i Menten porninduse de la ecuaia general:

189

Biochimia produselor alimentare

E+S

K1 K2

E-S

K3

E+P

Aplicnd legea maselor i fcnd unele transformri se ajunge la ecuaia lui Michaelis - Menten, care se reprezint grafic printr-o hiperbol:

v=

Vmax [ S] K m + [ S]

n care: v - este viteza reaciei la timpul t; Vmax - viteza maxim de reacie corespunztoare saturrii enzimei cu substrat; [S] - concentraia substratului; Km - constanta Michaelis (moli/l). Aceast ecuaie reprezint expresia matematic care definete relaia cantitativ dintre viteza de reacie enzimatic i concentraia substratului. Din curb se observ c la o valoare a vitezei de reacie (v) egal cu jumtate din valoarea vitezei maxime de reacie (v = Vmax/2) corespunde, pe abscis, o valoare, a concentraiei substratului notat K m care este tocmai constanta Michaelis. Deci, constanta Michaelis (Km) reprezint acea concentraie de substrat pentru care viteza de reacie corespunde la jumtate din viteza maxim de reacie. Aadar, pentru v= Vmax/2, Km = [S]. Constanta Michaelis (Km) reprezint un indicator al afinitii enzimei pentru substrat; cu ct Km are o valoare mai mare, cu att afinitatea enzimei pentru substrat este mai sczut i invers. Astfel, Km constituie un parametru cinetic operaional care furnizeaz indicaii asupra cineticii unei reacii enzimatice, respectiv a comportrii enzimei n raport cu substratul su de reacie. Msurarea direct a valorii algebrice Vmax i deci calculul lui Km implic concentraii mari de substrat pentru a atinge condiii de saturare ceea ce este dificil n experimentele de laborator. Aceast dificultate poate fi evitat prin reprezentarea liniar a ecuaiei Michaelis-Menten, care permite extrapolarea cu uurin a valorilor Vmax i Km plecnd de la vitezele reaciilor msurate n condiii de concentraii de substrat inferioare saturaiei. Ecuaia Michaelis-Menten poate fi inversat i Vmax descompus n factori n modul urmtor:

190

Enzime

v=

Vmax [ S] K m + [ S]

1 Km 1 [S] = + v Vmax [ S] Vmax [ S]

invers

1 K m + [ S] = v Vmax [ S]

sau

prin simplificare

1 Km 1 1 = + v Vmax [ S] Vmax y = a x + b unde

relaia este o dreapt care nu trece

prin origine, de forma

y=

1 v

x=i

1 [S] . y= 1 v

Dac valoarea este reprezentat n funcie de x

1 sau [ S] , intersecia acesteidrepte, b, este egal cu

1 Vmax , i panta, a, este Km V egal cu max .Valoarea negativ a interseciei pe axa x poate fi determinat fcnd y

x== 0. n acest caz se obine:

b 1 = a Km .

O astfel de reprezentare (fig. 7.6), denumit Lineweaver-Burk permite estimarea lui Km utiliznd fie panta i punctul de intersecie a axei y, fie punctul de intersecie a axei x. Valoarea lui Km se exprim n moli/l. c. Influena temperaturii La fel ca i n cazul reaciilor chimice, viteza de reacie enzimatic crete cu mrirea temperaturii, dar numai n anumite limite. Urmrindu-se variaia vitezei de reacie n funcie de temperatur i reprezentnd grafic se obine o curb (fig. 7.7) din care se observa ca pentru nceput viteza reaciei crete pana la o anumit valoare denumit temperatur optim (to). Temperatura optim pentru cele mai multe enzime este de 30-40C. Mrind n continuare temperatura se nregistreaz o diminuare

191

Biochimia produselor alimentare progresiva a vitezei de reacie pn la o anulare a sa care se produce la o anumit temperatur, proprie fiecrei enzime i care se numete temperatur de inactivare (ti). Diminuarea activitii enzimei pn la anularea ei se explic prin denaturarea termic a enzimei, al crei edificiu molecular este afectat. Deci, enzimele sunt termolabile; nclzite dincolo de o anumit temperatur i pierd ireversibil activitatea. Majoritatea enzimelor sunt inactive printr-o nclzire la temperaturi n jur de 80C, multe din ele prin nclzire chiar peste 55C, nsa sunt i enzime care rezist la temperaturi de peste 100C. Temperatura de inactivare ca i cea optim este influenata de mai muli factori. Astfel, enzimele pure sunt mai sensibile la inactivarea termic dect preparatele impure care conin o serie de substane ce exercit o aciune de protecie a moleculei de enzim. De asemenea, n stare uscat enzimele rezist mai bine la temperaturi ridicate. Astfel se explic de ce, malul folosit la fabricarea berii, dei a suferit temperaturi ridicate in ultima faz a operaiei de uscare, mai conine o cantitate apreciabil de enzime deosebit de active. La temperaturi sczute, n general, enzimele au o activitate foarte lent sau chiar nul, dar prin ridicarea temperaturii ele devin din nou active. Multe din ele rezist chiar la temperatura aerului lichid (-191C). O dovad a faptului c frigul nu inhib complet activitatea enzimelor sunt transformrile calitative (gust, miros, culoare) pe care le sufer alimentele congelate n timpul pstrrii lor n aceast stare. d. Influena pH-ului Toate reaciile enzimatice sunt puternic influenate de pH-ul mediului. Reacia are o vitez maxim pentru o anumit valoare a pH-ului sau pentru un interval foarte strns de pH, denumit pH optim. Abateri de la aceste valori produc o scdere brusc a vitezei de reacie. Reprezentnd grafic variaiile vitezei n funcie de pH se obine o curb n form de clopot ngust (fig. 7.8). Valoarea pH-ului optim al diverselor enzime coincide n general cu pH-ul lichidelor din organism unde ele i exercit aciunea.

192

Enzime De exemplu, pH-ul optim al pepsinei este 1,5-2,5 realizat n sucul gastric de acidul clorhidric; al tripsinei este 8-11, identic cu pH-ul sucului pancreatic. Majoritatea enzimelor vegetale acioneaz bine la un pH n jur de 6-7. De asemenea, pH-ul optim de activitate al unei enzime are o valoare caracteristic numai n condiii bine precizate. Aceste valori pot suferi variaii sub influena a numeroi factori: - cu temperatura: la 40C amilaza din mal are pH-ul optim 4,4 iar la 60C - pH-ul optim este de 6,6; - cu substratul: maltaza are pH-ul optim pentru maltoz 6,0 iar pentru metilglucoz 6,7; - cu originea enzimei: amilaza din mal are pH-ul optim de aciune 5,2; cea din pancreas 7,0; iar cea din ficat 6,0. La majoritatea enzimelor intervalul de pH n interiorul cruia i manifest aciunea se ntinde pe cteva uniti de pH, de obicei 6-8. Abaterile de la acest interval conduc la imposibilitatea enzimei de a-i mai exercita aciunea. e. Influena radiaiilor Activitatea enzimelor mai poate fi influenat de radiaii. Lumina vizibil nu are influen asupra activitii enzimelor dect n prezen de substane sensibilizante. Radiaiile ultraviolete (UV) fiind absorbite de substanele proteice n domeniul 260-280nm datorit resturilor de aminoacizi aromatici din molecule pot s produc ruperea unor legturi care determin denaturarea proteinelor i deci inactivarea enzimelor. Radiaiile ionizante (razele X, radiaiile radioactive) n doze mici acioneaz indirect asupra enzimelor datorit substanelor oxidante care iau natere prin descompunerea apei i a oxigenului dizolvat n ap. Sunt sensibile la aceste radiaii enzimele care conin grupe SH. Prin introducerea unor antioxidani (glutation redus, cistein, acid ascorbic) n mediul de reacie, se pot proteja gruprile -SH din situsul catalitic al unor enzime. f. Efectorii enzimatici Pe lng factorii artai anterior, activitatea enzimelor este influenat i de unele substane numite efectori biochimici care pot mri sau scdea viteza de reacie enzimatic, deci pot influena pozitiv sau negativ activitatea catalitic a unei enzime. Substanele capabile s mreasc viteza unei reacii enzimatice se numesc activatori enzimatici, n timp ce substanele ce micoreaz viteza unei reacii enzimatice se numesc inhibitori enzimatici.

Activatorii enzimatici sunt compui de natur organic sau anorganic care n concentraie mic sunt necesari pentru a mri viteza unire reacii

193

Biochimia produselor alimentare enzimatice ntruct ei aduc enzima ntr-o form activ. Activatorii enzimatici i exercit aciunea pe ci diferite n funcie de natura lor. Astfel: - Ionii metalici mono- sau bivaleni (K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, etc.), activeaz unele enzime prin legarea cu acestea. De exemplu, fosfotransferazele sunt activate de ionii Mg2+ sau K+ (i inhibate de Ca2+ sau Na+). - Activatori ai unor proenzime acioneaz prin nlturarea unor fragmente din molecula inactiv a unor enzime, transformndu-le n enzim activ datorit demascrii situsului catalitic. De exemplu, enterokinaza din intestin, desprinde 6 aminoacizi din molecula inactiv de tripsinogen secretat de pancreas i o transform n tripsin activ. Aceti activatori se mai numesc i kinaze. - Substane protectoare. Acestea au numai indirect rolul de activator. Astfel, substanele reductoare care posed grupri tiolice -SH (cisteina, glutationul) sunt ageni complexani care au proprietatea de a bloca ionii metalelor grele, evitnd astfel inhibarea gruprilor SH din situsul catalitic al enzimei sau a celor ce au rol n meninerea conformaiei enzimei.

Inhibitorii enzimatici. Activitatea enzimatic poate fi diminuat de o mare varietate de compui. Clasificarea lor este dificil datorit compoziiei chimice foarte diferite precum i datorit modului lor de aciune la fel de variat. Astfel, multe enzime sunt inactivate de metale grele (mercur, plumb, cupru) sau de unele metaloide (arsen). Exist i inhibitori de natur proteic. Astfel, n leguminoasele uscate exist un inhibitor al tripsinei care sub aspect chimic este globulin.n general, inhibitorii scad activitatea unei enzime prin dou mecanisme majore: - se combin cu enzima i o inactiveaz; - se combin cu substratul i l fac impropriu pentru transformare. Se deosebesc mai multe tipuri de inhibiie enzimatic: - Inhibiie competitiv. Acest tip de inhibiie este realizat de substanele care au o structur asemntoare cu a substratului (fig. 7.9).

194

Enzime

Fig. 7.9. Inhibiie competitiv n acest caz centrul catalitic (situsul catalitic) al enzimei se poate combina att cu substratul ct i cu inhibitorul competitiv: +I EI (inactiv) E+P E+ -S

ES (activ)

E+P

Reaciile fiind reversibile, prin mrirea concentraiei sub-stratului exist

posibilitatea de a scoate enzima din combinaia cu inhibitorul, nct la o concentraie adecvat de substrat influena inhibitorului este anulat (fig. 7.10). Reprezentarea Lineweaver-Burk a inhibiiei competitive (fig. 7.11) ilustreaz c la o concentraie infinit de mare de substrat (1/[S]=0), viteza este aceeai ca i n absena inhibitorului, dar afinitatea enzimei este sczut. Un exemplu de inhibiie

competitiv l constituie cazul reaciei de

195

Biochimia produselor alimentare dehidrogenare a acidului succinic la acid fumaric, catalizat succinatdehidrogenaz. Acidul malic, diferind de acidul succinic numai prin existena unui hidroxil n locul unui hidrogen la una din gruprile metilenice, poate s se lege de centrul activ al succinatdehidrogenazei. Fraciunea de succinat-dehidrogenaz combinat cu acidul malic poate fi recuperat prin simpla cretere a concentraiei de substrat. - Inhibiie necompetitiv. Inhibitorii necompetitivi se fixeaz pe enzim pe alt loc dect centrul activ (nu exist competiie cu substratul), dar centrii activi ai enzimei i reduc capacitatea de a reaciona cu substratul datorit unui fenomen de mpiedicare steric.+I -

de

EI E - IS E+P ES

E+S -

E+P Inhibitorii necompetitivi diminueaz viteza maxim. Deoarece I i S se pot fixa n locuri diferite, se poate forma att EI ct i EIS. Descompunerea lui EIS n produse de reacie va fi mai lent dect a lui ES, reacia este mai nceat, dar nu oprit.n cazul inhibiiei necompetitive mrirea concentraiei

substratului nu suprim inhibarea activitii enzimatice (fig. 7.12). Reprezentarea liniar (fig. 7.13) ilustreaz c n inhibiia necompetitiv valoarea lui Km rmne neschimbat. Astfel de inhibitori necompetitivi sunt cianurile care se combin cu unele metale care sunt necesare pentru activitatea enzimei. Acidul etilendiamino-tetraacetic (EDTA) leag Mg2+ i ali cationi

196

Enzime bivaleni inhibnd astfel ne-competitiv unele enzime. Unele metale grele (Hg, Pb, Ag, Cu) sunt, de asemenea, inhibitori deoarece se combin cu gruprile SH ale enzimei (din afara situsului catalitic) formnd mercaptide: E - SH + Ag+ E - S - Ag + H+ - Inhibiie incompetitiv (mixt). n acest caz inhibitorul se combin numai cu complexul enzim substrat: ES + I ESI un exemplu este cel al inhibrii citocromoxidazei de ctre azid. - Inhibiie prin exces de substrat. Exist unele reacii enzimatice n care excesul de substrat duce la formarea unui complex de forma E-S-S care este mai puin activ sau chiar inactiv. Reprezentnd grafic viteza de reacie n funcie de concentraia substratului se obine o curb n form de clopot (fig. 7.14). Un astfel de exemplu este inhibarea

fructozo-1,6-difosfatazei 1,6-difosfat.

de ctre fructozo-

- Inhibitori enzimatici de origine biologic. Organismele pot s produc substane care s inhibe aciunea enzimelor. Rolul acestor inhibitori naturali este fie de a apra organismul de aciunea duntoare a unei enzime strine de organism, fie de a regla anumite procese enzimatice n cazul enzimelor proprii. Astfel, paraziii intestinali din genul Ascaris nu sunt atacai de proteazele tubului digestiv (pepsin, tripsin). Ei produc substane care inhib aciunea acestor enzime. Pentru tripsin sunt i ali inhibitori naturali. De exemplu un inhibitor tripsinic se gsete n pancreas, n plasma sngelui, n albuul de ou, n colostru i n leguminoasele uscate (soia, fasole, mazre, etc.).

7.6. Reglarea activitii enzimaticeS-a artat c reaciile catalizate de enzime au loc cu viteze anumite, determinate de concentraia lor, a substratului, de pH, temperatur etc. Aceste reacii nu sunt independente unele de altele, ci sunt grupate, se succed formnd ci metabolice care funcioneaz simultan i n mod

197

Biochimia produselor alimentare coordonat att calitativ ct i cantitativ. La nivel celular, activitatea enzimelor, de care depind procesele metabolice, este sub un control permanent asigurat de mai multe mecanisme de reglare: A Sinteza enzimelor (biosinteza proteinelor- enzime). B Mediul intracelular. La nivelul mediului intracelular pot interveni o serie de factori care s regleze activitatea enzimelor. Astfel: a) pH-ul i electroliii pot avea efect inhibitor sau activator. Ionii de Ca2+ exercit un rol regulator al glicolizei. Astfel, concentraii mari inhib aciunea piruvatkinazei conducnd la acumularea de fosfoenolpiruvat. b) hormonii. Organismele pluricelulare sunt reglate lor de hormoni. Acetia acioneaz asupra activitii efectori enzimatici) sau asupra sintezei lor. Astfel, mrete de 25 ori activitatea -cetoglutarat-transaminazei; biosinteza enzimelor gluconeogenezei. n funcionarea enzimelor (ca hidrocortizonul insulina inhib

c) concentraia intracelular a cofactorilor, (NAD+, NADP+, ATP, etc.). Spre exemplu, n metabolismul acidului piruvic calea pe care acesta o va urma este n funcie de concentraia de NAD+ care depinde de coninutul n O2. Dac n celul exist O2 disponibil, NAD+ va fi produs n cantitate suficient i ca urmare, acidul piruvic va fi metabolizat prin ciclul acidului citric (ciclul lui Krebs). Dac exist puin O2, NADH + H+ nu va fi oxidat de NAD +i n acest caz acidul piruvic este redus la acid lactic. C Membranele celulare. Dup cum tie, pentru ca o molecul a unei substane s fie metabolizat de celul, ea trebuie s ptrund n celul. Pentru acest scop exist un sistem specific de transport realizat de permeaze care ele nsele sunt enzime. De asemenea, membranele intracelulare (lizozomale, mitocondriale, etc.) a cror permeabilitate pentru diversele substraturi, cofactori, enzima este diferit, permit funcionarea normal a celulei. D Reglarea allosteric. Mecanismul cel mai complex al coordonrii metabolice este reglarea allosteric n care sunt implicate enzimele allosterice. Prin structura i funciile lor, aceste enzime intervin n reglarea i controlul diferitelor secvene de reacii ale unor ci metabolice, constituind astfel un fenomen natural, necesar n desfurarea proceselor biochimice. Enzimele allosterice au primit aceast denumire datorit faptului c efectorii (activatori sau inhibitori) care influeneaz activitatea lor i care se numesc efectori allosterici se aeaz pe enzim n alt loc loc (situs) allosterioc dect centrul activ.

198

Enzime

Fig. 7.15. Modul de aciune al unui activator allosteric

Efectorii allosterici modific conformaia enzimei i deci a centrului catalitic fcndu-l s devin mai apt (activator) sau mai puin apt (inhibitor) de a se combina cu substratul. Modificarea structural a enzimei sub influena efectorului allosteric se numete tranziie allosteric.

Fig. 7.16. Modul de aciune al unui inhibitor allosteric Enzimele allosterice sunt constituite din mai multe subuniti sunt deci oligomere. Efectorii allosterici, dar nu substratul, le confer o rezisten mrit la denaturarea termic. Ele posed mai multe locuri (situsuri) de legare (cel puin dou), avnd un centru activ (situs catalitic) la care se leag substratul i care este responsabil de activitatea catalitic propriuzis i un situs allosteric la care se leag selectiv i reversibil efectorii enzimatici. Enzimele allosterice manifest o comportare cinetic diferit de cea stabilit de Michaelis-Menten; relaia dintre viteza reaciei i

199

Biochimia produselor alimentare concentraia substratului indic pentru aceste enzime o curb cu un aspect sigmoid (fig. 7.18). Aceasta se traduce printr-un efect cooperativ, adic fixarea primei molecule de substrat faciliteaz fixarea urmtoarei molecule de substrat; se consider astfel c fiecare molecul de enzim se combin nu cu o singur molecul de substrat ci cu mai multe i acest lucru se explic prin natura oligomer a enzimelor allosterice (existena mai multor lanuri polipeptidice i deci a mai multor situsuri catalitice). n ansamblul proceselor de reglare biochimic a activitii metabolice a organismelor, mecanismul de reglare prin tranziii allosterice deine un rol dominant. Reglarea allosteric este o reglare tip feed-back, care se mai numete reglare prin retroinhibiie sau prin produs final. Reglarea feed-back reprezint un proces specific de reglare prin care produsul final (P) al unei secvene constituit din mai multe reacii biochimice nlnuite i catalizate de enzime diferite acioneaz asupra primei enzime din sistem pe care o inhib: Inhibitie feed-back

A

E1

B

E2

C

E3

D

E4

P

n aceast secven prima enzim (E1) este o enzim allosteric. Inhibarea ei de ctre produsul final demonstreaz c acesta (P) se comport ca un efector allosteric; n consecin el se fixeaz la situsul allosteric al enzimei allosterice (E1) care astfel este supus unei tranziii allosterice ce are drept efect o diminuare sau anulare temporar a activitii catalitice. n felul acesta, enzima E1 asigur reglarea activitii ntregului ir de reacii, n sensul c inhibarea activitii ei nu mai permite fucionarea succesiv a celorlalte enzime deoarece substraturile acestora (B, C, D) nu se mai produc.

200

Enzime n concluzie, reglarea allosteric se manifest prin efecte de inhibare sau de activare a activitilor enzimatice aferente unui set de reacii caracteristice diferitelor ci metabolice, controlnd astfel dinamica biochimic a metabolismului celular.

7.7. Preparate enzimaticeActivitatea catalitic a enzimelor, extrem de important din punct de vedere fiziologic, prezint i o deosebit importan practic. O serie de industrii care prelucreaz materii prime de origine vegetal sau animal au de a face n procesele lor tehnologice cu reacii catalizate de enzime care sunt proprii acestor materii prime sau sunt elaborate de microorganismele ce se dezvolt n /pe ele. Reacii enzimatice similare pot avea loc ns i cu enzime exogene sau cu sisteme enzimatice extrase din diverse surse bogate n enzime i introduse apoi n procesele tehnologice n scopul realizrii unor transformri dorite. Aceste enzime sau sisteme enzimatice izolate din mediile n care au fost elaborate se numesc preparate enzimatice. Ele se caracterizeaz printr-o puritate mai mic sau mai mare n funcie de cantitatea i tipul compuilor, provenii din sursa enzimatic, ce le nsoesc. Cu alte cuvinte, preparatele enzimatice pot fi mai mult sau mai puin pure (purificate). n vederea obinerii preparatelor enzimatice trebuie ales un material biologic bogat n enzime cu o nalt activitate catalitic; materialul trebuie s fie ieftin, uor accesibil i s se prelucreze uor. Materiile prime folosite la obinerea preparatelor enzimatice pot fi de natur vegetal, animal sau microbian. La plante concentraii mari de enzime se ntlnesc n semine, n boabele de cereale germinate i negerminate, n fructe, rdcini, sev, frunze. La animale enzimele se gsesc n toate celulele, ns concentraii mari de anumite enzime se gsesc localizate n diferite organe ca: ficat, rinichi, inim, muchi. Acestea au ns organe i esuturi specializate n producerea de enzime, aa cum sunt glandele salivare, mucoasa stomacului, pancreasul, mucoasa intestinal. O surs foarte important de enzime pentru obinerea preparatelor enzimatice o constituie microorganismele: bacteriile, drojdiile i mucegaiurile. Acestea prezint avantajul c se pot obine cu uurin n cantiti mari prin nmulirea n instalaii speciale pe medii de cultur ieftine, de obicei subproduse ale industriei alimentare(tre de gru, extract de porumb, melas, roturi de soia i de floarea soarelui, etc.). de asemenea, ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt n comparaiei cu ciclul de dezvoltare al animalelor i plantelor, iar

201

Biochimia produselor alimentare producia lor de enzime poate fi mult mrit prin selectarea i utilizarea de tulpini i mutante nalt productive i prin utilizarea unor condiii optime de cultivare. Eliberarea enzimelor din celule. Procesul de extracie a enzimelor din materiile prime enzimatice este precedat ntotdeauna, cu excepia enzimelor extracelulare elaborate de microorganisme, de operaia de dezintegrare a celulelor pentru eliberarea enzimelor. Enzimele extracelulare secretate de microorganisme n timpul dezvoltrii lor se gsesc n cea mai mare parte n mediile de cultur lichide sau solide i numai o mic parte se mai afl n interiorul celulelor n momentul opririi procesului de nmulire. Ca urmare,lichidul de cultur sau mediul solid constituie deja preparate enzimatice brute. Pentru eliberarea enzimelor intracelulare este nevoie de distrugerea membranelor celulare. In cazul esuturilor animale se folosesc maini de mrunit sau omogenizatoare. Pentru mrunirea organelor i esuturilor vegetale se folosesc mori cu valuri sau cu ciocane. Ruperea membranelor celulare ale unor microorganisme este o operaie mult mai dificil i poate fi realizat cu ajutorul unor ageni mecanici (mojarare n prezena nisipului de cuar, a sticlei pisate sau agitarea suspensiei de celule n prezena unor abrazivi), ageni fizici (ultrasonare, nghe i dezghe repetat), ageni chimici (detergeni, solveni organici) sau biochimici (enzime). Extracia enzimelor. Dup dezintegrarea celulelor, urmeaz operaia de extracie a lor care const n amestecarea materialului cu solveni care dizolv enzimele i apoi n separarea soluiei de enzime de toate particulele n suspensie. Solubilizarea se realizeaz prin tratarea materialului cu ap sau soluii diluate de sruri, n funcie de solubilitatea enzimei. Molaritatea i pH-ul mediului de extracie, precum i timpul necesar unei extracii optime se stabilesc experimental. Amestecul de material i solvent este centrifugat iar supernatantul reprezint extractul enzimatic brut care poate fi utilizat ca atare, dup concentrare sau dup uscare sau este supus operaiei de purificare. Purificarea enzimelor din extracte. n extracte, enzimele se gsesc alturi de numeroase substane care s-au solubilizat n acelai timp n solvenii de extracie folosii. Deoarece substanele nsoitoare ale enzimei pot influena utilizarea i activitatea preparatelor enzimatice este necesar s se procedeze la purificarea enzimelor. n general, metodele de purificare se refer fie la ndeprtarea impuritilor din extract, fie la ndeprtarea enzimei din extract prin precipitare, absorbie sau extracie. Moleculele mici de impuriti pot fi ndeprtate din extract printr-o simpl dializ fa de ap sau fa de o soluie tampon. Moleculele cu mase moleculare mai mari, (proteinele) sunt separate prin precipitri fracionate cu sruri anorganice sau cu solveni organici, prin cromatografiere pe site moleculare (Sephadex), schimbtori de ioni (DEAE celuloz, CM-celuloz, etc.), absorbani (hidroxilapatita).

202

Enzime Dup aceast operaie se obin preparate enzimatice parial purificate. Cristalizarea. Cnd preparatul enzimatic a fost adus ntr-o stare avansat de puritate este posibil cristalizarea lui. Cea mai uzual metod de cristalizare folosete soluii saturate de sulfat de amoniu. Pentru aprecierea puritii preparatelor enzimatice se utilizeaz curbele de solubilitate care stabilesc variaia cantitii de enzim solubilizat n funcie de cantitatea de enzim introdus n soluie. Preparate enzimatice imobilizate. n scopul utilizrii repetate a unei enzime i pentru desfurarea n instalaii continui sau semicontinui a reaciilor enzimatice, n practica industrial au cptat o larg utilizare n ultimul timp preparatele enzimatice imobilizate. Imobilizarea enzimelor const n legarea sau fixarea unei enzime sau a unui sistem enzimatic de un suport insolubil n ap, cu pstrarea proprietilor catalitice. Suporturile sau matricele utilizate n imobilizarea enzimelor pot fi de natur anorganic: silice coloidal, perle de sticl cu grad de porozitate controlat, oxizi metalici (alumina, oxid de zirconiu etc.) i de natur organic: celuloz i derivaii acesteia, agaroz, amidon, dextran, colagen, poliacrilamida, acid metacrilic etc. Metodele de imobilizare pot fi fizice sau chimice. Procedeele fizice se bazeaz pe imobilizarea enzimelor prin intermediul legturilor fizice: interaciuni electrostatice, legturi ionice, de hidrogen. Procedeele chimice de imobilizare a enzimelor constau n formarea de legturi covalente sau parial covalente ntre diferite grupri funcionale care nu sunt eseniale pentru manifestarea activitii catalitice i un suport activat chimic, insolubil n ap. Prin legarea fizic se obin preparate imobilizate sub form de: - enzim absorbit pe un suport insolubil n ap (celuloz, sticl, schimbtori de ioni, crbune); - enzim inclus n structuri macromoleculare formate prin polimerizarea unor materiale n prezena moleculelor de enzim; se formeaz o matrice de polimer n care sunt incluse moleculele de enzim; - microcapsule din membrane semipermeabile n care enzima este ncapsulat; - celule de ultrafiltrare care conin enzim imobilizat. n legarea chimic a enzimelor de suport, preparatul enzimatic rezult prin copolimerizarea enzimei cu un monomer i legarea ncruciat (cross-linking) sau reticular intra- i inter- molecular a enzimelor legate de un suport cu un reactiv multifuncional. Imobilizarea enzimelor pe un suport anorganic sau organic provoac schimbri n comportamentul acestora i n cinetica reaciilor: se

203

Biochimia produselor alimentare mrete stabilitatea enzimei, se schimb afinitatea enzimei fa de substrat. Preparatele enzimatice imobilizate prezint o serie de avantaje: - utilizarea repetat a enzimei. Cu aceeai cantitate de enzim se poate prelucra o cantitate mai mare de substrat; - utilizarea unor instalaii cu funcionare continu care permit conducerea automatizat a proceselor; - enzima nu rmne n produs; - reacia se poate opri la momentul dorit printr-o simpl operaie mecanic. Cu toate avantajele pe care le prezint enzimele imobilizate, deocamdat industria alimentar utilizeaz numai glucozoizomeraza imobilizat pentru transformarea glucozei n fructoz i lactaza imobilizat pentru hidroliza lactozei din lapte sau zer. Exprimarea activitii enzimatice Studiul cantitativ al enzimelor const n msurarea activitii catalitice a acestora. Dozarea activitii enzimelor se bazeaz pe proprietatea lor de a cataliza o anumit reacie caracterizat, printr-o anumit vitez, n condiii determinate (timp, pH, temperatur). Comisia de Enzimologie de pe lng Uniunea Internaional de Biochimie recomand folosirea urmtoarelor uniti: - unitatea enzimatic (U) reprezint acea cantitate de enzim care catalizeaz transformarea unui micromol (mmol; 10-6 mol) de substrat n timp de 1 minut, la 25C, n condiii optime de pH i de concentraie de substrat Unitile enzimatice se pot exprima i n nanomoli (nmol; 10 -9 mol) sau picomoli (pmol; 10-2 mol) de substrat care reacioneaz, sau de produs de reacie format, ntr-un minut. Se recomand de asemenea , exprimarea activitii enzimatice n Katali (Kat); un Kat reprezint cantitatea de enzim ce transform un mol de substrat ntr-o secund. 1 Kat = 1 mol/s = 60 moli/min = 60 x 106 moli/min = 6 x 107 U - activitate specific reprezint numrul de uniti enzimatice raportat la 1 mg protein; - activitate molar este numrul de moli de substrat transformat (sau de produs format) n decurs de 1 minut de o molecul de enzim; acest mod de exprimare a activitii enzimatice necesit cunoaterea greutii moleculare a enzimei luate n studiu; - activitatea centrului activ se exprim prin numrul de molecule de

204

Enzime substrat transformate ntr-un minut de centrul activ al enzimei.

7.8. Nomenclatura i clasificarea enzimelorEnzimele sunt substane complexe i ntruct la majoritatea nu li se cunoate precis structura, nu li s-a fcut o clasificare pe baza structurii chimice. Iniial ele au fost denumite dup substratul pe care l transform urmat de sufixul "az" (lipaz, maltaz etc.); de asemenea, s-au pstrat denumiri mai vechi care nu aduc informaii speciale: pepsin, papaina, tripsin. Identificarea unui numr tot mai mare de enzime (n prezent sunt cunoscute peste 2000) a impus necesitatea unei nomenclaturi. Astfel, n 1961 Comisia de Enzimologie a Uniunii Internaionale de Biochimie a stabilit un sistem de nomenclatur i clasificare pentru enzime; denumirea unei enzime este constituit din trei pri: 1) denumirea substratului (sau substratelor); 2) tipul de reacie; 3) sufixul - az. De exemplu, enzima care catalizeaz reacia de transformare a acidului lactic n acid piruvic este denumit lactat-dehidrogenaza. Pe acest principiu enzimele sunt clasificate n clase, n subclase i subsubclase n funcie de unele detalii privind gruprile chimice supuse transformrii (hidroliz, transfer, activare, etc.) i natura cofactorilor implicai n reacia pe care o catalizeaz. Fiecare enzim este desemnat printr-un cod format din 4 cifre care conine informaii despre enzima respectiv. De exemplu, lactatdehidrogenaza are codul EC 1.1.1.27; EC reprezint prescurtarea de la Enzyme Commission; prima cifr clasa; a doua subclasa; a treia sub-subclasa, iar a patra numrul de ordine a enzimei din subsubclas. Uneori este necesar i o infirmaie adiional asupra naturii reaciei. Aceasta este indicat n paranteze. De exemplu, pentru reacia: L-malat + NAD+ piruvat + CO2 + NADH + H+ enzima este denumit L-malat-NAD oxidoreductaza (de decarboxilare). n funcie de tipul reaciei pe care o catalizeaz, enzimele sunt mprite n ase mari clase: Oxidoreductaze sunt sisteme enzimatice care catalizeaz reacii de tip redox. n aceste reacii are loc transferul de electroni sau de hidrogeni ntre diferii parteneri de reacie. Energia liber care se degaj n aceste reacii constituie cea mai important surs energetic pentru metabolismul celulei vii.

205

Biochimia produselor alimentare Transferaze sunt enzime care catalizeaz reaciile de transfer a unui fragment molecular de pe un substrat pe altul. Energia implicat n timpul acestei transformri este de multe ori apropiat ca valoare de cea care rezult din reaciile redox. Hidrolaze cuprind enzimele care catalizeaz reaciile de scindare a substratului cu participarea apei. Liaze catalizeaz reaciile de desfacere n care nu apar fenomene de tip redox sau de hidroliz. Izomeraze sunt sisteme enzimatice care catalizeaz reaciile de izomerizare a substanelor. Ligaze catalizeaz reacii n care se formeaz legturi chimice noi, energia necesar fiind furnizat de ATP.

7.9. Descrierea principalelor clase de enzime7.9.1. Oxidoreductazen clasa oxidoreductazelor sunt cuprinse enzimele care catalizeaz reacii de oxidoreducere ce se manifest prin transfer de electroni de la un donor (agent reductor) ctre un acceptor (agent oxidant). n timpul trecerii electronilor de la agentul reductor la agentul oxidant se creeaz o diferen de potenial care va fi cu att mai mare cu ct compusul care primete electroni are o afinitate mai mare pentru acetia. Transferul de electroni n multe reacii are loc prin transferul atomilor de hidrogen; astfel dehidrogenarea are ca echivalent oxidarea, iar hidrogenarea reducerea. Aceste enzime se deosebesc de enzimele altor clase prin unele particulariti. Astfel, n celula vie oxidoreductazele formeaz sisteme aa numite lanuri de enzime oxido-reductoare, n care are loc un transfer n trepte al atomilor de hidrogen sau al electronilor de la primul substrat la acceptorul final, care, de regul, este oxigenul. n final, atomii de hidrogen sunt transferai pe oxigen i se formeaz apa. Oxidoreductazele care transfer atomii de hidrogen sau electronii direct pe atomii de oxigen se numesc dehidrogenaze aerobe sau oxidaze. Spre deosebire de acestea, oxidoreductazele care transfer atomii de hidrogen i electronii de la un component al lanului de oxidare la altul fr a-i ceda oxigenului, se numesc dehidrogenaze anaerobe. Dac

206

Enzime enzima catalizeaz reacia lund hidrogen direct de la substana ce se oxideaz (primul substrat), atunci ea se numete dehidrogenaz primar. Dac enzima accelereaz prelucrarea atomilor de hidrogen de la al doilea substrat, care a primit atomii de hidrogen prin intermediul dehidrogenazei primare (al doilea substrat poate fi chiar oxidoreductaza primar), atunci poart denumirea de dehidrogenaz secundar. O particularitate important a oxidoreductazelor este faptul ca intervin ntr-o mare varietate de reacii redox. Acest lucru se explic prin faptul c, unul i acelai cofactor este capabil s se uneasc cu diverse apoenzime, formnd de fiecare dat o oxidoreductaz specific n raport cu un substrat sau altul. Oxidoreductazele i exercit aciunea lor catalitic n prezena unor coenzime diferite: nicotinamidice, flavinice, heminice care se comport ca acceptori intermediari ntre substratul primar i acceptorul final. 7.9.1.1. Oxidoreductaze NAD+ - sau NADP+ - dependente Aceste enzime denumite i dehidrogenaze (transhidrogenaze) catalizeaz reacii de oxidoreducere prin transfer, n general reversibil, de hidrogen de pe un donor pe un acceptor. Au un caracter anaerob deoarece acceptorul de hidrogen este altul dect oxigenul. Aciunea catalitic a dehidrogenazelor const ntr-o labilizare a hidrogenului din molecula substratului (donorul), astfel c acetsa devine apt s se uneasc cu o alt molecul din sistem acceptorul capabil s-l fixeze. Aciunea de activare se explic prin faptul c dehidrogenazele sunt sisteme oxido-reductoare reversibile, adic fixeaz cu uurin hidrogenul substratului pe care-l pot ceda, cu aceeai uurin, unui acceptor capabil s-l primeasc, dar nu direct, ci numai prin intermediul dehidrogenazelor. Dac se noteaz cu DH2 substratul (donorul de hidrogen), cu Ttransportorul de hidrogen (enzima), cu A acceptorul de hidrogen, reacia de oxido-reducere se poate reprezenta schematic astfel: DH2 + T + A D + T + AH2 Aceasta se realizeaz de fapt prin etapele: DH2 + T D + TH2 TH2 + A T + AH2 n care transportorul intervine direct, dar numai temporar. Mecanismul de aciune al dehidrogenazelor este determinat de cofactorul lor care este NAD+ sau NADP+. Funcia de acceptor de protoni i electroni o ndeplinete nucleul piridinic al acestor coenzime conform reaciei:

207

Biochimia produselor alimentare

DH2 D + 2H+ + 2e NAD (sau NADP ) + 2e + 2H+ NADH (sau NADPH) + H++ +

sau

H4 4 +

H + H+ N R

+ 2H ++ 2e

N R NAD+ (NADP+)

NADH (NADPH)

Se observ c, n aceast reacie substratul (DH2) d doi atomi de hidrogen; un atom de hodrogen se leag la molecula coenzimei (n poziia 4 a nucleului piridinic), iar al doilea atom de hidrogen i d electronul coenzimei i se transform n proton (H+) care este absorbit de capacitatea tampon a mediului de reacie. Oxidoreductazele NAD+ - dependente intervin n procese metabolice oxidative (ciclul acidului citric, catena de oxidare celular), iar cele NADP+ dependente, n procesele reductive de sintez (biosinteza extramitocondrial a acizilor grai, steroizilor etc.) i n untul pentozomonofosfat. Dehidrogenazele au o larg distribuie n diferite esuturi, cataliznd reacii n care intervin diverse substraturi. Cteva exemple de dehidrogenaze:

Enzima

Denumirea prescurtat

Coenzima

208

Enzime Lactatdehidrogenaza Alcooldehidrogenaza Glicerofosfatdehidrogenaza Colindehidrogenaza Malatdehidrogenaza Glutamatdehidrogenaza Glucozo-6-fosfatdehidrogenaza D-izocitricdehidrogenaza Glutationreductaza LDH ADH GPDH ChDH MDH GDH G-6-PDH ICDH NAD+ NAD+ NAD+ NAD+ + NAD sau NADP+ NAD+ sau NADP+ NADP+ NADP+ NADP+

Reaciile n urmtoarele:

care

intervin

unele

din

aceste

dehidrogenaze

sunt

- lactatdehidrogenaza (LDH) catalizeaz reacia de dehidrogenare a acidului lactic la acid piruvic:NAD+ NADH+H+

CH3 CH COOH OH acid lactic

CH3

C COOH

O acid piruvic

Are o specificitate n raport cu configuraia L a acidului lactic, forma D fiind mult mai lent dehidrogenat. Lactatdehidrogenaza se gsete n muchi, plmni, ficat i n alte esuturi animale. O enzim similar exist n plante i microorganisme. - alcooldehidrogenaza (ADH) catalizeaz reacia transformare a alcoolului etilic n acetaldehid:NAD+ NADH+H+

reversibil

de

CH3 CH2 OH alcool etilic

CH3

CHO

acetaldehid

Reacia reprezint etapa final a fermentaiei alcoolice. Enzima se gsete n esuturile animale, vegetale i microorganisme. Alcooldehidrogenaza din drojdie este o enzim ce conine grupe SH drept grupri active. glicerofosfatdehidrogenaza (GPDH) catalizeaz reversibil a -glicerofosfatului n dioxiacetofosfat: dehidrogenarea

OH CH2 CHOH CH2OH -glicerofosfat O P OH O

NAD+ NADH+H+

OH CH2 C O CH2OH dioxiacetonfosfat O P OH O

209

Biochimia produselor alimentare Enzima este specific. Intervine n etapele fermentaiei alcoolice i ale glicolizei. Este prezent n drojdie, celulele animale i vegetale. - malatdehidrogenaza (MDH) catalizeaz reacia de oxidare a acidului malic cu formare de acid oxalilacetic:

COOH CH OH CH2 COOH acid malicNAD+ NADH+H+

COOH C O CH2

COOH acid oxalilacetic

Enzima face parte din sistemul enzimatic al ciclului acidului citric i este prezent n toate organismele. - glucozo-6-fosfatdehidrogenaza (G-6-PDH) transform glucozo-6-fosfatul n acid 6-fosfogluconic:OH CH2 O H H OH

OH

P H OH

O OH

NADP+

NADPH+H+

H

CH2 O OH H H

P

O OH

OH OH H

OH OH H

COOH

OH

OH

glucozo-6-fosfatEste o enzim absolut specific.

acid-6-fosfogluconic

- D-izocitricdehidrogenaza (ICDH), important n ciclul acidului citric, face trecerea acidului D-izocitric n acid oxalsuccinic:

HO CH COOH CH COOH CH2 COOH acid izocitric

NADP+

NADPH+H+

O C

COOH

CH COOH CH2 COOH acid oxalsuccinic

Activitatea enzimei necesit prezena Mg2+ sau Mn2+, iar reacia de dehidrogenare este urmat de una de decarboxilare. - glutationreductaza particip la oxidoreducerea glutationului:NADPH+H+ NADP+

G S S G glutation oxidat

2 G SH glutation redus

210

Enzime n felul acesta este refcut glutationul redus necesar pentru meninerea n form activ a conformaiei unor enzime ce conin grupri SH. 7.9.1.2. Oxidoreductaze FAD sau FMN dependente (Flavinenzime) Flavinenzimele sunt enzime care actalizeaz reacii de oxidoreducere transfernd hidrogenul fie direct de la substrat, fie de la formele reduse ale coenzimelor piridinice la oxigenul molecular sau la ali intermediari. Cele care transfer hidrogenul oxigenului funcioneaz ca dehidrogenaze aerobe, pe cnd cele ce transfer hidrogenul la un acceptor oarecare, diferit de oxigen, au un caracter anaerob. Transferul hidrogenului de ctre aceste enzime se realizeaz prin intermediul cofactorilor lor. Acestea sunt flavinadeninmononucleotidul (FMN) i flavinadenindinucleotidul (FAD). FMN i FAD se deosebesc de NAD+ i NADP+ prin faptul c sunt strns legate de molecula de apoenzim, de care se despart doar printr-o hidroliz acid. Toate nucleotidele flavinice conin riboflavin al crei nucleu izoaloxazinic conine duble legturi conjugate ce confer funcia dehidrogenazic:R H3C H3C N N O NH O +2H -2H H3C H3C R N H N O NH

N FAD (FMN) (Forma oxidata)

O FADH2 (FMNH2)

N H

Transferul a doi atomi de hidrogen se realizeaz prin adiia i cedarea hidrogenului la nivelul sistemului de duble legturi conjugate la care particip atomii de azot din poziiile 1 i 10 ale ciclului izoaloxazinic. Enzimele flavinice intervin ca transportori de hidrogen ntr-un mare numr de reacii de oxidoreducere i n special n dehidrogenrile n care, n prima etap, intervin dehidrogenazele cu NAD+ i NADP+, determinnd regenerarea formelor oxidate ale acestor coenzime. n cazul enzimelor flavinice cu caracter aerob, succesiunea de reacii poate fi redat astfel:

211

Biochimia produselor alimentareDH2 NAD+ FADH2 O2

Acceptorul de D FAD NADH + H+ este oxigenul iar produsul de reacie este apa oxigenat. -

H2O2

hidrogen molecular

n cazul enzimelor flavinice cu caracter anaerob, reaciile decurg n modul urmtor:DH2 NAD+ FADH2 2 citocromi (Fe3+)

D Aceste 2 citocromi (Fe2+) + 2H+ FAD NADH + H+ reacii constituie o parte a catenei de oxidare celular, n care dup cum se observ, cofactorii FAD sunt situai ntre NAD+ i citocromi. n felul acesta, n lanul reaciilor de oxidoreducere ale respiraiei celulare, enzimele flavinice au funcia de a transporta hidrogenul substratului, preluat iniial de NAD+, la citocromi.

Unele flavinenzime conin n molecula lor i metale, Cu2+, Fe3+ sau Mo2+, ceea ce le confer un rol dublu, fiind i transportoare de electroni. Dintre flavinenzime se menioneaz cteva mai importante: - glucozoxidaza, care catalizeaz reacia de oxidare a glucozei la acid gluconic cu formare de H2O2. Enzima se folosete pentru dozarea glucozei n mod specific. Preparatele enzimatice care conin glucozoxidaz, obinute din culturi de diferite mucegaiuri ,sunt utilizate i n industria alimentar pentru ndeprtarea glucozei i a oxigenului din diverse produse. ndeprtarea glucozei este necesar pentru a se evita desfurarea reaciei Maillard n unele alimente (ex. din albuul de ou ntreg la obinerea prafului de ou). Consumarea oxigenului rezidual din alimente n prezena excesului de glucoz i a glucozoxidazei evit procesele oxidative care afecteaz calitile produselor. ndeprtarea enzimatic a oxigenului se aplic pentru conservarea maionezei, laptelui praf, prafului de ou, cafelei prjite, untului, produselor din carne. Preparatul enzimatic introdus n pungi de polietilen permeabil la aer i impermeabil la ap, se nchide n ambalaj odat cu alimentul, iar oxigenul din acesta difuzeaz prin membran i este consumat de glucozoxidaz. Apa oxigenat format este descompus de catalaz, enzim care nsoete preparatul de glucozoxidaz. De asemenea, prin oxidarea -glucozei sub aciunea glucozoxidazei se formeaz -gluconolactona utilizat n industria preparatelor de carne

212

Enzime pentru meninerea culorii roii caracteristice a acestor produse. - D-aminoaxcidoxidazele realizeaz oxidarea formelor D ale aminoacizilor dup reacia general:COOH H C R NH2 + O2 + H2O FAD FADH2 COOH C R O + NH3 + H2O2

Aceste enzime se gsesc n rinichi, prezint o specificitate n raport cu configuraia aminoacizilor (formele L nu sunt oxidate), iar reaciile de acest tip constituie sursa principal de peroxid de hidrogen n sistemele metabolice. Coenzima lor este FAD. Formele L ale aminoacizilor sunt oxidate de L-aminoacid-oxidaze cofactor FMN. ce au drept

- citocrom-c-reductaza se gsete n ficat, inim, drojdie i acioneaz sinergic cu enzimele NAD+ dependente, dup mecanismul enzimelor flavinice de tip anaerob. - xantinoxidaza catalizeaz oxidarea bazelor purinice xantina i hipoxantina pn la acid uric:O HN N N H N FAD FADH2 O HN N H N H O N

H2O + O2

H2O2

hipoxantinaO FAD FADH2 O HN N H N H NH O

xantina

H2O + O2

H2O2

acid uric

Xantinoxidaza se gsete n lapte, precum i n esuturile animale i vegetale. Necesit Mo pentru aciune. 7.9.1.3. Citocromii Citocromii sunt enzime care catalizeaz reaciile de oxidoreducere prin transfer de electroni de pe un donor pe un acceptor.

213

Biochimia produselor alimentare Numai puine dehidrogenaze sunt capabile de a ceda hidrogenul preluat de la substrat sau de la dehidrogenaze reduse direct oxigenului din aer. Veriga intermediar ntre piridinele sau enzimele flavinice reduse, pe de o parte, i oxigenul atmosferic pe de alt parte, o constituie sistemul citocromic. Sistemul citocromic este alctuit din citocromi precum i din citocromoxidaz, enzim care activeaz oxigenul molecular i oxideaz cu acesta citocromul redus. Sistemul citocromic se ntlnete practic n toate organismele aerobe. El cuprinde o serie de citocromi care se deosebesc dup spectrul de absorbie, dup afinitatea fa de oxigenul molecular, potenialul redox i sunt denumii prin diferite litere sau litere care poart ca indice o cifr: citocrom a, citocrom a3, citocrom b, citocrom c, citocrom c1, citocrom P-450 etc. Citocromii reprezint n sine nite proteine conjugate (cromoproteide) a cror grupare prostetic este hemul i al cror mecanism de aciune se bazeaz pe posibilitatea de a-i schimba reversibil valena fierului din ion feros n ion feric i invers. -ecit (Fe3+) cit (Fe2+) +eforma oxidata Prin aceast forma redusa schimbare de valen se realizeaz transferul de electroni. n funcie de natura hemului pe care-l conin, citocromii au fost clasificai n patru grupe: - citocromii a - care au drept coenzim formil-porfirina; - citocromii b care conin protoporfirina; - citocromii c conin porfirin substituit legat covalent cu partea proteic; - citocromii d au drept coenzim dihidroporfirina. Dup spectrul de absorbie n soluie alcalin de piridin, citocromii se clasific n: 580-590 nm pentru citocromii a; 556-558 nm pentru citocromii b; 549-551 nm citocromii c i 600-620 nm citocromii d. n funcie de potenialul oxido-reductor, citocromii se difereniaz n: a1, a2, a3, b1, b5, c1, c2, c3, c4. Citocromul a transfer electronii de la citocromul c la citocromul a3. Citocromul a3 mpreun cu citocromul a formeaz o molecul unic, citocromoxidaza care transfer electronii direct oxigenului molecular; este deci o transelectronaz aerob spre deosebire de ceilali citocromi

214

Enzime care sunt de tip anaerob. Citocromul a3 are potenialul cel mai electropozitiv i n afar de fier mai conine i cupru, iar partea sa proteic este legat de o lipoproteid a membranei mitocondriale. Accept electronii de la citocromul a i i cedeaz oxigenului care va reaciona cu H+ formnd apa:

2 cit. a (Fe2+) + 2 cit. a3(Fe3+) 2 cit. a3 (Fe2+) + 1/2 O2 O + 2H2+

2 cit. a (Fe3+) + 2 cit. a3(Fe2+) 2 cit. a3 (Fe3+) + O2H2O

Citocromoxidaza se difereniaz de hemoglobin i de mioglobin ntruct acestea cnd se oxigeneaz nu-i modific valena fierului din structur; la citocromoxidaz valena fierului se modific atunci cnd interacioneaz cu oxigenul. Citocromul b transport electronii de la ubichinon la citocromul c n catena de respiraie celular. Citocromul b5 face parte din structura microzomilor i particip la transportul de electroni i la procesele de hidroxilare mpreun cu citocromul P-450. Citocromul c este cel mai cunoscut citocrom att n ceea ce privete structura, ct i funcia sa. El acioneaz ca transportor de electroni n catena de respiraie celular ntre citocromii b i a. Se gsete n miocard, n ficat, rinichi, n germenii cerealelor, n drojdii. Citocromul c are legat partea heminic de partea proteic prin puni de sulf;

215

Biochimia produselor alimentare de asemenea, este posibil stabilirea de legturi coordinative ntre fierul din hem i ciclul imidazolic al radicalilor de histidin. O asemenea structur confer moleculelor de citocromi o mare stabilitate. n transferul electronilor de la atomii de hidrogen prin catena de oxidare celular, la nivelul mitocondriilor, iau parte succesiv citocromii b, c1, c, a, a3 dispui n aceast ordine pe baza potenialului redox. Trebuie totodat, precizat c citocromii iau parte nu numai n procesul de respiraie, ci i n procesele de fotosintez, chemosintez i fixare a azotului molecular. 7.9.1.4. Oxidaze Oxidazele sunt enzime care catalizeaz reaciile directe dintre substraturile lor i oxigenul molecular, transfernd hidrogen sau electroni de la substrat la O2. n funcie de mecanismul de aciune, oxidazele, se mpart n urmtoarele tipuri: Oxidaze care transport electroni. Acestea catalizeaz reacii n care electronii substratului sunt transferai pe O2 dup reacia: DH2 D O2 H2O

Fac parte din aceast categorie de enzime citocromoxidaza, al crei rol n procesele redox a fost prezentat anterior, ascorbatoxidaza, fenoloxidazele, ceruloplasmina. a)Ascorbatoxidaza este o cupruenzim ce catalizeaz oxidarea acidului ascorbic la acid dehidroascorbic:O C HO C HO C HC HO C H CH2OH acid ascorbic O + 1/2 O 2-H2O

O C O C O C HC HO C H CH2OH acid dehidroascorbic O

216

Enzime Este larg rspndit n vegetale. Deosebit de activ este

ascorbatoxidaza din dovleac, varz i dovlecei. n unele plante aceast enzim are rol de oxidaz final n sistemul enzimatic oxidoreductor al glutationului. Ascorbatoxidaza este foarte specific n privina acceptorului de electroni, care trebuie s fie oxigenul molecular i n privina substratului care trebuie s aib o structur dienolic adiacent gruprii carboxil, o structur n ciclul nchis i izomerul L. Are pH-ul optim 5,6-6,0. Reacia de oxidoreducere a acidului ascorbic are loc n mod permanent n esutul vegetal integru, sub aciunea unor sisteme redox (glutation). Dac esutul este vtmat, reacia de oxidare devine enzimatic datorit prezenei O2, nu mai este reversibil i ca urmare are loc o scdere sensibil a coninutului de acid ascorbic. Ascorbatoxidaza poate fi inactivat prin nclzire la 100C i inhibat prin introducerea n mediu a SO2 sau prin modificarea pH-ului. n acest sens, oprirea fructelor i legumelor tiate, meninerea lor n soluii acide sau cu SO2 constituie modaliti de aciune pentru contracararea ascorbatoxidazei i evitarea pierderilor de vitamin C la prelucrarea acestor produse. b) Fenoloxidazele sunt enzime prezente n toate esuturile organismelor superioare i la microorganisme cataliznd oxidarea monofenolilor i poilifenolilor. Din punct de vedere chimic, fenoloxidazele sunt cupruenzime care au posibilitatea de a reaciona direct cu oxigenul

217

Biochimia produselor alimentare molecular prin schimbare de valen. Clasificarea lor se face dup natura substratului pe care-l oxideaz, n dou tipuri: - fenoloxidaze de tipul tirozinazei; - polifenoloxidaze. - Tirozinaza este o fenoloxidaz care oxideaz monofenolii i o-difenolii. Este prezent n esuturile plantelor, n ciuperci i n unele esuturi animale. TirozinazaOH OH 1/2 O2 OH 1/2 O2 - H2O o-chinona O O

fenol

o-difenol

transform fenolul i o-difenolul n chinone colorate n brun:

n regnul animal tirozinaza particip la formarea melaninelor prin oxidarea tirozinei. ntr-o prim etap, tirozina este oxidat la dioxifenilalanin (DOPA), iar n continuare aceasta este oxidat, tot de ctre tirozinaz, la melanin.OH OH OH Melanina

CH2 CH COOH NH2 tirozina

CH2 CH COOH NH2 DOPA

O activitate tirozinazic intens exist n mucegaiuri i n fina de secar. Culoare nchis a pinii de secar se explic, n mare parte, prin prezena tirozinazei. Tot acestei cauze se datoreaz uneori culoarea mai nchis a unor paste finoase (unele laturi de fin de gru conin o tirozinaz foarte activ).

218

Enzime - Polifenoloxidazele sunt, de asemenea, cupruenzime care oxideaz orto- i para- difenolii n chinone colorate, dar nu acioneaz asupra monofenolilor. Se gsesc n cartofi, mere, struguri, pere, gutui, cereale, la unele mucegaiuri. Prin aciunea polifenoloxidazelor se explic nchiderea la culoare a cartofilor sau merelor tiate, a sucurilor de fructe, sau a vinurilor; de asemenea, aceste enzime iau parte la oxidarea substanelor tanante n timpul fermentrii frunzelor de ceai i tot lor se datoreaz mbrunarea fructelor i legumelor n timpul uscrii. Fenomenul este cunoscut sub denumirea de mbrunare enzimatic, iar pentru c produce o depreciere a culorii produselor este nedorit n indusrtria alimentar. Prevenirea mbrunrii se poate face prin inactivarea termic a polifenoloxidazelor (oprire) sau pe cale chimic (SO 2, acid ascorbic). pHul optim de aciune al acestor oxidaze din fructe este cuprins ntre 5,17,3, iar temperatura optim este 30C. n celulele sau esuturile intacte, fenoloxidazele nu oxideaz polifenolii deoarece lipsete oxigenul molecular; or, aceste enzime nu acioneaz dect n prezena sa. c) Ceruloplasmina se gsete n plasma sanguin, conine cupru i catalizeaz oxidarea hidrochinonei i p-fenilendiaminei pn la pchinone. Dioxigenaze. Sunt enzimele care catalizeaz reacii n care amndoi atomii oxigenului molecular se regsesc n produii de reacie. Reacia general se prezint sub forma: A + O2 AO2 Enzimele acestei grupe pot conine n calitate de grupare activ hem sau fier neheminic, iar pentru aciunea unora, pe lng acesta, este necesar i prezena ( )-cetoglutaratului. Cu predilecie, dioxigenazele catalizeaz ruperea dublelor legturi din ciclul aromatic, ns i alte diverse reacii sunt catalizate n mod asemntor. O astfel de enzim este lipoxidaza (lipoxigenaza) care oxideaz acizii grai nesaturai, carotenii i vitamina A. Este rspndit n vegetale, iar cantiti mari se gsesc n leguminoase i oleaginoase. Substratul principal al lipoxidazei sunt acizii grai care conin n molecula lor gruparea CH=CH-CH2-CH=CH- cu configuraia cis, adic cel puin dou duble legturi izolate, desprite printr-o grup metilen. Acizii grai care conin asemenea grupe sunt acizii grai polinesaturai: linoleic, linolenic i arahidonic. Procesul de oxidare a acidului linoleic decurge dup schema:

219

Biochimia produselor alimentare

CH3

13 12 11 10 9 (CH2)4 CH CH CH2 CH CH

(CH2)7

COOH

O2 13 12 11 10 9 CH3 (CH2)4 CH CH CH CH CH OO

(CH2)7

COOH

Radical liber Formele trans nu sunt atacate. Se observ c n desfurarea reaciilor de oxidare se formeaz radicali liberi care ntrein lanul de reacii pn la antrenarea ntregii cantiti de acizi, precum i a carotenilor i vitaminei A. Reacia catalizat de lipoxidaz este cauza principal a rncezirii grsimilor nesaturate n timpul pstrrii lor, a scderii coninutului de caroteni sau de vitamina A i are deci un rol deosebit n degradarea unor produse alimentare. Prin emulsionarea substratului se mrete suprafaa de contact dintre enzim i substrat, deci viteza de reacie crete. Pentru prevenirea aciunii lipoxidazei se folosesc inhibitori (antioxidani) care prin reacii de terminare blocheaz radicalii liberi. Totui, sunt i implicaii pozitive ale lipoxidazei pentru calitatea unor produse alimentare. Astfel, lipoxidaza grului i mai ales preparatele de lipoxidaz din soia determin albirea aluatului i mbuntirea proprietilor sale reologice. Datorit decolorrii pigmenilor finii, lipoxidaza conduce la obinerea pinii cu miez deschis la culoare. Monooxigenaze. Organismele animale conin o grup numeroas i divers de enzime care poart denumirea de monooxigenaze. n cazul tipic, un atom al moleculei de oxigen este regsit n noua grupare hidroxilic a substratului, iar cellalt este redus pn la ap, n cursul reaciei respective. Pentru aceasta reacia trebuie s decurg n prezena enzimei, substratului, O2 i a unui oarecare agent reductor. Aceste enzime se mai numesc hidroxilaze sau oxidaze cu funcii mixte. Reacia general dup care decurge monooxigenaze este urmtoarea: o reacie catalizat de

D-H + O2 + AH2 D-OH + H2O + A n care: - D-H este substratul care se oxideaz n D-OH; - AH2 este agentul reductor (donor de hidrogen). n acest mod agentul reductor care este un donor de hidrogen joac rolul de cosubstrat. De multe ori acest rol de cosubstrat este ndeplinit de NADH + H+. Astfel, unele din enzimele implicate n biosinteza steroizilor sau n transformrile acestora sunt monooxigenaze care utilizeaz NADPH drept cosubstrat. De asemenea, o serie de enzime implicate n metabolismul xenobioticelor (substane biologic active de natur exogen) sunt monooxigenaze care se gsesc n microzomii

220

Enzime celulei hepatice mpreun cu citocromul P-450 i citocromul b5. Acest sistem enzimatic hepatic are drept cosubstrat NADH+H+ i realizeaz, prin transfer de electroni i hidroxilare enzimatic, hidroxilarea xenobioticului contribuind la metabolizarea sa:2H+ NADH+H+ FAD 2 cit b5 (Fe2+) 2 cit P-450 (Fe3+) X-OH + H2O

NAD+

FADH2

2 cit b5 (Fe3+)

2 cit P-450 (Fe2+)

X-H + O 2

n care X este xenobioticul (medicament, drog, compui toxici etc.). Citocromul P-450 poate fi indus tocmai prin prezena diferitor xenobiotice. 7.9.1.5. Ali transportori de electroni Coenzima Q n mitocondrii exist o grup de chinone nrudite care se reduc cnd mitocondria este incubat anaerob cu diverse substraturi. Ele se numesc coenzime Q. Structura i caracteristicile acestui tip de compui au fost redate n capitolul referitor la vitamine i anume n prezentarea ubichinonelor. n catena de respiraie, coenzima Q ocup un loc intermediar ntre FMN i citocromul b, participnd la transferul electronilor de la primul la al doilea din compuii amintii. Superoxiddismutaza n timpul transportului electronilor spre oxigenul molecular pe calea catenei de respiraie mitocondrial, ca i n diferite reacii de hidroxilare i oxigenare ,se pot forma produi toxici rezultai din reducerea parial a oxigenului. Printre acetia fac parte anionul superoxid O2. i H2O2 care sunt extrem de reactivi i capabili de a distruge activitatea unor biomolecule. Pentru eliminarea anionului superoxid, organismele sunt dotate cu o enzim specific superoxiddismutaza (SOD) care catalizeaz reacia:

H2O2 + O2 cea mai important 2 + O2 + 2 H Aceasta este reacie de protecie a organismului, care acioneaz n prima linie de aprare celular, neutraliznd peste 90% din radicalii liberi formai.Superoxiddismutaza este o metal enzim, care conine n centrul activ un metal, de exemplu Cu2+, Mn2+, Fe3+. Enzima din citosolul celulelor de eucariote conine Zn2+ i catalitic, ntr-o vecintate foarte strns. Cu2+ n centrul

O

+

SOD

221

Biochimia produselor alimentare Catalazele i peroxidazele n reaciile de oxidoreducere catalizate de transhidrogenazele aerobe precum i n reacia catalizat de superoxiddimutaz se formeaz peroxid de hidrogen (H2O2) care este un oxidant puternic i acumularea sa n celule n cantitate mare este duntoare. Descompunerea apei oxigenate rezultat din reaciile menionate are loc n organism n mod organizat prin enzime specifice ce o descompun utiliznd-o n scopuri precise de oxidare necesar proceselor metabolice, fie o descompun pur i simplu n ap i oxigen. Enzimele care catalizeaz aceast reacie de descompunere a peroxidului de hidrogen sunt catalazele i peroxidazele. n reaciile catalizate de aceste enzime ndeplinete funcia de acceptor de hidrogen: H2O2 + 2H+ + 2e 2 H2O Catalazele sunt cromoproteide cu hem, a cror grupare prostetic este legat de protein prin dou grupri carboxil Activitate catalazic s-a observat aproape la toate celulele i organele animale. Ficatul, eritrocitele i rinichii sunt surse bogate de catalaz. Aceast activitate a fost evideniat, de asemenea, la toate esuturile vegetale i la majoritatea microorganismelor, cu excepia celor obligator anaerobe. Reacia dup care catalaza descompune apa oxigenat este urmtoarea: peroxidul de hidrogen

2 H2O + O2 H2O2 + H2O2 Oxigenul molecular rezultat din reacie constituie o surs de oxigenare a unor esuturi i este utilizat totodat de celule pentru efectuarea unor reacii.Preparatele enzimatice de catalaz obinute din ficat de bovine sau prin biosintez prin cultivarea unor microorganisme, sunt utilizate n industria alimentar pentru distrugerea apei oxigenate folosite pentru pasteurizarea oulor, conservarea laptelui, stabilizarea culturilor starter productoare de acid lactic. Peroxidazele sunt tot cromoproteide cu hem care descompun peroxizii dup reacia:

catalaza

ROOR' + DH2 peroxid

R-OH + R'-OH

n care ROOR este un peroxid oarecare sau peroxidul de hidrogen (H2O2). Pentru descompunerea peroxidului este necesar prezena unui donor de hidrogen (DH2). Acesta poate fi reprezentat de o substan oarecare, de obicei fenoli, aminoacizi, amine, aromatice.

222

Enzime Peroxidazele sunt rar ntlnite n esuturile animale. n ficat i rinichi s-a evideniat o slab activitate peroxidazic; peroxidaza se gsete i n lapte; n eritrocite exist glutationperoxidaza care conine Se i care oxideaz specific glutationul redus. Drojdiile conin peroxidaze specifice fa de citocromul c, iar la unele bacterii se gsesc peroxidaze care oxideaz NADH. Toate plantele sunt bogate n peroxidaz. Surse excelente sunt hreanul i ridichea neagr. Peroxidazele din esuturile vegetale lezate, secionate folosesc drept donori de hidrogen polifenolii pe care-i oxideaz la chinone ce prin condensare genereaz pigmeni melanici de culoare brun, afectnd culoarea fructelor i legumelor n timpul prelucrrii lor. Pentru inactivarea acestor enzime este necesar un tratament termic mai intens (temperatura de 90-95C, timp de 2-3 minute) deoarece sunt termostabile. Se poate recurge i la utilizarea unor inhibitori care se combin cu ionul de fier din hem. Peroxidazele acioneaz i n produsele vegetale congelate i se poate aprecia c degradarea culorii cestor produse este cauzat, n mare parte de peroxidaze. Oprirea prealabil a materiilor prime previne acest defect.

7.9.2. TransferazeEnzimele din aceast clas catalizeaz reacii de transfer, prin care o parte (G) din molecula unui substrat numit donor este cedat unui alt substrat, numit acceptor. Mecanismul general al reaciilor catalizate de aceste enzime este de forma: D-G + A D + A-G

n aceste reacii se formeaz intermediar un complex enzim-grupare transferabil, complex care va reaciona ulterior cu acceptorul, fixnd pe acesta gruparea activat. Denumirea enzimelor din aceast clas se face dup regula: donoracceptor ca prefix, urmat de denumirea gruprii transferate, dup care se adaug cuvntul transferaz. n funcie de natura gruprii transferate, aceste enzime se mpart n mai multe subclase: 7.9.2.1. Aminotransferaze (Tranaminaze) Aminotransferazele sunt enzimele care catalizeaz transferul unei grupri amino de pe un -aminoacid pe un - cetoacid, cu formarea unui nou aminoacid:

223

Biochimia produselor alimentare

R CH COOH + R' C NH2 O

COOH

R

C O

' COOH + R CH COOH NH2

n procesul de transaminare, aminoacizii dicarboxilici acidul glutamic i acidul aspartic joac un rol central; acceptorul de grupare amino poate fi un cetoacid oarecare, dar cel mai frecvent sunt acizii piruvic, oxalacetic sau -cetoglutaric. ns marea majoritate a aminoacizilor particip la procesele de transaminare, fenomen prin care organismele au posibilitatea de a-i sintetiza acizii aminai proprii n funcie de necesitile metabolice. Mecanismul transaminrii const n transferul gruprii amino de pe aminoacid pe cetoacid sub aciunea catalitic a enzimelor de

transaminare care au drept component

prostetic piridoxalfosfatul.

Acest transfer se face n mai multe etape, implicnd o serie de rearanjri intramoleculare, care n final duc la formarea unui nou aminoacid i a unui nou cetoacid. n prima faz are loc o condensare ntre aminoacid i centrul activ al enzimei, cu formarea unui compus de tipul bazelor Schiff. Compusul format sufer o rearanjare intramolecular prin deplasarea unui proton de la un carbon la altul, adic are loc tautomeria bazei Schiff. n faza a treia, n prezena apei enzima preia funcia amino pe care o va ceda unui cetoacid, prin acelai mecanism ca mai sus i rezult cetoacidul corespunztor aminoacidului iniial. Acest tip de transfer poart

224

Enzime denumirea de mecanism de ping-pong.CHO

R HC NH2 +

HO

CH2

O

P -H2O +H2O

R HC N CH Pirid

COOH aminoacid R C

H3C

N

COOH baz Schiff

piridoxalfosfat (Pirid-CHO) N H2C Pirid+H2O -H2O

R C O + H2N-H2C-Pirid

COOH

COOH

R' C O + H2N-H2C-Pirid

R'-H2O +H2O

R' N H2C Pirid CH N CH Pirid

C

COOH R' +H2O -H2O HC NH2 + OHC-Pirid

COOH

COOH

COOH

Activitatea transaminazelor este favorizat de unii ioni metalici cu care enzima formeaz chelai, nlesnind astfel legtura enzim-substrat. Reaciile de transaminare au o importan deosebit n metabolismul intermediar. Cu ajutorul lor se pot sintetiza aminoacizii proprii organismului, utiliznd aminoacizii i cetoacizii n exces, care se gsesc n aa numitul rezervor (pool) metabolic. Tot cu ajutorul acestor reacii se stabilete conexiunea ntre metabolismul proteic i cel glucidic. Exemple de transaminare: - Alanin - -cetoglutarattransaminaza catalizeaz reacia de transaminare reversibil de pe alanin pe acid -cetoglutaric:

225

Biochimia produselor alimentare

CH3 COOH

COOH CH2 CH2 COOH acid -cetoglutaric

CH3 COOH

COOH CH2 CH2

CH NH2 + C O

C O + CH NH2

alanin

COOH acid piruvic acid glutamic

- Glutamat oxaloacetattransaminaza (GOT) catalizeaz reacia reversibil dintre acidul glutamic i oxalacetic:

COOH CH NH2 + CH2 CH2 COOH acid glutamic

COOH C O CH2 COOH acid oxalacetic

GOT

COOH C O CH2 CH2 COOH acid -cetoglutaric +

COOH CH NH2 CH2 COOH acid aspartic

- Glutamat piruvattransaminaza (GPT) transfer reversibil gruparea amino a acidului glutamic pe acidul piruvic:

COOH

CH3

CH NH2 + C O COOH CH2 CH2 COOH acid glutamic acid piruvic

GPT

COOH C O CH2 CH2 COOH acid -cetoglutaric +

CH3 CH NH2 COOH

alanin

De asemenea, sub aciunea aminotransferazelor specifice, asparagina i glutamina pot s cedeze cetoacizilor gruprile lor aminice. Aminotransferazele exist la microorganisme, plante i animale. 7.9.2.2. Fosfotransferaze (Kinaze) Fosfotransferazele sunt enzime care catalizeaz reaciile de transfer a gruprii fosfat de la un donor la un acceptor specific, conform reaciei

226

Enzime generale: R-PO3H2 + R H R PO3H2 + R-H n general, aceste reacii se efectueaz cu o substanial modificare de energie, transferul radicalului fiind virtual ireversibil (cu excepia formrii compuilor macroergici) i nsoit de un important schimb de energie liber. Compuii fosforilai particip ntotdeauna la schimbri energetice importante: energia care rezult din reaciile oxidative exerogonice este folosit n mare msur pentru sinteza compuilor organici fosforilai pe seama fosfatului anorganic (reacie endergonic). Ulterior aceti compui fosforilai sunt utilizai n reaciile de sintez intracelular, ei furniznd energia liber pentru reaciile endergonice. Din aceast subclas fac parte: - Hexokinaza care catalizeaz prima reacie din procesul glicolizei, pornind de la glucoz i n care are loc un transfer de grupare fosfat de la ATP la hexoz:CH2OH O H H H HO OH H H OH OH CH2 O P O H H H H OH OH

ATP +

ADP +

HO OH H

glucoz

glucozo-6-fosfatfosforilareaO H OH HO H

- Fosfohexokinaza fosfohexozelor:P OH2CH

care

catalizeaz

mai

departe

a

O H OH HO H

CH2OH OH

P OH2CH

CH2O POH

+ ATP

+ ADP

fructozo-6-fosfat

fructozo-1,6-difosfat

- Piruvatkinaza trece fosforul de pe acidul fosfoenolpiruvic pe ADP cu formare de ATP:

227

Biochimia produselor alimentare

COOH O C O ~ P OH + ADP OH CH acid 2-fosfoenolpiruvic2

COOH C O + ATP CH3 acid piruvic

- Creatinkinaza particip la transferul gruprii fosfat de pe ATP pe creatin cu formare de creatinfosfat i ADP:

HN C

HN2 N CH2 COOH

NH ~ P + ATP HN C N CH2 COOH CH3 creatinfosfat

+ ADP

CH3 creatin

7.9.2.3. Metiltransferaze Sunt enzime care catalizeaz transferul gruprii metil de pe donor pe acceptor. nainte de cedare, gruparea metil trebuie activat de substane macroergice de tip ATP, formndu-se o combinaie intermediar, reactiv. Ca substane donatoare de radical metil funcioneaz metionina, colina etc. iar ca substane acceptoare colamina, glicocolul, noradrenalina, acidul guanidinacetic etc. Astfel, n cursul metabolismului intermediar, metionina furnizeaz grupri metil colaminei, trecnd-o n colin. Mai nti ns are loc activarea metioninei de ctre ATP. Aceasta const n legarea sa la restul de adenozil sub forma unui compus de sulfoniu, o stare mai reactiv, conform reaciei:

S CH3 CH2 2 CH NH3 COO+

NH2

+ ATP

metioninadenoN ziltransferaz H2O Pi + PPi N

N

CH3

CH2 S + ( CH2)2 CH COON OH OH + NH3 H H H O H

metionin

S-adenozilmetionina (metil activ)

Gruparea metil legat sub aceast form este activ i poate fi cedat uor atomului de azot; dup cedare, ionul de sulfoniu trece la forma normal de adenozintioeter. Transferul metilului se face numai pe un

228

Enzime atom de azot care fixeaz gruparea la cei doi electroni neparticipani:

A Rib S CH3 3 CH2 2 H C NH2 COOH S-adenozilmetionin

+

CH3 + N CH3 metiltransferaz + CH2 OH CH2 OH CH3 colamin colin CH2 NH2 CH2 + CH2 NH2 metiltransferaz CH2 NH CH3 COOH COOH glicocol sarcozin NH2 NH2 metiltransferaz C N