electroforeza

1

ELECTROFOREZAELECTROFOREZA

© UMF Cluj - Radu Oprean 22005 - 2006

Principiul generalPrincipiul general

mişcarea diferenţiată a speciilor mişcarea diferenţiată a speciilor chimice încărcate electric (a ionilor) chimice încărcate electric (a ionilor) prin atracţie sau respingere întrprin atracţie sau respingere într--un un câmp electric, în funcţie de raportul câmp electric, în funcţie de raportul sarcinsarcinăă/ma/massăă

v = µv = µee · E· E

unde µunde µee este mobilitatea electroforetic este mobilitatea electroforetică ă a a speciei chimice. speciei chimice.


Factori care afecteazFactori care afectează ă mobilitatea particulelor mobilitatea particulelor

mmăărimea şi semnalul sarcinii rimea şi semnalul sarcinii analituluianalituluinatura suportuluinatura suportuluisuprafaţa interioară a porilor suprafaţa interioară a porilor suportuluisuportuluitensiunea aplicattensiunea aplicatăănatura şi concentraţia electrolitului natura şi concentraţia electrolitului suport (soluţiilor tampon)suport (soluţiilor tampon)forţa ionică a soluţiei de forţa ionică a soluţiei de analitanalit şi şi pHpHacesteiaacesteiatemperatura şi vâscozitatea soluţieitemperatura şi vâscozitatea soluţiei

2


Tehnici electroforeticeTehnici electroforetice

Electroforeza în mediu liber (frontală)Electroforeza în mediu liber (frontală)Electroforeza în mediu stabilizant (zonală) Electroforeza în mediu stabilizant (zonală) –– întrîntr--un mediu fixat pe un suport porosun mediu fixat pe un suport poros

electroforeza la tensiune joaselectroforeza la tensiune joasă ă sau înaltă în medii:sau înaltă în medii:inerte (a inerte (a ccăăror interacţiune cu particulele care ror interacţiune cu particulele care migreazmigrează ă este neglijabileste neglijabilăă))care participcare participă ă activ în separare (activ în separare (intercaţioneazăintercaţioneazăcuparticolelecuparticolele care migreaz care migreazăă))

imunoelectroforezaimunoelectroforezaelectroforeza de afinitate electroforeza de afinitate electroforeza cu focalizare izoelectricelectroforeza cu focalizare izoelectricăăelectroforeza cuplatelectroforeza cuplată ă cu cromatografia cu cromatografia (electroforeza în strat subţire)(electroforeza în strat subţire)izotacoforezaizotacoforeza (electroforeza de afinitate)(electroforeza de afinitate)


Electroforeza zonalElectroforeza zonală ă (ZE)(ZE)

Catod

Anod

rA

rB

m

m

pH =

con

st.

+

-


Focalizarea izoelectricFocalizarea izoelectrică ă (IEF)(IEF)

3


IzotacoforezaIzotacoforeza (ITP)(ITP)

ElectroforezaElectroforezaccapilarapilară ă (CE)(CE)


InstrumentaţiaInstrumentaţia

electrod electrod

tampontampon

sursă de curent

probă

capilarăachiziţie şi

prelucrare datedetector

4


Separarea Separarea analiţiloranaliţilor


Caracteristicile electroforezei Caracteristicile electroforezei capilarecapilare

selectivitate diferitselectivitate diferită ă faţă de metodele faţă de metodele cromatograficecromatograficeprecizie şi sensibilitate mai redusă precizie şi sensibilitate mai redusă faţă de HPLCfaţă de HPLCposibilitposibilităăţi limitate în domeniul ţi limitate în domeniul preparativpreparativvolume mici de probvolume mici de probăăconsum redus de solvenţi şi tamponconsum redus de solvenţi şi tamponinstrumentaţie simplăinstrumentaţie simplădezvoltarea rapiddezvoltarea rapidă ă a metodelora metodelor


Fluxul electroosmotic (EOF)Fluxul electroosmotic (EOF)

Ionii pozitivi sunt atraşi de sarcinile Ionii pozitivi sunt atraşi de sarcinile negative ale capilarei (negative ale capilarei (SiOSiO--) şi ) şi creeazcreează ă o diferenţă de potenţial în o diferenţă de potenţial în imediata vecinimediata vecinăătate a peretelui, tate a peretelui, potenţial numit potenţial numit zetazeta (ζ). (ζ). La aplicarea unei tensiuni la capetele La aplicarea unei tensiuni la capetele capilarei, cationii din dublul strat capilarei, cationii din dublul strat electric sunt atraşi spre catod. electric sunt atraşi spre catod. AceastAceastă ă mişcare antrenează cu ea mişcare antrenează cu ea întreaga soluţie.întreaga soluţie.

5


ProfilProfiluriuri dde e eluţieeluţie

Flux electroosmoticFlux electroosmotic

Profil Profil paraboliparabolicc


MobilitMobilitateaatea eelectrolectroforeticforeticăă

qq:: sarcina net sarcina netă ă a speciei chimicea speciei chimiceηη:: vvîîscoscozitateazitatea solusoluţţieiieirr:: rarazaza efectiefectivvăă (Stokes) (Stokes) a speciei a speciei

solvatatesolvatate

r . . . 6q

ep ηπµ =


MigraMigrarearea eelectrolectroffororeetiticcăă

µµepep:: mobilitmobilitateaatea eelectrolectroffororeetiticcăăE:E: ccââmpmp eelectrilectriccV:V: voltavoltajj apliaplicatcatL:L: llungimeaungimea totaltotalăă aa capilcapilareiarei

LV

. E . v epep µµ ==

6


ViteVitezaza de de migramigrarere

( ) ( )LV

. E . v eoepeoep µµµµ +=+=

în prezenţa fluxului electroosmoticîn prezenţa fluxului electroosmotic


Variabilele care influenţează Variabilele care influenţează EOF (1)EOF (1)

•• forforţţa ionica ionică ă mare mare genereazgenerează ă un curent un curent puternic puternic şşi i îîncncăălzirelzire

•• poate conduce la picuri poate conduce la picuri distorsionate dacdistorsionate dacă ă conductivitatea diferconductivitatea diferă ă de de cea a probeicea a probei

Scade potenScade potenţţialul ialul zetazeta şşi i EOF cândEOF când este crescut este crescută ă forforţţa ionica ionicăă

ForForţţa ionica ionică ă sau sau concentraconcentraţţia ia solusoluţţiei iei tampontampon

•• cea mai folositcea mai folosită ă metodmetodă ă de modificare a EOFde modificare a EOF

•• poate modifica sarcina poate modifica sarcina sau structura sau structura solutuluisolutului

EOF scade la EOF scade la pHpH micmicEOF creEOF creşşte la te la pHpH maremare

pHpH--ululsolusoluţţiei iei tampontampon

•• scscăăderea poate conduce derea poate conduce la scla scăăderea rezoluderea rezoluţţiei iei şşi i eficieneficienţţeiei

•• cu crecu creşşterea poate rezulta terea poate rezulta o o îîncncăălzirelzire

Modificarea proporModificarea proporţţionalională ă a EOFa EOF

Câmpul Câmpul electricelectric

ObservaObservaţţiiiiRezultatRezultatVariabilaVariabila


Variabilele care influenţează Variabilele care influenţează EOF (2)EOF (2)

••scade EOF prin protejarea scade EOF prin protejarea sarcinii peretelui sarcinii peretelui şşi crei creşşte te vâscozitateavâscozitatea

Se adsorb pe peretele Se adsorb pe peretele capilarei prin interaccapilarei prin interacţţiuni iuni hidrofobehidrofobe

Polimeri Polimeri neutri neutri hidrofilihidrofili

••detergendetergenţţii ii anionicianionici pot pot crecreşşte EOFte EOF••detergendetergenţţii cationici pot ii cationici pot scscăădea sau chiar inversa EOFdea sau chiar inversa EOF••poate modifica poate modifica selectivitateaselectivitatea

Se adsorb pe peretele Se adsorb pe peretele capilarei prin interaccapilarei prin interacţţiuni iuni hidrofobe sau ionicehidrofobe sau ionice

DetergenDetergenţţii

••modificmodificăări complexeri complexe••poate modifica poate modifica selectivitateaselectivitatea

Scade potenScade potenţţialul ialul zetazeta şşi i vâscozitatea (de obicei vâscozitatea (de obicei scad EOF)scad EOF)

Modificatori Modificatori organiciorganici

••folositoare folositoare îîn cazul n cazul controlului automat de controlului automat de temperaturtemperaturăă

ModificModifică ă vâscozitatea cu vâscozitatea cu 22--3%3% // ooCC

TemperaturaTemperatura

ObservaObservaţţiiiiRezultatRezultatVariabilaVariabila

7


Tipuri de CETipuri de CE

+

- -+ VeoVep

+ -

+ -Veo

XVmic

+ -VeoX

ElectroforezElectroforeză ă capilarcapilară ă zonalzonalăă(CZE)(CZE)

ElectroforezElectroforeză ă capilarcapilară ă pe gel pe gel (CGE)(CGE)

Cromatografie electrocineticCromatografie electrocinetică ă micelarmicelarăă (MEKC)(MEKC)

Electrocromatografie capilarElectrocromatografie capilară ă (CEC)(CEC)


Electroforeza capilarElectroforeza capilară ă zonalzonală ă (CZE)(CZE)

+- -+ Veo

Vep

fluxul electroosmotic (EOF)fluxul electroosmotic (EOF)

dubldublulul strat electricstrat electric

ionii se deplaseazionii se deplasează ă în tamponîn tampon

VVxx = = VVeoeo + + VVepep


Electroforeza capilarElectroforeza capilară ă zonalzonală ă (CZE)(CZE)

8


OrdOrdineainea de de migramigrarere pentrupentru cationcationii(+), (+), neutriineutrii (o) (o) şi şi anionanionii ((--))

Efectul cumulativ al mobilitEfectul cumulativ al mobilităăţii ţii electroforetice şi EOF către catodelectroforetice şi EOF către catod

Efectul netEfectul net

µµ++

µµeoeo

µµ--

++00––


ElectroforezElectroforeză ă capilarcapilară ă pe gel pe gel (CGE)(CGE)

Ionii mai voluminoşi se deplasează Ionii mai voluminoşi se deplasează mai lentmai lent

+ -

Efectul Efectul retardantretardant al geluluial gelului


Cromatografie electrocineticCromatografie electrocinetică ă micelarmicelarăă (MEKC)(MEKC)

+-

t0

µeoµep, MCµeo µMC

tR tMC

9


MMeetodetode de de ddeetectecţţiiee

foartefoarte sensiblsensiblăănecesitnecesită ă o o derivatizarederivatizare

a probeia probeipreţ ridicatpreţ ridicat

1010--1414 –– 1010--1616

1010--1818 –– 1010--2020FluorimFluorimeetrie (trie (cu cu surssursă ă laser laser -- LIFLIF))

sensibsensibililnecesitnecesită ă o o derivatizarederivatizare

a probeia probei

1010--77 –– 1010--991010--1515 –– 1010--1111FluorimFluorimeetrietrie

universuniversalalddeetecttectoorrulul cu şircu şir de de

diode permdiode permiittee obţinerea obţinerea spectrelorspectrelor

1010--55 –– 1010--881010--1313 –– 1010--1515SpectroSpectroffotomotomeetrie trie UV_VisUV_Vis

AvantaAvantajeje/ / inconvinconveenientnientee

LimitLimitee de de ddeetectecţie ţie ((moli/Lmoli/L)*)*

LimitLimitee de de ddeetectecţieţie((molmolii))

MMeetodtodaa

* pentru un volum injectat de 10 nl


MMeetodetode de de ddeetectecţţiie (2)e (2)

universuniversalalnecesitnecesită ă modificarea modificarea

aparaturiiaparaturii

1010--77 –– 1010--881010--1515 –– 1010--1616ConductConductoommeetrietrie

sensibsensibililutil pentru specii util pentru specii

redoxredoxnecesitnecesită ă modificarea modificarea

aparaturiiaparaturii

1010--1010 –– 1010--11111010--1818 –– 1010--1919AmpAmpeeromromeetrietrie




MMeetodtodaa



MMeetodetode de de ddeetectecţţiie (3)e (3)

sensiblsensiblăă şişi ofofererăăinformainformaţiiţii structuralestructurale

interfainterfaţăţă îîntrentre CE CE şişiMS MS complicomplicatcatăă

1010--88 –– 1010--991010--1616 –– 1010--1717SpectromSpectromeetrie de trie de masmasăă

AAltelte metodemetode::radioactivitradioactivitateate, , lentilelentile termitermicce, e, rreefractomfractomeetrie, trie, dicrodicroiismsm circulacircularr

universuniversalalăăsensibilitsensibilitateate mai mai

scscăăzutzută ă decât alte decât alte metodemetode

10 10 –– 100 100 mai mai scscăăzutzută ă ca şi ca şi la metoda la metoda directdirectăă

DDeetectitectiaa indirectindirectăăUVUVfluorimfluorimeetritriccăăampampeeromromeetritriccăă




MMeetodtodaa


electroforeza

Documents

Transcript of electroforeza