OBIECTIVUL GENERAL 5. : Managementul durabil al resurselor genetice animale

Obiectivul specific 5.1: Ameliorarea genetică a populaţiilor de animale (rase, linii) cu status normal

Numărul/codul proiectului : ADER 5.1.3.

Denumirea proiectului: CUANTIFICAREA STATISTICO-INFORMAŢIONALĂ A

BIODIVERSITĂŢII LA RASELE DE OVINE CRESCUTE ÎN ROMÂNIA

CU AJUTORUL MARKERILOR GENETICI

PARTENERIContractor: Staţiunea de Cercetare-Dezvoltare pentru Creşterea Ovinelor şi Caprinelor

Popăuţi-Botoşani – Conducător proiect (CP)

Agent economic: Societatea Comercială AGRO IND COM SRL Botoşani – Partener 1 (P1)

Contract nr.: 5.1.3./22.10.2015

Anul începerii: 22.10.2015; Anul finalizării: 15.12.2018; Durata (luni): 38

Proiect ADER 5.1.3. / Faza 6

Data începerii fazei 6: 25.11.2017;

Data finalizării fazei 6: 30.04.2018

Buget: 62.500 lei (CP = 47.500 lei ; P1 = 15.000 lei)

Denumirea proiectului

CUANTIFICAREA STATISTICO-INFORMAŢIONALĂ A BIODIVERSITĂŢII

LA RASELE DE OVINE CRESCUTE ÎN ROMÂNIA CU AJUTORUL

MARKERILOR GENETICI

Obiectivul 1: Testarea şi validarea pe un eşantion de ovine din rasa Karakul

de Botoşani, Ţurcană şi Ţigaie a unui test genetic alternativ pentru detecţia mai

rapidă a genotipurilor de la locusul PRNP, asociate cu rezistenţa sau

susceptibilitatea la scrapie. Conceperea unui prototip de bază de date Excel cu

rezultatele obţinute;

Obiectivul proiectului:

Obiectivul 2: Testarea şi validarea pe un eşantion de ovine din rasa

Karakul de Botoşani a unui test genetic pentru determinarea filiaţiei

descendenţilor (identificarea parinţilor genetici, mama şi tata), prin analiza

microsateliţilor. Conceperea unui prototip de baza de date Excel cu rezultatele

obţinute.

Obiectivele fazei:

Principală ţintă a proiectului constă în identificarea unor markeri

genetici pentru realizarea unui management sustenabil al patrimoniului

genetic şi de conservare a biodiversităţii la specia ovină, utilizând

concepte de statistică informaţională.

Motivaţia şi scopul cercetării - Obiectivul 1

La ora actuală gestionarea eficientă a resurselor genetice ale populaţiilor autohtone de ovine

implică două aspecte esenţiale, pe de-o parte cunoaşterea genotipurilor care sunt asociate cu rezistenţa

sau suceptibilitatea la scrapie, respectiv cunoaşterea filiaţiei corecte a descendenţilor.

Scrapia la ovine este determinată genetic de polimorfismele din codonii 136, 154 şi 171,

localizaţi în exonul 3 al genei PRNP. În faza 5 a proiectului a fost testată o metodă de secvenţiere

directă a întregii regiuni codificatoare a genei PRNP de la ovine. Tehnica secvenţierii este extrem de

precisă şi informativă, dar implică o metodologie de lucru mai laborioasă.

Din acest motiv, scopul cercetărilor realizate în cadrul primului obiectiv din faza 6 a vizat

testarea unei metode alternative de genotipizare a ovinelor la locusul PRNP.

Motivaţia şi scopul cercetării - Obiectivul 2

Cunoaşterea filiaţiei reale la animalele de fermă reprezintă o problematică cheie în managementul

eficient al oricarei rase de animale. În cele mai multe cazuri problemele de filiaţie sunt legate de

necunoaşterea tatalui real (paternitatea), mai ales când în fermă sunt folosiţi mai mulţi reproducători

masculi, iar monta este liberă. Acest lucru poate duce la un management ineficient al fermei deoarece

moştenirea caracterelor de la parinţii genetici nu poate fi urmarită şi cuantificată corect. Metoda

consacrată pentru stabilirea filiaţiei este analiza unui panel de markeri ADN microsateliţi de la mama,

tata şi descendentul la care se doreşte a se stabili dacă parinţii prezumtivi sunt cei reali.

Scopul cercetărilor realizate în cadrul obiectivului 2 a fost acela de a testa o metodă de genotipare

bazată pe analiza unui panel infomativ de markeri microsateliţi care să permită stabilirea corectă pe

baza amprentei ADN a filiaţiei la ovine (identificarea mamei şi a tatalui genetic al unui anumit

descendent). Metoda se pretează şi pentru studiul diversităţii genetice a ovinelor autohtone.

Materiale şi metode (Obiectiv 1)Recoltarea probelor de sânge a fost realizată de la ovine din rasele Karakul de Botoşani,

Ţurcană şi Ţigaie. O parte dintre probe au fost recoltate de la un număr de 12 familii de ovine (36 de

indivizi) din rasa Karakul de Botoşani, pe cinci varietăţi de culoare (Figura 1). Fiecare familie a fost

compusă dintr-un berbec (tata - F), o femelă (mama - M) şi un descendent (O) de sex cunoscut. În

paralel au fost recoltate probe de la 9 indivizi (masculi şi femele) din rasa Ţurcană şi 13 (masculi şi

femele) din rasa Ţigaie. Probele de sânge au fost recoltate pe anticoagulant K3-EDTA.

Analiza codonilor 136, 154 şi 171 din gena PRNP prin metoda extensiei primerilor

Testul genetic a constat în amplificarea parţială a unui fragment de peste 300 de perechi de baze

(pb) din gena PRNP, din probele de ADN purificate de la ovinele luate în studiu, urmată de

reamplificarea de microsecvenţiere (extensia primerilor cu o nucleotidă) şi analiza în electroforeza de

capilaritate a ampliconilor obţinuţi. Testul permite detecţia polimorfismelor din codonii 136, 154 şi 171,

asociaţi cu rezistenţa sau susceptibilitatea la scrapie a ovinelor.

Figura 1. Masculi din rasa Karacul de Botoşani din

varietăţile alb, negru, roz, brumăriu şi sur de la a

care au fost recoltate probe biologice în vederea

genotipizării la locusul PRNP (obiectivul 1),

respectiv pentru efectuarea testului genetic de

filiaţie la unii dintre descendenţii lor prezumtivi

(obiectivul 2).

Materiale şi metode (Obiectiv 2)Ca material biologic de testare şi validare a metodei de stabilire a filiaţiei, au fost utilizate

probele de sânge recoltate anterior şi ADN purificat de la cele 12 familii de ovine pe varietăţi de

culoare (36 de indivizi) din rasa Karakul de Botoşani, folosite şi în experimentul de genotipare la

locusul PRNP descris la obiectivul 1.

Pentru generarea cu acurateţe a profilelor genetice ale indivizilor din cadrul aceleaşi familii cu

scopul stabilirii filiaţiei (identificarea parinţilor genetici, mama şi tata, unui anumit descendent), a

fost folosit un panel de 22 de markeri microsateliţi specifici ovinelor (CSRD247, D5S2, HSC,

INRA063, MAF65 1, McM527, SPS115, ILSTS011, INRA006, AE129, CP49 1, FCB20, MAF214

etc). Testul genetic constă în amplificare PCR a panelului de microsateliţi, urmat de analiza

ampliconilor în electroforeza de capilaritate pentru stabilirea mărimii alelelor.

Analiza bioinformatica a rezultatelor de genotipare pentru stabilirea filiaţiei a fost realizată cu

ajutorul programului Genotyper (Applied Biosystems). Datele de genotipare, conţinând mărimea

alelelor identificate la locii microsateliţilor analizaţi la fiecare individ, au fost integrate într-o bază de

date în format Excel.

Ampificarea panelului de markeri microsateliţi, analiza produşilor de amplificare în

electroforeza de capilaritate şi interpretarea rezultatelor

Fiecare dintre cele 12 familii de ovine din rasa Karakul de Botoşani au fost compuse dintr-o

femelă mamă, un berbec tată şi un descendent. Datele acestor descendenţi privind filiaţia prezumtivă

au fost colectate din fişele existente în fermă.

Verificarea electroforetică a calităţii şi specificităţii ampliconilor obţinuţi (conţinând cei trei

codoni de interes: 136, 154 şi 171) a evidenţiat prezenţa unui produs specific aşteptat de peste 300 pb

(Figura 2).

Figura 2. Ampliconi specifici de peste 300 pb obţinuţi prin

amplificarea parţiala a exonului 3 al genei PRNP de la ovinele

luate în studiu. L-100 pb ladder; CN-control negativ; F1=

familia 1, M=denumirea mamei în engleză; F=denumirea tatalui

în engleză; O=denumirea descendentului în engleză.

Analiza în electroforeza de capilaritate a reacţiilor de amplificare obţinute prin tehnica

extensiei primerilor, a permis identificarea la cei 58 de indivizi luaţi în studiu a celor patru

polimorfisme de interes din codonii 136 (C>T), 154 (G>A), respectiv din poziţiile 2 (G>A) şi 3 (G>T)

ale codonului 171, caracteristice celor cinci alele relevante de la locusul PRNP (Figura 3).

Figura 3. Rezultate obţinute prin tehnica extensiei primerilor evidenţiind poziţiile nucelotidice polimorfe din codonii

136, 154 şi 171 şi genotipurile corespunzătoare.

Rezultate şi discuţii - Obiectivul 1

Datele de genotipare ale fiecarui individ analizat au fost încărcate într-o bază de date în

format Excel. O parte din datele de genotipare obţinute la cele 58 de ovine analizate prin tehnica

extensiei primerilor sunt vizibile în Figura 4.

Figura 4. Date privind genotipurile obţinute la o parte dintre ovinele genotipate la locusul PRNP

prin tehnica extensiei primerilor.

Rezultate şi discuţii - Obiectivul 1

Pe baza datelor de genotipare obţinute prin tehnica extensiei primerilor au fost calculate

frecvenţelor genotipurilor de la locusul PRNP în eşantioanele din cele trei rase de ovine luate în

studiu (Karacul de Botoşani, Ţurcana şi Ţigaie). Indivizii au fost clasificaţi în mai multe clase de

risc conform nomenclaturii existente (Figura 5).

Figura 5. Date privind frecvenţele genotipurilor obţinute la ovinele genotipate la

locusul PRNP, evidenţiate pe clase de risc.

Rezultate şi discuţii - Obiectivul 1

Analiza rezultatelor de genotipare obţinute prin amplificarea unui panel de 22 de markeri

ADN microsateliţi localizaţi pe cromozomi diferiţi, a permis construirea unui baza de date în

format Excel. În ea au fost integrate datele de genotipare obţinute la cele 12 familii de ovine din

rasa Karacul de Botoşani luate în studiu (Figura 6).

Figura 6. Date privind genotipurile obţinute la o parte dintre cele 12 familii ovine din rasa Karacul genotipate

la cei 22 de loci microsateliţi, în vederea stabilirii filiaţiei pe baza amprentei ADN; F1= familia 1,

M=denumirea mamei în engleză; F=denumirea tatalui în engleză; O=denumirea descendentului în engleză.

Rezultate şi discuţii - Obiectivul 2

Pentru exemplificare vor fi analizate rezultatele obţinute la 7 familii şi vor fi luaţi în

considerare doar 5 din cei 22 loci microsateliţi genotipaţi (Figura 6). De exemplu, în cadrul familiei

1 (F1) de ovine din rasa Karacul, varietatea neagră, analiza amprentelor ADN ale microsateliţilor,

obţinute de la mama (F1-M) şi tata (F1-F) nominalizaţi ca fiind parinţii prezumtivi ai descendentului

F1-O, a evidenţiat faptul că aceştia sunt într-adevar parinţii lui genetici (Figura 9). O analiză

bioinformatică comparativă realizată suplimentar, în care toţi cei 12 masculi din rasa Karacul luaţi în

studiu au fost consideraţi taţi potenţiali ai decendentului F1-O, a evidenţiat faptul că un alt mascul

din varietatea neagră (F7-F) se califică 100% ca tată potenţial al descendentului F1-O. De fapt, acest

mascul figurează ca fiind tatăl ambilor descendenţi F1-O şi F7-O, de la el fiind recoltate două probe

de sânge distincte şi generate profilelele genetice pentru a verifica replicabilitatea rezultatelor.

Rezultate şi discuţii - Obiectivul 2

Un al doilea exemplu este cel al familiei 2 (F2) de ovine din rasa Karacul, varietatea brumărie,

în care analiza amprentelor ADN ale microsateliţilor obţinute de la mama (F2-M) şi tata (F2-F)

nominalizaţi ca fiind părinţi prezumtivi ai descendentului F2-O, a evidenţiat faptul că mama este

compatibilă cu profilului genetic al descendentului, dar tata nu se califică ca părinte genetic.

Descendentul F2-O este homozigot pentru microsatelitul INRA063, mărimea alelei prezente fiind de

183 pb. Una dintre aceste alele este moştenită de la mama F2-M. Tatăl prezumtiv F2-F al acestui

descendent nu se califică ca părinte genetic deoarece prezintă la acest locus 2 alele (de 187 pb,

respectiv 201 pb), care nu sunt prezente la descendent. Acelaşi raţionament este valabil şi în cazul

markerului SPS115 (Figura 6).

Concluzii

1. În cadrul obiectivului 1 a fost testată cu succes o metodă alternativă de genotipare la locusul

PRNP a ovinelor din rasele Karakul de Botoşani, Ţurcană şi Ţigaie. Metoda constă în amplificarea

parţială a unui fragment de aproximativ 300 perechi de baze din exonul 3, urmată de

microsecvenţiere (extensia primerilor cu o nucleotidă) şi detecţia ampliconilor obţinuţi în

electroforeza de capilaritate.

2. Folosind această metodă au fost identificate cu precizie într-o singură reacţie PCR multiplex

cele patru tipuri de polimorfisme nucleotidice de interes din codonii 136 (C>T), 154 (G>A),

respectiv din poziţiile 2 (G>A) şi 3 (G>T) din codonul 171. Metoda poate fi folosită pentru

genotiparea cu acurateţe a mutaţiilor din cei trei codoni de interes (136, 154 şi 171), asociaţi cu

rezistenţa sau susceptibilitatea ovinelor la scrapie.

3. În cadrul obiectivului 2 a fost testată cu succes, pe un număr de 12 familii de ovine din rasa

Karacul de Botoşani (patru din varietatea neagră, trei din varietatea brumărie, una din varietatea

albă, două din varietatea roz şi două din varietatea sur), o metode de confirmare a filiaţiei pe baza

amprentei ADN generată cu ajutorul a 22 de markeri microsateliţi specifici ovinelor.

4. Amprenta ADN generată pentru fiecare individ în parte, organizaţi pe familii conform fişelor de

montă, a evidenţiat faptul că toate mamele (M1-M12) din cele 12 familii (F1-F12) de ovine din

rasa Karacul de Botoşani s-au calificat ca mame genetice ale descendenţilor nominalizaţi.

5. În cazul berbecilor, doar 3 dintre cei 12 masculi au fost excluşi ca taţi potenţiali ai

descendenţilor nominalizaţi, restul de 9 fiind taţii genetici reali, în concordanţă cu fişele de montă.

Procentul de taţi incompatibili nu a fost mare, având în vedere condiţiile de management

reproductiv mai dificil în cazul ovinelor.

6. Metoda folosită pentru stabilirea filiaţiei s-a dovedit o unealtă extrem de utilă, care ar putea

contribui substanţial la un management mai bun al reproducţiei în fermele de ovine şi implicit în

munca de ameliorare pentru consolidarea unor caractere de interes, de exemplu în cazul rasei

Karacul pentru ameliorarea calităţii comerciale a pielicelelor printr-o mai bună potrivire a

perechilor.

7. Pe lângă aplicabilitatea lor în stabilirea filiaţiei, aceşti markeri microsateliţi pot fi folosiţi cu

succes în studii de evoluţie, de filogenie, în estimarea indicilor de diversitate genetică în cadrul

populaţiilor, raselor sau speciilor, în calcularea gradului de consangvinizare sau în stabilirea

distanţelor genetice între rasele de animale (de exemplu între rase sau varietăţi de ovine

autohtone).

Concluzii