Electroforeza capilara

88

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006

NOTE DE CURS Electroforeza capilarCapillary electrophoresis Ileana Funduc*RezumatElectroforeza capilar este o tehnic mai nou care combin mecanismele de separare ale electroforezei cu aparatura i automatizarea cromatografiei. Exist numeroase variante de electroforez capilar care soluioneaz diversele probleme de separare. Acestea includ electroforeza zonal, electroforeza pe gel, focalizare izoelectric i izotacoforeza. Puterea extraordinar de separare, viteza analizelor i sensibilitatea extrem (o singur molecul prin detectarea cu fluorescen indus cu laser) conduc la aplicarea intensiv a electroforezei capilare de ctre multe dintre cele mai bune laboratoare de cercetare analitic din lume. Electroforeza capilar, fiind modalitatea cea mai potrivit i eficient de a separa moleculele ncrcate mari i mici, ofer o larg varietate de aplicaii privind analiza lichidelor biologice umane.

Cuvinte cheie: electroforez capilar, proteine serice, proteine monoclonale. AbstractCapillary electrophoresis is a newer technique which combines separation mechanisms of electrophoresis with the instrumentation and automation concepts of chromatography. There are many variants of capillary electrophoresis which solve different separation problems. These include free zone electrophoresis, gels for sieving and molecular weight based separations, isoelectric focusing, and isotachophoresis. The extraordinary separation power, speed of analysis and extreme sensitivity (a single molecule using laser induced fluorescence detection) are leading to intensive application of capillary electrophoresis by many of the best analytical research laboratories around the world. Being the most appropiate and efficient way to resolve both large and small charged molecules, capillary electrophoresis offers a wide variety of applications on the analysis of human body fluids.

Keywords: capillary electrophoresis, serum proteins, monoclonal proteins*

Adresa pentru coresponden: Ileana Funduc, Barajul Uzului 2, Bl. Y16, Sc. A, Apt. 18, Sector 3, 032796, Bucureti Tel.: 021 3407668, Mobil: 0724 210670, E-mail: [email protected]


89

IntroducereElectroforeza capilar s-a nscut din combinarea mecanismelor de separare ale electroforezei cu aparatura i automatizarea cromatografiei.

terioare, astfel scurtndu-se timpul de analiz. Ulterior, capilarele de sticl au fost nlocuite cu cele de silice cptuite cu poliimid, care sunt mult mai robuste i, mai important, transmit lumina UV.

AparaturInstalaia implic un capilar ce trece prin instalaia optic a unui detector, un dispozitiv de introducere a probei i o surs de voltaj nalt 1 (Figura 1). Capilarul umplut cu tampon are capetele introduse n rezervoarele de tampon. Electrozii fabricai dintr-un material inert (Pt) sunt introdui n tampon pentru a completa circuitul electric. La un capt al capilarului se injecteaz proba, apoi se aplic voltajul. Ionii probei se deplaseaz spre electrodul corespunztor, trecnd prin detectorul ce rspunde cu o nregistrare a componenilor separai n funcie de timp respectiv cu o electroforegram.

Istoricn 1967, Hjerten aplic electroforeza n tub deschis cu diametrul intern de mm. Virtanen utilizeaz capilare de sticl cu diametrul intern de 200 m. Mikkers folosete capilare de teflon. n 1980-81 Jorgenson i Lukacs au separat peptide n capilare de sticl cu diametrul intern de 75 m. Datorit limitrii transmisiei luminii prin sticl s-a folosit detectarea prin fluorescen. Acest format de capilar, capabil de a suferi efectul Joule, care apare n toate separrile electroforetice i degradeaz rezoluia, conduce la disiparea cldurii. Autorii folosesc voltaje mult mai mari (peste 30kV) fa de cele anSurs de voltaj nalt

Noiuni teoreticeFluxul electroosmotic sau electroendoosmotic Capilarul este fabricat din silice topit, a crei suprafa interioar conine grupri silanol SiOH, care, n contact cu tamponul, se disociaz n grupri SiO - , imprimnd peretelui capilar o sarcin negativ (Figura 2). Cnd capilarul este umplut cu tampon, sarcinile sale pozitive sunt atrase de peretele ncrcat negativ. Rezult o diferen de potenialpH nalt

Computer Detector

Rezervor cu tampon de cltire

Capilar

Tampon Proba

Tampon Rezervor gol

pH sczut

Figura 1. Schema principalelor componente ale unei instalaii de electroforez capilar1

Figura 2. Deprotonarea gruprilor silanol de pe peretele capilarului 1

90


(potenial zeta) limitat la peretele capilar. Aplicndu-se voltajul de-a lungul capilarului, cationii din stratul difuz sunt liberi s migreze spre catod, transportnd i masa de soluie dup ei. Acest flux lichid, avnd ncrctura suprafeei peretelui interior al capilarului, ce se suprapune peste mobilitatea substanelor de analizat, constitue fluxul electroosmotic sau electroendoosmotic. Mobilitatea fluxului endoosmotic este strns legat de potenialul zeta, iar factorii ce l influeneaz pe acesta din urm evolueaz n acelai sens i pentru primul parametru. Astfel, exist o direct proporionalitate cu pH-ul (cnd acesta crete, potenialul zeta crete datorit ncrcturii suprafeei peretelui capilar, iar fluxul electroosmotic crete, de asemenea, datorit deprotonrii gruprilor silanol) i o dependen invers de punctul izoelectric a tamponului (cnd acesta crete, potenialul zeta scade datorit dublului strat ce se comprim, fluxul electroosmotic reducndu-se). La moleculele mari (peptide, proteine) se poate ca reziduurile sau solvitul s fie adsorbite n ntregime pe peretele capilar. Pentru a evita aceasta: se mrete concentraia tamponului;Profilul datorat fluxului electroosmotic

se folosesc extremele de pH; se cptuesc pereii capilarelor, eliminnd sau inversnd ncrctura lor sau se altereaz hidrofobicitatea lor. Fluxul electroosmotic determin o vitez constant pe toat lungimea capilarului. Profilul plat obinut n aceste condiii este superior celui obinut n cromatografia lichid de nalt performan, unde proba este mpins sub presiune n coloan. n cel din urm caz, viteza soluiei de la marginile coloanei este mai sczut fa de cea din mijlocul ei, aceasta conducnd la un profil parabolic i la o lrgire a bazei peak-urilor (Figura 3).

Etapele analizeiInjectarea probei Proba nu este mai mare de 100 nl (1020 l n HPLC), introducerea se face hidrodinamic sau electrocinetic. Condiiile de separare Capilarul este confecionat din silice topit, inert chimic, transparent pentru spectrul UV i vizibil, flexibil, robust i ieftin. Dimensiunile sale sunt : diametrul intern 20-200m; lungime 10 cm, excepional pn la 100 cm. Voltajul, cmpul electric i amperajul: V 10-30 kV; 100-500 V/cm; A pn la 300A. Detecia Absorbia n UV-vizibil este cea mai frecvent, se desfoar n domeniul sub 200 nm pn la vizibil. Timpul de rspuns trebuie s fie scurt (pn la 0,5 s, pentru a evita peak-urile largi, distorsionate). Analitul, trecnd prin sursa de lumin, absoarbe radiaia UV, ce se transform n semnal i evaluarea cantitativ se face prin calibrare. Fluorescena clasic i cea indus cu laser au ca avantaj limita de detectare extrem de joas. Moleculele se marcheaz cu fluorofori ce sunt excitai de sursa de lumin. Analiii, trecnd prin fereastra detectorului, determin excitarea fluoroforilor ce emit radiaii de o anumit

Profilul datorat fluxului hidrodinamic

Figura 3. Profilul plat datorat fluxului electroosmotic i profilul parabolic datorat fluxului hidrodinamic 1


91

lungime de und. n cazul fluoroforilor excitai de laser, sensibilitatea crete semnificativ. Din nefericire, prin laser se limiteaz lungimile de und pentru excitare la un numr mic de valori n domeniul vizibil. Spectrometria de mas, important prin sensibilitatea, selectivitatea i universalitatea sa, furnizeaz informaii asupra greutii moleculare i a structurii solvitului date utile identificrii sale. Pentru a obine acestea, electroforeza capilar se cupleaz cu ionizarea prin electropulverizare (ESI) i cu desorbia cu laser a matriei asistate (MALDI). Varianta mai modern folosit n prezent este CE MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorbtion/ionization time-of-flight) la care limita de detectare a atins domeniul sub-nanomolar.

Tipurile de electroforez capilarElectroforeza capilar zonal este cea mai utilizat, datorit simplitii i versatilitii sale. Capilarul se umple cu tampon i solviii migreaz n zone discrete, cu viteze diferite. Fluxul electroosmotic influeneaz timpul de migrare i rezoluia. Electroforeza capilar n gel Termenul de gel nu este foarte potrivit, acesta implicnd o structur oarecum solid. Ori, multe din gelurile folosite nu posed aceast proprietate; un termen mai potrivit ar fi reea de polimer. Dei exist o identitate a mecanismului de separare capilar cu cel al electroforezei clasice n gel, cmpul electric folosit n primul caz este de 10-100 ori mai intens i aparatura este automat. Posibilitatea n electroforeza clasic de a separa concomitent mai multe probe este compensat n electroforez capilar n gel cu timpul scurt necesar separrii unei singure probe. Focalizarea capilar izoelectric Moleculele au i grupri acide i bazice. La un anumit pH (punct izoelectric), ncrctura lor electric se echilibreaz i ele devin

neutre. Gradientul de pH se formeaz cu ajutorul unei soluii de amfolii, ce posed i grupare acid i bazic i un punct izoelectric de-a lungul unui domeniu larg. Cnd se aplic cmpul electric, amfoliii formeaz un gradient de pH, analiii migreaz prin mediu, pn ajung ntr-o zon cnd devin nencrcai atingnd propriul lor punct izoelectric. Pentru a detecta substanele separate, zonele sunt mobilizate (prin aplicarea unei presiuni capilarului sau adugarea unei sri la unul din rezervoare) i trec prin detector, care i nregistreaz n funcie de timp. Izotacoforeza capilar Izotacoforeza capilar analizeaz fie anioni, fie cationi. Toate zonele separate se deplaseaz cu aceeai vitez, folosind dou sisteme tampon: n frunte un electrolit cu un ion de mobilitate mai mare ca a solviilor, n urm un electrolit cu o mobilitate mai mic fa de a lor.

Aplicaii clinice3Proteine serice Electroforeza capilar a proteinelor serice a devenit o modalitate standard pentru studiul lor. Nu se folosete un colorant care implic afinitatea diferit dup tip pentru fraciunile electroforetice, posibila colorare incomplet, dependena de concentraia i vechimea reactivului, nu se ntrzie cu timpii de colorare, de decolorare i de scanare. Electroforeza normal6 n 7 minute separ, ntr-un traseu mai larg dect n cazul agarozei, mai multe fraciuni, cu detectarea prealbuminei sau a globulinei transportoare a hormonilor tiroidieni, transferinei, complementului. Pe acest tip de traseu se evit confundarea componenior mici din regiunea cu transferina sau cu lipoproteina ce se afl ntre zonele 2 i globulinice (Figura 4). De asemenea, spre deosebire de agaroz, care uneori nu permite migrarea de pe start a moleculelor mari, acestea constituind un artefact, electroforeza capilar include acele poteine pe start n zona , n felul acesta ele putnd fi evaluate.

92


Separarea componentului monoclonal2,4 prin electroforez capilar este net superioar fa de cea pe agaroz (Figura 5). Evaluarea sa se face fcnd s reacioneze serul cu cei 5 anticorpi de lanuri grele i uoare i comparnd electroforeza nainte i dup tratament. Tiparea componentului monoclonal rezult prin dispariia peak-ului caracteristic lanului greu i uor datorit cuplrii anticorpului corespunztor cu proteina specific. Detectarea componenilor monoclonali este total automatizat i rezultatele se pot stoca. Limitele de detecie sunt de 0,5-0,75 g/l. Lipoproteine Electroforeza capilar permite obinerea a 9 fraciuni. Hemoglobin Prin focalizare izoelectric capilar se

pot separa urmtoarele fraciuni: A, F, D, S, E, A2. Proteinele urinare 4,5 se pot separa prin electroforez capilar din urin neconcentrat sau concentrat de 200 ori, aceast determinare fiind de ajutor n diagnosticarea sindromului nefrotic i la detectarea proteinelor Bence Jones (Figura 6). n lichidul cefalorahidian se pot separa 2-microglobulina, mielina bazic, proteinele n urme din zona (2 peak-uri majore ce arat alterri ale sistemului nervos central) i din zona ; bandarea oligoclonal este marker n scleroza multipl. n lichidul sinovial se separ 1-glucoproteina acid (orosomucoid) care arat prezena glicoformelor. Extracte celulare din probe celulare foarte mici Se marcheaz extractul de celule HT 29

Albumin

2,63 gamma 2,91 complement c3 3,02 transferin

3,34 alpha-2 3,54 alpha-1 3,76 albumin

Complement Globuline Transferin 1 Antitripsin 2 Macroglobulin Pre-albumin

Figura 4. Electroforeza capilar zonal a unui ser normal 6

Figura 5. Electroforeza capilar ntr-o gammapatie monoclonal 4


93

Lanuri libere uoare

albumin

Timp de migrare (min.)

Figura 6. Electroforeza capilar urinar a lanurilor uoare libere (proteine Bence Jones) 4

parat Hb, anhidraza arbonic i HbA1c dintr-un eritrocit. Au mai fost separate prin electroforeza capilar lactatul i piruvatul dintr-un eritrocit i catecolaminele din celulele cromafine ale glandei suprarenale. n 1994 au fost separate izoenzimele LDH dintr-un eritrocit uman, subliniindu-se variabilitatea intracelular a izoenzimelor. Biologie molecular n 1990 Brownlee i colaboratorii au efectuat analiza fragmentelor de restricie ADN i a produilor PCR pentru detectarea HIV-1 din snge. De asemenea, electroforeza capilar a avut un aport n tipizarea virusurilor hepatitic C i poliomielitic. n 1994, Righetti i colaboratorii au folosit electroforeza capilar asociat cu PCR pentru diagnosticul bolilor genetice (fibroza chistic, boala Kennedy, hiperplazia adrenal congenital, sindromul Down). n 1998 s-a realizat un microdispozitiv de analiz ADN pentru integrarea funcional a electroforezei capilare cu PCR.

adenocarcinomatoase i volumul a 2,5 celule se analizeaz n 12 minute. De asemenea, electroforeza capilar se aplic n studii legate de eritropoetin, interleukina 3 i 6 i alte citokine. Analiza unei celule sau molecule constituie una din cele mai spectaculoase arii n care electroforeza capilar i-a dovedit utilitatea. Analiza unei celule ridic probleme: s-a selectat celula tipic din amestecul de celule ? cte celule trebuie msurate pentru a aprecia variaia natural? Totui, exist variaii mici ntre celule n ceea ce privete concentraia multor metabolii (sub 1mmol/l); volumul mic al celulei este suficient ns ca prob pentru electroforeza capilar. n 1990, Ewing i colaboratorii au separat serotonina i neurotransmitorii nrudii dintr-un neutron. n 1992, Yeung i colaboratorii au se-

Absorbana

ConcluziiElectroforeza capilar utilizeaz cantiti minime de prob, este cantitativ, automat i de aceea are un domeniu larg de aplicare. Cea mai important trstur a sa este faptul c are posibilitatea de a se cupla cu tehnici complementare de separare pentru a identifica proteine din sisteme biologice complexe i a elucida aspecte legate de structura i funcia fiecrei proteine separate. Faptul c necesit probe extrem de mici este considerat un instrument de explorare al chimiei spaiilor mici, dintre care un exemplu ar fi celula nsi. Electroforeza capilar constituie un important pilon al evoluiei viitoare a biochimiei moderne.

94


Bibliografie1. Altria K.D. Overview of capillary electrophoresis and capillary electrochromatography, J. Chromatogr. A., 1999; 856: 443-463 Bossuyt X., Separation of serum proteins by automated capillary zone electrophoresis, Clin. Chem. Lab. Med. 2003; 41(6): 762-772 Dolnik V. Recent developments in capillary zone electrophoresis of proteins, Electrophoresis 1999; 20: 3106-3115 Henskens Y.M.C., van Dieijen-Visser M.P.

5.

2. 3. 4.

6.

Capillary zone electrophoresis as a tool to detect proteins in body fluids: reproducibility, comparison with conventional methods and a review of the literature, Ned Tijdschr. Klin. Chem 2000; 25: 219-229. Kolios G., Bairaktari E, Tsolas O. et al. Routine Differential Diagnosis of Proteinurias by Capillary Electrophoresis, Clin. Chem. Lab. Med. 2001; 39(9): 784-88 Perrett D. Capillary electrophoresis in clinical chemistry, Ann. Clin. Biochem. 1999; 36: 133150

Electroforeza capilara

Documents

Transcript of Electroforeza capilara