Determinarea activităţii catalazei sangvineMetoda Bach-Zubkova

Catalaza este o oxidoreductază răspândită în celulele animale şi vegetale şi care îndeplineşte o funcţie importantă în fenomenele de oxidoreducere celulară şi anume descompunerea apei oxigenate:

2 H2O2 = 2 H2O + O2

Catalaza este o enzimă cu o înaltă specificitate şi foarte activă, descompunând la 0 0C, timp de un minut, un număr de 2,6 milioane moli apă oxigenată.

Principiul metodei Are la bază dozarea excesului de apă oxigenată rămasa nedescompusă,

după întreruperea acţiunii catalazei, prin titrare cu o soluţie de permanganat de potasiu în mediu acid:

5 H2O2 + 2 KMnO4 + 4 H2SO4 = 2 MnSO4 + 2 KHSO4 + 8 H2O + 5 O2

Determinarea activităţii catalazice se face prin diferenţa între cantitatea de KMnO4 utilizată înainte şi după acţiunea enzimei asupra apei oxigenate.

ReactiviSoluţie H2O2 1% proaspăt preparată din perhidrol; soluţie acid sulfuric 10%;

soluţie permanganat de potasiu 0,1 N.

Mod de lucruPentru determinarea activităţii catalazice se foloseşte sânge diluat 1/1000.

În două baloane Erlenmeyer se măsoară câte 1 ml sânge diluat şi 7 ml apă distilată. Unul din baloane, care constituie proba martor se fierbe 3-5 minute pentru inactivarea catalazei, apoi se răceşte. În ambele probe se adaugă 2 ml H2O2 soluţie 1% agitându-se bine. Ambele probe se introduc pentru 30 minute într-o baie de apă la 17 0C, timp în care se observă degajarea bulelor de oxigen în proba cu enzimă datorită descompunerii apei oxigenate de către catalază, pe când în proba martor, în care catalaza a fost inactivată prin fierbere, această degajare nu se observă. Se adaugă în fiecare probă 5 ml soluţie H2SO4 10% în scopul blocării reacţiei de descompunere a apei oxigenate de către catalază. Probele se titrează apoi cu o soluţie de permanganat de potasiu 0,1 N până la apariţia culorii roz pal persistentă 30 secunde.

Calcul

Activitatea catalazică este dată de indicele catalazic, care reprezintă numărul de miligrame H2O2 descompusă de 0,1 ml sânge în decurs de 30 minute.Pentru calcul se utilizează următoarele notaţii:

n1 = ml soluţie KMnO4 0,1 N folosiţi la titrarea probei martor;n2 = ml soluţie KMnO4 0,1 N folosiţi la titrarea apei oxigenate rămasă nedescompusă din proba cu enzimă.

Calculul se face având în vedere că 1 ml soluţie KMnO4 0,1 N este echivalent cu 1 ml soluţie H2O2 0,1 N. În acest caz diferenţa n1 – n2 reprezintă numărul de ml H2O2 0,1 N descompuşi de către catalaza sangvină.

Deoarece 1 ml soluţie H2O2 0,1 N corespunde la 1,7 mg H2O2, activitatea catalazei exprimată în mg H2O2 descompuse în 30 minute va fi egală cu :

1,7 ∙ (n1 – n2).