Standardizarea proprietatilor antioxidante ale mierii printr-o combinare de teste spectofotometrie/fluorimetrie si chemometrie

Abstract

Scopul lucrarii a fost de a stabili o baza solida de informatii analitice pentru definirea/standardizarea proprietatilor antioxidante ale mierii. Mai intai am cercetat capacitatea antioxidanta/radicala a 14 mieri comerciale de origine florala si geografica diferite folosind un cumul de teste spectrofotometrice: testul Folin-Ciocalteu pentru continutul fenolic (PC), capacitatea antioxidanta prin reducerea ionului fier ( testul FRAP) pentru activitatea antioxidanta totala, testul 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH)pentru activitatea antiradicala, absorbanta: 450 pentru intensitatea culorii si o metoda fluorimetrica: ORAC, capacitatea antioxidanta de a reactiona cu oxigenul pentru activitatea antiantilipoperoxidanta. Apoi date de la proceduri diferite au fost comparate si analizate prin tehnici multivariate (analizele componentilor principali). Corelatii semnificative au fost obtinute pentru toti markerii antioxidanti, cu proprietatile antioxidante corelate, strict, de continutul fenolic si de intensitatea culorii mierii. PCA a gasit grupuri de miere diferite, bazate pe puterea antioxidanta si, de asemenea, foarte probabil pe compozitia chimica. Rezultatele studiilor demonstreaza ca doar printr-o combinatie de testari antioxidante, analize comparative si evaluari chemometrice putem atinge o orientare strict riguroasa pentru caracterizarea activitatii antioxidante a mierii, un instrument nepretuit pentru intelegerea/demonstrarea legarii acestor antioxidanti de eficacitatea terapeutica.

1. Introducere

Mierea a fost un ingredient al medicinii traditionale, pe baza proprietatilor sale dietetice si curative, inca din timpurile antice. Plecand de la inceputul anilor 1970, cercetatorii din diferite domenii stiintifice au investigat proprietatile chimice si biologice ale mierii, acestea din urma incluzand activitatile antibacteriana, bacteriostatica, antiinflamatoare, vindecarea ranii si arsurii solare, care au fost evaluate in studii mai riguroase si stiintifice, doar in ultimii cativa ani. Examinari recente propun miere nu doar ca o promovarea a sanatatii supliment alimentar, dar pune in lumina proprietatile sale antioxidante, peroxid-non-dependente. Acest lucru face mierea mai mult decat un nutrient de mare valoare, dar si o valoroasa sursa alimentara de antioxidanti.

Pe langa acid cafeic, cumaric si esteri, mierea contine acizi fenolici si derivatii lor flavonoidici agliconi, carotenoizi, acid ascorbic, un totalizator de antioxidanti, care actionand sinergic pot explica multe dintre proprietatile biologice/terapeutice ale mierii.

Surprinzator, majoritatea eforturilor analitice pe miere s-au concentrat, pana acum, in ceea ce priveste cautarea si caracterizarea de trasaturi ca: aminoacizi, proteine, oligoelemente, uleiuri volatile, compozitia de zahar si polen, ca markeri ai originii geografice, botanice si sezoniale, dar putine au analizat constituentii antioxidanti biologic activi. Studii in vivo despre puterea

1

antioxidanta consolidata in serul uman, dupa consumul de miere, au aparut doar recent. Ele indica faptul ca un consum de miere, singura sau cu alte bauturi antioxidante, creste semnificativ capacitatea antioxidanta in serul uman. Similar, fructoza a avut efect pro-oxidant mai mic, cand subiectii tratati in vivo au luat ca alimentatie se mierea, decat in fructoza simpla. Hamzaoglu a raportat ca tumora implantata in sobolani a fost redusa semnificativ prin aplicarea de miere pre- si post-operativ, sugerand ca proprietatile fizico-chimice si chimice ale antioxidantilor mierii pot proteja ranile impotriva tumorii implantate. Swellam a demonstrat ulterior efectul antitumoral al mierii de albine impotriva cancerului de vezica urinara in vitro si in vivo.

Ce pune la indoiala proprietatile benefice ale antioxidantilor mierii este faptul ca cele mai semnificative descoperiri terapeutice au fost obtinute cu miere ne-standardizata in ceea ce priveste proprietatile ei antioxidante. Aceasta este probabil, pentru ca literatura nu aproba orice abordare sistematica, tinand cont de diferiti markeri de activitate antioxidanta si facand corelatiile corespunzatoare, astfel incat sa furnizeze o imagine completa a capacitatii antioxidante a unei probe de miere.

Lipsa standardizarii se afla, de asemenea, in faptul ca mierea este un amestec cu o complexitate ridicata a cel putin 200 de fitochimicale, a caror compozitie este strict dependenta de originea florala si geografica.

Scopul acestei munci a fost, prin urmare infiintarea unei proceduri sigure si simple pentru definirea/standardizarea activitatii antioxidante a diverse mieri(de origine florala si geografica diferita), acest lucru printr-o combinatie de diferite teste de antioxidare si o abordare chemometrica. Markerii folositi au fost: intensitatea culorii (ABS450), testul Folin-Ciocalteu pentru continutul de fenoli totali (PC), capacitatea antioxidanta prin reducerea ionului fier (FRAP)-test pentru activitatea antioxidanta totala, testul DPPH pentru a analiza capacitatea antiradicala si capacitatea de absorbanta a radicalilor oxigen (ORAC)-test pentru activitatea antiantilipoperoxidanta. Relatiile subiacente dintre parametrii au fost studiate, pentru elaborarea de date, folosind metode chemometrice. Pentru cunostintele noastre, aceasta este prima abordare a standardizarii rationale a proprietatilor antioxidante ale mierii si ofera o cale investigatiilor analitice viitoare asupra profitului de fitochimicale antioxidante, astfel incat pot fi planificate studii biologice mai riguroase.

2. Experiment

2.1. Aparatura

Masuratorile spectrofotometrice au fost facute un spectrofotometru UV-VIS Perkin-Elmer, Lambda 16, asistat de un calculator.

Determinarile fluorimetrice s-au efectuat cu un instrument Wallac Victor2 Multiwell, cu filtre fluorescente (λec = 485 nm; λem = 535 nm).

2

2.2. Substante chimice

Solventii organici au fost toti de puritate analitica. 2, 2’- Azobist(2-amidinopropan) dihidroclorid, β-ficoeritrin (β-PE) de la Porphidium cruentum si acid 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-2-carboxilic. DPPH, 2,4,6-tripiridil-s-tiazina (TPTZ), reactiv Folin-Ciocalteu, peroxid de hidrogen 30%, FeCl3 * 6H2O si FeSO4 * 7H2O.

2.3. Probele de miere

Mieri comerciale din urmatoarele surse florale au fost cumparate din diferite piete si magazine pe parcursul lui 2003: Capsun (Arbustus Unedo), hrisca (Fagopyrum esculetum), castan (Castanea sativa), sulla (Hedysarum coronarium), trifoi (Trifoium incarnatum), papadie (Taraxacum officinalis, doua probe diferite), cicoare (Chicorium intybus), salcam (Robinia pseudacacia), poliflora de munte, miere de mana. Trei miere “pur tropicale” au fost din Burkina, Faso, Africa, si etichetate Africa 1,2,3.

Probele de miere au fost depozitate la 4°C la intuneric, pana la procesare. Toate probele au fost testate de catre testele fizici-chimice uzuale, disponibile (pH, conductivitate electrica, aciditate titrabila, continut in cenusa) si de teste de calitate (testul Lugol, indicele diastazic pentru autenticitate, testul hidroximetilfurfuralului (HMF) pentru calitate) si de teste cantitative (zahar reducator). Un analog de zahar constand in 40%fructoza, 30%glucoza, 10%maltoza si 2%apa, a fost facut pentru a verifica daca principalele zaharuri, componente ale mierii pot interfera in toate testele propuse.

3. Metode

3.1. Continutul fenolic

Continutul fenolic total a fost determinat de o modificare a metodei Folin-Ciocalteu si rezultatele exprimate ca mg acid galic/kg miere. Probe de miere diferita au fost tratate cu apa distilata calda (500mg/5ml apa) si cu unde sonore pentru 5 min, pana a a fost obtinuta o solutie limpede.

Apoi 100µL de solutie, corespunzand la 10 mg de miere proaspata, au fost adaugate la 1mL de reactiv Folin-Ciocalteu diluat anterior cu apa distilata 1:10.

Amestecul a fost agitat pentru 2 min si continutul transferat intr-o cuva de 1.5 mL. Absorbanta a fost masurata dupa 20 min la 750nm impotriva analogului de zahar. Determinarile au fost facute in 4 exemplare. Lucrand in conditii acide nu a fosst nici o interferenta de la analogul de zahar si nuci un precipitat format pe parcursul analizelor. Liniaritatea metodei a fost verificata de la 10 la 250µg/mL de acid galic (dizolvat in metanol/apa 1:1). Liniaritatea raspunsului optic al reactiei miere-Folin-Ciocalteu a fost verificata pentru fiecare proba in intervalul 1-20% solutie de miere adaugata.

3

3.3. Activitatea antiradicala: testul DPPH

Activitatea de curatare (H/e−¿capacitatea de transfer)impotriva radicalului DPPH a fost evaluata conform metodei lui Brand-Williams, cu modificari minore. Amestecul testat contine 1.9 mL de 130µM DPPH(concentratia finala 83.3 µM) dizolvat in etanol absolut, 1mL de solutie tampon de acetat (100mM, pH 5.5) si 0.1 mL de solutie de miere, care contine de la 30 la 600mg/mL miere naturala. Volumul final a fost 3mL. Amestecul a fost agitat puternic pe un mixer Vortex, apoi incubat 90 min la 25°C intr-o baie de apa, in intuneric, dupa care a fost determinata absorbanta DPPH-ului ramas la 517nm fata de un martor.

Martorul a fost miere la aceeasi concentratie descrisa mai sus, continand toti reactivii cu exceptia DPPH-ului, aceasta pentru a elimina interferentele de culoare cu mierea. Toate analizele au fost facute in 4 exemplare. Analogul de zahar nu a redus obsorbanta originala a DPPH-ului.

3.5. Intensitatea culorii: AB 450

Din moment ce culoarea mierii reflecta partial continutul in pigmenti cu proprietati antioxidante (carotenoide, flavonoide), mierea a fost diluata la 50% (w/v) cu apa calda (45-50°C), tratata cu unde sonore pentru 5 min si filtrata ( marimea porului 0.45µm) pentru a elimina particulele mari. Absorbanta neta a fost definita ca diferenta dintre absorbanta spectrofotometrica la 450 si 720nm.

4. Rezultate

4.1. Continutul fenolic (PC)

In prima parte a studiului, continutul fenolic total (mg acid galic/kg) a diferite mieri a fost investigat folosind testul Folin-Ciocalteu modificat, care este sensibil la entitati fenolice si polifenolice si alti antioxidanti donori de electroni (acid ascorbic, vitamina E). Ca si cele raportate in tabelul 1, continutul fenolic a fost scazut in mierea deschisa de origine monoflorala: trifoi, salcam, papadie 1, mai mare pentru papadie 2 si sulla, crescand in continuare in cicoare si poliflora montana. Continutul fenolilor totalia fost mult mai ridicat in toate celelalte tipuri de miere. Mierea de capsuni a avut cel mai mare continut, se apropie de 0.1% (789.57 mg ac. galic/kg). Media continutului de fenoli totali a fost in acord cu cele raportate in literatura pentru aceleasi tipuri de miere. In special, valoarea pentru mierea de tei mexican coincide cea raportata in literatura pentru cea californiana (482.17 versus 456 mg ac.galic/kg).

4.3.Activitatea antiradicala (DPPH)

Testul de curatare al radicalului DPPH este unul dintre cele mai scurte disponibile pentru a investiga intreaga activitate de donare hidrogen/electron a antioxidantilor unici si promovarea sanatatii prin suplimente dietetice antioxidante. Abilitatea de curatare a mierii a crescut doza in intervalul 1-20mg miere/mL dependent de solutia testului final. Tabelul 1 arata capacitatea de curatare, exprimata ca IC50 pe radicalul DPPH. Au fost marcate diferente intre mieri. Din nou,

4

cel mai putin activ au fost cele de origine monoflorala: trifoi, salcam, sulla, papadie; acele mai active capsunile( IC50=1.63mg/mL) a caror potenta antiradical a fost de 30 de ori ca de papadie 1 (IC50= 47.62mg/ml).

4.5 Intensitatea culorii

Absorbanta unei solutii de miere 50% (w/v) varia de la 25 mAU, pentru mierea pal-alba (salcam), la 3413 m Au, pentru mierea maro-inchis de capsuni. Acesta diferenta marcata ar putea fi un index sigur al prezentei prigmentilor cu activitate antioxidanta (carotenoide, produsii de reactie Maillard). Alternativ se poate datora unor pigmenti contaminanti specifici, care decurg din manipularea, prelucrarea si depozitarea, si/sau de la reactiile biochimice in cursul maturarii mierii, care pot conduce la componenti cu nici o activitate antioxidanta.

4.6. Analiza datelor

Parametrii diferiti au fost analizati de o abordare multivariata. Setul de date originale au fost renormalizate de o transformare de auto-scalare intrucat valorile pentru parametri variati sunt exprimati in unitati diferite. Cu scopul de ainclude in setul de date proba de referinta (analogul de zahar) care este inactiv in testul DPPH, valorile lui IC50 au fost trasformate in reciprocele lor(1/IC50) astfel incat proba de referinta este zero.

Matricea de colerale, Tab 2, a aratat o corelatie semnificativa intre toate variabilele. Cu toate aceste, chiar si cele mai mic diferente intre coeficientii de corelatie trebuie examinati atent, intrucat ei pot oferi informatii utile despre activitatea antioxidanta a mierii. Reprezentarea grafica indica faptul ca primele doua componente principale reprezinta 95% din variatia totala. Celelalte elemente principale cel mai probabil absorb erori experimentale.

5. Discutii

Din acest studiu (Tab 1.) si din datele raportate in literatura se pare ca acelasi tip de miere, cgiar din parti diferite ale lumii, are putere antioxidanta similara. Procesarea industriala sau artizanala, manipularea si stocarea, par a fi factori minori in afectarea capacitatii antioxidante. Acest lucru ne conduce la a concluziona ca originea florala este determinantul major in puterea antioxidanta, astfel noi am stabilit un sistem experimental de rationalizare pentru a compara rezultatele de la testele facute.

Pe baza matricei de corelare, Tab.2, fiecare coeficient a fost considerat cu scopul de a stabili corelatii intre diferite cupluri de teste. Cea mai semnificativa corelatie, intre continutul fenolilor totali si activitatea antioxidanta totala (r=0.885), indica faptul ca puterea reducatoare a mierii se datoreaza entitatii fenolice/polifenolice, care poate reduce cuplul Fe3+ la Fe2+. In mod similar, cea mai mare corelatie intre fenoli si activitatea DPPH (r=0.918) arata ca chimicii fenolici guverneaza potenta antiradicala. Aceeasi indicatie vine de la valorile ORAC, unde capacitatea

5

antilipoperoxidanta este corelata cu continutul fenolic (r=0.868). Stransa interdependenta dintre PC, FRAP, DPPH si ORAC indica faptul ca puterea antioxidanta a mierilor este datorata constituentilor lor fenolici, care sunt capabili sa interactioneze cu Mo(VI) si Fe(III), cu un mecanism de transfer H/e si mai putin la alte entitati chimice.

Cel mai mic coeficient de corelatie dintre FRAP si ORAC apare din comportamentul anormal ORAC a doua mieri(Africa 2 si 3). Foarte probabil acestea contin substante chimice care pot potoli radicalii peroxid, de asemenea, prin reactii de aditie. Aceste substante ar putea fi, de exemplu, tioli( mercaptani) nucleofilici, baze azotate puternice, fenoli puternic conjugati, capabili sa prinsa radicalii peroxid so sa formeze compusi stabili. Corelatiile stranse intre culoarea mierii si continutul fenolic (r=0.933), activitatea antioxidanta totala (r=0.918) si valorile ORAC (r=0.731) sprijina observatiile lui Frankel, care nota, lucrand doar cu un test, DPPH, ca culoarea poate reflecta cel putin partial capacitatea antioxidanta a uei mieri.

Corelatiile descrise pot fi interpretate in lumina lui PCA. Dupa cum a raportat in graficul de incarcare, directia PC1 coincide cu cea a lui PC. Prin urmare, este rezonabil sa se presupuna ca PC1 include majoritatea informatie (peste 89% din variatia totala) se datoreaza substantelor fenolice detectate prin metode analitice diferite. Valorile ridicate de incarcare a FRAP, DPPH si variabilele culorii mierii confirma, potrivit multor analize, rolul major al speciilor fenolice in capacitate antioxidanta a mierii. PC2 explica 7% din variatia totala cu contributia majora a lui ORAC, 60%.

Reprezentarea grafica a scorului, raporata in fig 3B, arata comportamentul antioxidant al mierii in spatiiu dintre cele doua noi variabile PC1 si PC2. Miscandu-ne de-a lungul lui PC1 de la stanga la dreapta pe grafic, vom gasi diferite modele de grupare cu mieri mai putin antioxidante (salcam, papadie1 si trifoi) apropiata de analogul de zahar, in timp ce probele cu activitate antioxidanta intermediara (sulla, castan, cicoare, papadie 2, poliflora montana), sunt separate si grupate in primul cadran. Miere de capsune, care are cea mai mare activitate antioxidanta, este destul de departe de altii. Hrisca si Africa 1 se afla intr-o pozitie intermediara. Africa 2 si Africa1 sunt brusc separate de ceilalti de-a lungul axei PC2, pe baza valorilor sale ORAC neobisnuit de inalte. In mod similar, mierea de mana, singura care nu este dintr-o sursa florala isi mentine pozitia individuala intre mierile slab si puternic antioxidante. Mierea de mana este un zahar- material biologic bogat, produs din exudatele de copaci si plante cu ajutorul insectelor( fam Afidide), ale carei albine colecteaza pentru producerea de miere. Analizele chemometrice sugereaza ca compozitia chimica in antioxidanti a acestei probe de miere poate fi diferita de mierile florale.

6. Concluzii

Scopul lucrarii a fost sa instituie o abordare analitica practica pentru standardizarea proprietatilor antioxidante ale mierii.

6

Indicatia care reiese clar din aceasta lucrare este aceea ca doar dintr-o combinatie de teste antioxidante, analize comparative si evaluare chemometrica noi am putut obtine o platforma solida de informatii pentru a caracteriza proprietatile antioxidante ale mierii fara a pierde unele evenimente oxidante. Printre instrumentele chemometrice, scorul reprezentarii analizei PCA, care arata diferite modele de grupare a probelor de miere, pare a fi acela care o imagine imediata si corespunzatoare a puterii antioxidante, legate de diferentele in compozitia chimica.

Studiul poate furniza comunitatii stiintifice, cu un suport analitic solid, confirmarea efectelor antioxidante benefice, legate de miere. Constatarile pot furniza, de asemenea, fitochimistului o baza de informatii, inainte de a depunde un efort costisitor si consumator de timp de a identifica si caracteriza componentele antioxidante ale mierii.

7