1

DIAGNOSTICUL DE LABORATORAL INFECTIILOR STAFILOCOCICE

Familia Micrococcaceae cuprinde genurile Staphylococcus, Micrococcus, Stomatococcusºi Planococcus.Genul Staphylococcus conþine mai multe specii microbiene, dintre care de interesmedical sunt S. aureus (specie patogenã), S. epidermidis, specie accidental patogenã,S. schleiferi, S. lugdunensis, S. haemolyticus, S. saprophyticus, specie cu potenþial patogenredus etc.Stafilococii sunt coci gram pozitivi, aerobi ºi facultativ anaerobi, nesporulaþi, rotunzi,dispuºi în grãmezi, sub formã de ciorchine de strugure.10.1. Staphylococcus aureusSemnificaþia clinicã. S. aureus, germen condiþionat patogen, este cauza unor infecþiide gravitate variabilã, cu diverse localizãri, în funcþie de poarta de intrare:» cutanate ºi subcutanate: foliculite, furuncule, impetigo, orgelet, hidrosadenite,panariþii, mastite, carbuncule;» ale mucoaselor: otite, sinuzite, pneumonii etc.;» ale þesutului osos ºi articular: osteomielite, artrite septice;» ale aparatului urinar: cistite, prostatite, pielonefrite, abcese renale;» ale aparatului cardio-vascular: endocardite, flebite , septicemii;» ale aparatului digestiv: toxiinfecþii alimentare;» ale aparatului genital: metrite, anexite;» ale SNC: meningite, abces cerebral;» infecþii nosocomiale.Diagnosticul de laborator al infecþiilor produse de S. aureus este bacteriologic, celserologic neavând valoare practicã.Recoltarea. Produsele patologice sunt variate, în funcþie de localizarea infecþiei:» în infecþiile cutanate ºi osteomielitã produsul patologic este puroiul, a cãruirecoltare se efectueazã în raport cu colecþia purulentã. Dintr-o colecþie închisã,prelevarea puroiului se face de cãtre chirurg, dupã deschiderea colecþiei. Dincolecþiile deschise sau fistulizate recoltarea se face cu un tampon steril;» în infecþiile purulente ale seroaselor, produsele patologice (lichidul pleural, articular,cefalo-rahidian) sunt prelevate prin puncþionarea cavitãþilor respective cu oseringã sterilã ºi introduse apoi în eprubete sterile;» în infecþiile urinare se practicã urocultura;» în septicemii se recolteazã sângele;» în toxiinfecþii alimentare se recolteazã materiile fecale, vãrsãturi, resturi alimentare;» în angine ºi la purtãtorii sãnãtoºi se recolteazã exudatul nazal ºi faringian.Recoltarea produselor patologice se face înaintea începerii oricãrui tratament cuantibiotice.Examenul direct. Examenul macroscopic evidenþiazã un puroi galben cremos iarexamenul microscopic pe frotiuri colorate Gram, efectuate din puroi, relevã în primulrând prezenþa leucocitelor, din care majoritatea sunt distruse ºi coci sferici cu diametrulde 0,5-1 μm, gram pozitivi, dispuºi în grãmezi (ciorchine), în perechi sau izolat, intraºi extracelular.Izolarea se face diferenþiat în funcþie de provenienþa produsului patologic:» cele provenite din colecþii închise sau cele care nu sunt puternic contaminate(exudatul faringian, de pildã) sunt însãmânþate direct pe gelozã-sânge de oaie5%. Produsele puternic contaminate (materii fecale) se cultivã iniþial pe mediulde îmbogãþire hiperclorurat Chapman lichid. Dupã o incubare de 12-18 ore la37°C se face trecerea pe mediul de izolare Chapman solid, mediu care princonþinutul sãu în manitol ºi indicator de pH diferenþiazã coloniile manitolpozitive(de culoare galbenã) de cele manito-negative (roz);

2

» sângele pentru hemoculturã se recolteazã conform tehnicii obiºnuite ºi seînsãmânþeazã în 100 ml bulion simplu, la care se adaugã substanþe ce anihileazãacþiunea antibioticelor, în situaþia în care acestea au fost administrate dejabolnavului. Din bulion se fac treceri pe gelozã sânge.Identificarea se face pe baza caracterelor morfotinctoriale, culturale ºi a unor testede patogenitate. În scop epidemiologic, diagnosticul se completeazã cu lizotipia.Caractere morfotinctoriale. Pe frotiurile din culturi se vãd coci gram pozitivi cu aºezarecaracteristicã, în grãmezi.Caractere culturale. Pe gelozã sânge S. aureus produce colonii caracteristice uºor derecunoscut. Ele sunt colonii de tip S, mari, cu diametru de 1-3mm, rotunde, bombate,netede, cu margini regulate, hemolitice ºi pigmentate. Coloniile tinere sunt incolore.Pigmentarea coloniilor mature se face în prezenþa oxigenului ºi la temperatura camerei.Cel mai frecvent pigment este cel auriu (80%), apoi alb ºi foarte rar citrin. Pentrustabilirea apartenenþei la specia S. aureus se fac teste de patogenitate, din careevidenþierea coagulazei este obligatorie.Teste de patogenitate in vitro» hemolizinele se evidenþiazã pe gelozã-sânge. Stafilococul elaboreazã 5 tipuri dehemolizine, dintre care mai importante sunt hemolizina α, ce produce o zonãde lizã clarã în jurul coloniilor, ºi hemolizina β, care determinã o zonã de lizãincompletã, tulbure, net delimitatã ce se clarificã dupã 12 ore la +4°C;95» coagulaza: S. aureus secretã douã coagulaze, una legatã, numitã ºi “clumpingfactor” ºi coagulaza liberã. Ele se evidenþiazã prin:› tehnica pe lamã pentru coagulaza legatã - “clumping factor”. Pe o lamã sepune o picãturã de apã distilatã, un inocul din cultura de stafilococ de pegelozã sânge, o picãturã de plasmã ºi se omogenizeazã. Testul este pozitivdacã dupã 1-2 minute apare aglutinarea;› tehnica în tuburi (pentru coagulaza liberã): se recolteazã 9 ml sânge de iepurepe 1 ml soluþie de oxalat de potasiu 2%. Plasma obþinutã se dilueazã 1/10 cuser fiziologic steril, repartizându-se câte 1 ml în tuburi sterile, peste care seadaugã cîte 3 picãturi dintr-o culturã de 18 ore în bulion sau o ansã dincultura de pe gelozã-sânge. Tuburile se introduc în termostat la 37°C,examinându-se din 30 în 30 minute. Testul este pozitiv dacã plasmacoaguleazã în primele 4 ore;» fibrinolizina: se face un amestec format din 7 pãrþi gelozã ºi o parte plasmãoxalatatã care se þine 5 minute la 56°C, apoi se toarnã în plãci petri în strat de4 mm. Pe acest mediu se însãmânþeazã stafilococi pe arii mici ºi se incubeaazãtimp de 24 ore la 37°C. Dacã tulpina elaboreazã fibrinolizinã, în jurul coloniilordezvoltate va apare o zonã clarã;» fermentarea manitolului: pe mediul Chapman solid, stafilococii manito-pozitiviproduc virarea culorii mediului din roz în galben datoritã indicatorului de pH.Lizotipia este o metodã de testare a sensibilitãþii tulpinilor microbiene la bacteriofagi.Întrucât între tulpini ºi bacteriofagi existã o specificitate strictã, determinarealizotipurilor este de interes epidemiologic, deoarece stã la baza filiaþiei cazurilor.Sensibilitatea la antibiotice. Începând deja cu anii 1950-60 a fost semnalatã ocreºtere rapidã a rezistenþei tulpinilor S. aureus la antibiotice, efectuarea antibiogrameidevenind obligatorie pentru toate tulpinile de S.aureus izolate din diverse infecþii.Rezistenþa se instaleazã fie prin producerea beta-lactamazelor, fie prin modificareaunor proteine ale peretelui celular. Al doilea mecanism duce la scãderea permeabilitãþiiînveliºurilor bacteriene ºi modificarea þintei antibioticului în aºa fel încât acesta sã nuse mai poatã lega de structurile bacteriene respective. Acest tip de rezistenþã conferãtulpinilor de stafilococ, mai ales celor din spital (deci cu mare potenþial nosocomial)rezistenþa la toate beta-lactaminele (peniciline ºi cefalosporine). Depistarea acestorstafilococi se face prin testarea sensibilitãþii la meticilinã, rezistenþa la acest antibiotic(MRSA = Methicilin resistent S. aureus) semnificând rezistenþã la toate betalactaminele.

3

Diagnosticul toxiinfecþiilor alimentare. Toxiinfecþiile alimentare date de stafilococse produc prin ingerarea unui aliment contaminat cu S. aureus enterotoxic. Diagnosticulse bazeazã pe izolarea din alimente ºi din produsele patologice (vãrsãturi, fecale) aacestuia ºi evidenþierea enterotoxinei care are 6 tipuri antigenice A, B, C, C1, D, E.Însãmânþarea produselor patologice se face pe mediul Chapman solid, iar coloniilemanito-pozitive se repicã pe gelozã. Izolarea stafilococilor din produsele menþionatenu are valoare decât dacã se evidenþiazã enterotoxina care se tipizeazã. Mai frecventîntâlnite sunt serotipurile A ºi D.Enterotoxinele se evidenþiau în trecut in vivo printr-o boalã experimentalã la pisicitinere, numitã testul Dolman. În principiu, se injecta intraperitoneal la pisici tinerefiltrat de culturã de stafilococ. Dacã în filtrat era prezentã enterotoxina, animalulprezenta diaree ºi vãrsaturi, semne ce se amendau în câteva ore.In vitro, enterotoxina se evidenþia pe baza proprietãþii ei de a precipita plasmaoxalatatã. Concomitent cu cercetarea fibrinolizinei se poate observa un inel de precipitare,independent de haloul clar din jurul culturii care rezultã ca urmare a acþiuniifibrinolizinei.Astãzi determinarea enterotoxinelor stafilococice se face prin metoda latex-aglutinãrii(aglutinare pasivã inversã). Pentru efectuarea testului se utilizeazã seruri cu anticorpiantitoxici A, B, C, C1, D ºi E adsorbiþi pe particule de latex ce se pun în contact cuantigenul solubil (enterotoxina) extras dintr-un filtrat de culturã lichidã. Reacþiapozitivã se manifestã prin apariþia aglutinãrii.Stafilococii coagulazo-negativiSemnificaþia clinicã. S. epidermidis, comensal obiºnuit al tegumentelor umane,devine accidental patogen, fiind implicat în etiologia endocarditelor subacute lapacienþii cu proteze valvulare cardiace sau în urma altor intervenþii pe cord, cândbacteria poate fi antrenatã de pe tegumente în þesuturile profunde. De asemenea, înurma unor puncþii lombare poate produce meningite. Este germenele care compromitecel mai frecvent protezele de sold.S. schleiferi ºi S. lugdunensis colonizeazã materialele de implant, catetere, tuburi dedren. Ambele speciile se gãsesc rar ºi în cantitate micã pe tegumentele sãnãtoase.S. lugdunensis este responsabil de producerea unor infecþii severe: endocardite pevalvele naturale ºi pe protezele valvulare, septicemii, abcese cerebrale, infecþii profundeale þesuturilor, osteite, osteo-artrite cronice, infecþii vasculare protetice, infecþii aleplãgilor ºi tegumentelor. S. schleiferi apare mai puþin frecvent în mediul spitalicesc ºiare un rol mai scãzut în infecþiile umane. Germenele a fost izolat în cazuri de empiemcerebral, infecþii ale plãgilor ºi osteite cu bacteriemie.S. haemolyticus, al doilea ca frecvenþã dintre speciile coagulazo-negative, poate fiimplicat în endocardite valvulare, septicemii, peritonite, infecþii ale tractului urinar ºiale plãgilor.S. saprophyticus determinã infecþii ale tractului urinar la femei tinere active sexual.Stafilococii coagulazo-negativi sunt luaþi în considerare numai în cazul în caresunt izolaþi ca florã predominantã sau în culturã purã din urinã, LCR, lichid sinovial,hemoculturi (adicã din produse în mod natural sterile). Identificarea acestor stafilococise face pe baza unor teste biochimice ºi de patogenitate