1

Denumire proiect: SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC –

(TUMORSENSE) Nr. Contract: 12/2014

RAPORTARE ȘTIINȚIFICĂ

Etapa II

Perioada 1 ian. 2015 – 31 dec. 2015

Rezumatul propunerii de proiect În prezent, chimioterapia în cancer nu este întotdeauna eficientă, iar unul dintre motive este

creșterea celulelor tumorale. Acestea comprimă vasele de sange din tumoră încat medicamentele transmise prin sistemul vascular nu se răspândesc în tot volumul tumorii. Cele mai recente cercetări ale colaboratorilor noștri de la Laboratorul de Biologia Tumorilor Edwin L. Steele, Harvard Medical School, USA, au demonstrat că nivelul tensiunii mecanice (solid-stress) din țesutul tumoral poate fi utilizat ca biomarker al răspunsului la chimioterapie: o valoare redusă a tensiunii din țesutul tumoral conduce la scăderea compresiei vaselor sanguine și astfel este mai eficientă terapia oncologică. Prezentul proiect își propune pe baza acestor rezultate să îmbunătățească tratamentul cancerului. Mai exact, scopul proiectului este acela de a construi și valida prin teste, un sistem (TumorSense) de tip cateter care include un micro-senzor și care poate fi utilizat de medic în procedurile de biopsie pentru determinarea tensiunilor (solid-stress) în țesutul tumoral. În mod curent, biopsiile sunt recoltate utilizând un ac introdus printr-un cateter, la diferite etape ale tratamentului oncologic, pentru diagnosticare și stadializare. Sistemul propus va măsura cu acuratețe tensiunile în tumoră, în același timp și locație cu biopsia, fără a perturba protocoalele curente de diagnostic si tratament.

Obiectivele specifice ale proiectului sunt: 1. construirea prototipului unui micro-senzor pentru măsurarea tensiunii în țesutul tumoral, inclus într-un sistem de tip cateter, 2. dezvoltarea unui sistem medical inovativ pentru realizarea unei hărți a tensiunilor în volumul tumoral, 3. testarea sistemului pe un model artificial special dezvoltat in proiect și pe țesut animal. Micro-senzorul va fi asamblat într-un cateter de o structură specială, conectat la computer, care va fi introdus în canalul de lucru al endoscopului în timpul procedurii de biopsie. Acesta va fi realizat și testat pe modelul artificial de echipa de la MEDINSYS. Tot acestă echipă va integra în cateter și un senzor electromagnetic pentru determinarea poziției micro-senzorului de solid-stress în tumoră. Testele pe țesut animal vor fi realizate de Partenerul 1 (Univ. de Medicina si Farmacie din Cluj). Sistemul de analiza a datelor special, miniaturizat și cu comunicare wireless va fi dezvoltat de către specialiștii în electronică ai Partenerului 3 (IPA SA, institut privat de cercetare și dezvoltare în automatizări și IT). TumorSense va conține primul micro-senzor de determinare a tensiunii mecanice (solid-stress) în țesuturi moi. TumorSense este construit sub forma unui sistem minm-invaziv inovativ de tip cateter cu senzor de poziționare electromagnetică pentru ghidarea precisă în tumoră. Patentul va fi împărțit conform contribuției între parteneri și colaboratorii de la Harvard Medical School, care au descoperit în premieră rolul tensiunilor mecanice tumorale ca biomarker în tratamentul oncologic. Monitorizarea tensiunilor mecanice la nivel tumoral printr-o procedură minim invazivă va reduce costurile oncologice prin eliminarea tratamentului inutil și fără rezultat și va optimiza chimioterapia.

Programul de lucru in urma rectificarilor bugetare din 2015

2

Year 2014 2015 2016

Phase/month

M1

M2

M3

M4

M5

M6

M7

M8

M9

M10

M11

M12

M13

M14

M15

M16

M17

M18

M19

M20

M21

M22

M23

M24

M25

M26

M27

M28

M29

M30

1

E1. Definirea specificatiilor tehnice

ale sistemului TumorSense

A1.1. Definirea

specificatiilor tehnice ale sistemului TumorSense

2

E2. Cercetari asupra componentelor inovative ale

sistemului de evaluare a tensiunilor tumorale - TumorSense

A2.1. Cercetari asupra tehnologiilor inovative pentru masurarea tensiunilor din tesutul tumoral (I)

A2.2. Dezvoltarea modelului artificial pentru testare (I)

3

E3. Dezvoltarea prototipului, studii de evaluare si diseminare

A3.1. Cercetari asupra tehnologiilor inovative pentru masurarea tensiunilor din tesutul tumoral (II)

A3.2. Dezvoltarea modelului artificial pentru testare (II)

A3.1. Cercetari asupra unei metode inovative de creare a hartii tensiunilor in tesutul tumoral

A3.2. Dezvoltarea prototipului sistemului TumorSense si testarea pe model artificial

A3.3. Diseminare si patentare

Rezumatul etapei: Activitatea 2.1. Cercetari asupra tehnologiilor inovative pentru masurarea tensiunilor din tesutul tumoral (I) Rezultat: Tehnologie.

In acesta etapa, proiectarea, tehnologia si materialele pentru dezvoltarea senzorilor au fost intocmite pe baza a numeroase studii de cercetare. S-au obtinut straturi subtiri care sa prezinte activitate piezoelectrica si s-a efectuat un studiu parametric pentru optimizarea conditiilor de depunere a straturilor subtiri in vederea unui raspuns piezoelectric optim. Integrarea straturilor active piezoelectric intr-o heterostructura de test a fost deasemenea studiata atat din punct de vedere al intercompatibilitatii cristalografice dintre electrozii suport si stratul subtire cat si din punct de vedere al cerintelor de biocompatibilitate specifice. In acest scop, au fost realizate si/sau continuat activitati specifice cum ar fi: depunerea straturilor subtiri de NB-BT pe diverse substraturi utilizand atat tehnica Depunere Laser Pulsata (PLD) cat si tehnica de depunere din faza de vapori (MAPLE), caracterizare morfologica, structurala, feroelectrica si piezoelectrica a acestora, integrare in heterostructuri de test. Deasemenea au fost intreprinse actiuni de documentare privind ultimele noutati publicate in literatura in ceea ce priveste integrarea in dispozitive de test a straturilor subtiri BT-NBT epitaxiale sau policristaline obtinute prin PLD si MAPLE. Aceste prime prototipuri de senzori au fost realizate de catre partenerul P2 INFLPR Bucuresti impreuna cu Coordonatorului Proiectului, Medinsys SRL. Deasemenea au fost prezentate premisele studierii mecanicii intratumorale, factorii care influenţează rigiditatea tumorală cu detalieri asupra celulelor tumorale, matricei extracelulară si presiunii fluidului

3

interstiţial. S-a prezentat modul de reglare moleculară a rigidităţii matricei extracelulare cu accent asupra utilităţii studierii rigidităţii tisulare. S-a prezentat detalat tehnicile aplicate pentru măsurarea rigidităţii celulare (Metoda măsurării indentaţiei celulare folosind microscopia atomică de forţă; Analiza citometrică microfluidică; Micropipetarea celulară automată; Metoda magnetic tweezer system; Tehnica traction force microscopy; Tehnica optical stretching) şi pentru măsurarea viscozităţii si elasticităţii tumorale (elastografia şi metoda acoustic radiation force impulse (ARFI)).

Tot în cadul prezentei etape s-a format lotul de studiu TUMORSENSE cu pacienţii cu carcinom pancreatic pentru evaluarea presiunilor interstiţiale intratumorale. A2.2. Dezvoltarea modelului artificial pentru testare (I) Rezultat: Raport.

În această etapă s-au realizat primele variante din versiunea 1 de senzor de stress tumoral, in care s-au utilizat timbre tensometrice din comert. Aceasta este varianta simpla a senzorului, realizata in scopul demonstrarii conceptului si care se va testa pe un model artificial. Sistemul de achizitie realizat in cadrul acestei etape, este format din 2 tipuri distincte de echipamente: un modul de adaptare a semnalului responsabil de transformarea variatiei timbrului de masura in semnal unificat 4..20mA, curent ce este parte a unei punti de masura; un echipament de achizitie de semnale (curent, semnal unificat, 4..20mA). S-a ales aceasta solutie pentru ca este una flexibila si robusta din punct de vedere al perturbatiilor. O descriere detaliata a acestor echipamente este prezentata in raport. Codul aplicatiei software dezvoltata de echipa proiectului, care controleaza sistemul de achizitie de date, si permite prezentarea vizuala si analiza grafica a lor, este prezentat de asemenea detaliat. Aceasta varianta constructiva de senzor precum si sistemul original pentru achizitia semnalului de la acesti sensori s-a realizat cu participarea coordonatorului proiectului, Medinsys SRL precum si a partenerului P3 - IPA SA. O serie de studii medicale pentru a testa in urmatoarea etapa acesti senzori, in ambele variante, au fost realizate tot in cadrul acestei activitati, de catre partenerul P1 – Universitatea de Medicina si Farmacie din Cluj.

4

RAPORT ȘTIINȚIFIC ȘI TEHNIC Activitatea 2.1. Cercetari asupra tehnologiilor inovative pentru masurarea tensiunilor din tesutul tumoral (I) Rezultat: Tehnologie.

In acesta activitate, proiectarea, tehnologia si materialele pentru dezvoltarea senzorilor au fost intocmite pe baza a numeroase studii de cercetare.

Avand ca scop obtinerea de straturi subtiri nanometrice cu un raspuns piezoelectric cat mai mare si integrarea lor in heterostructuri de test, in cadrul acestei activitati s-a utilizat un sistem PLD prevazut cu o sursa de plasma in radiofrecventa, existand astfel posibilitatea de efectua experimente de ablatie asistate de o plasma rf. Sistemul de ablatie contine un laser pulsat cu Nd-YAG (CONTINUUM, SURELITE II-10) si un sistem de vid, dupa cum am mentionat in etapa precedenta. Materialul piezoelectric ales a fost o solutie solida de BaTiO3 cu NaBiTiO3 (BT-NBT) S-au efectuat mai multe seturi de experimente de depunere de straturi subtiri de BT-NBT (– (1-x)-Na0.5Bi0.5TiO3-xBaTiO3) folosind laserul cu Nd-YAG la a treia (355nm) si a patra armonica (266nm). Prin acest studiu parametric s-a urmarit in primul rand stabilirea influentei presiunii partiale de oxigen, a fluentei laser si a temperaturii de depunere dar si a modului de incalzire/racire asupra proprietatilor morfologice si structurale ale filmelor de BT-NBT. S-au utilizat trei tipuri de substrate: siliciu acoperit cu platina Pt/ Si(100), Nb :STO (100) –STON si Pt/Kapton. Toate tipurile de substrate folosite sunt conductoare electric pentru a putea evalua proprietatile dielectrice si piezoelectrice. Suportul de Pt/Kapton este un suport flexibil care prezinta avantajul de putea fi integrat usor intr-un dispozitiv tip senzor de deformare. Dezavantajul acestui tip de substrat este acela ca nu rezista la temperaturi de depunere mai mari de 2000C, ceea ce limiteaza tipul de material piezoelectric care poate fi depus sub forma de film subtire cristalin pe acest tip de suport. Din acest motiv, straturile subtiri piezoelectrice de BT-NBT au fost depuse pe Pt/Kapton folosind tehnica MAPLE, dupa cum va fi detaliat mai jos.

In tabelul I sunt prezentate conditiile experimentale folosite pentru obtinerea straturilor subtiri piezoelectrice prin tehncia PLD. Analizele morfologice efectuate cu ajutorul microscopiei de forta atomica (AFM- PARK XE-100), nu au aratat diferente notabile in valorile rugozitatii suprafetei in cazul probelor de BT-NBT/Pt/Si si cele de BT-NBT/STON.

Nr. crt

Tinta Suport Poxigen

(mbar)

Uflash (kv)

nlaser

(Hz) Arie

Spot (mm2)

Temperatura substr.

l (nm)

1 BT-NBT 6

PtSi, STON

0.6 1.45 10 1 650 265

2 BT-NBT 6

PtSi, STON

0.6 1.46 10 1 650 265

3 BT-NBT 8

PtSi, STON

0.6 1.46 10 1 650 265

4 BT-NBT 6

PtSi, STON

0.6 1.46 10 1 700 265

5 BT-NBT 8

PtSi, STON

0.6 1.46 10 1 700 265

Tabel I. Conditiile experimentale optimizate pentru straturile subtiri de BT-NBT depuse prin PLD

5

Figura 1. Straturi subtiri de BT-NBT/ STON (stanga, RMS= 21.2 nm) si BT-NBT/Pt/Si (dreapta,

RMS=20.1 nm)

Din analizele structurale efectuate folosind difractia de raze X (XRD- Panalytical X’PERT MRD), probele de BT-NBT/Pt/Si au aratat un caracter policristalin cu o usoara texturare pe directia cristalografica (110)- Figura 2. In functie de presiunea de oxigen utilizata in timpul depunerii se constata aparitia unei faze parazite piroclor la presiuni joasa. Probele de BT-NBT/STON sunt epitaxiale avand o simetrie tetragonala evidentiata de despicarea picurilor (001)/(100) si (002)/(200)- Figura 3. Nu se constata prezenta nici unei faze parazite, chiar si la valori ale temperaturii de depunere mai mici.

Figura 2. Difractograma de raze x pentru o proba de BT-NBT/Pt/Si

Figura 3. Difractograma de raze x pentru o proba de BT-NBT/STON Evaluarea proprietatilor feroelectrice a fost efectuata folosind un analizor TF 2000 de la firma

AICXA, comportamentul feroelectric fiind descris de curba de histeresis, adica polarizare dielectrica

6

(P) in functie de campul electric (E) aplicat. Comportamentul feroelectric se poate observa din forma curbei de histeresis, cu valori mai mici decat in forma bulk pentru polarizarea remanenta (10 µC/cm2) si a campul coerciv (3,74 kV/cm)- Figura 4.

Figura 4. Curba de histeresis P(E) pentru filmele de BT-NBT/PtSi

Pe baza rezultatelor obtinute in cadrul acestei activitati au fost determinate conditiile

experimentale optime de producere a straturilor subtiri de BT-NBT atat in forma policristalina cat si epitaxiala. Pentru dezvoltarea unui dispozitiv de test, am efectuat si depuneri de strat subtire de BT-NBT pe suport flexibil de Pt/Kapton prin tehnica MAPLE. Evaporarea Laser Pulsat Asistata de o Matrice (MAPLE)- Figura 5, oferă avantajul de a obtine o acoperire uniforma, control in grosime și aderenta la substrat. Principalul avantaj pentru procesul MAPLE este că interacțiunea cu laser se produce în principal cu moleculele de solvent, materialul de interes a fi transferat pe substrat ramanand nealterat de fasciculul laser. In aceasta etapa a fost utilizata o tinta formata din nanoparticule de BT-NBT intr-o matrice de alcool metilic.

Figura 5. Schema experimentala a sistemului MAPLE Seria de probe de BT-NBT/Pt/Kapton a fost investigata morfologic si compozitional prin

microscopie electronica de baleiaj asistata de difractie de electroni (SEM-EDAX). Aceste analize au fost efectuate de catre conducatorul de proiect (CO)- Figura 6 .

7

Figura 6. Imagini SEM ale stratului subtire de BT-NBT depus prin MAPLE.

PREMISELE BIOLOGICE ALE STUDIERII MECANICII INTRATUMORALE

Activităţile cu caracter medical/clinic din cadrul prezentei etape au inceput cu realizarea unui studiu documentar aprofundat cu upgradarea ultimelor informaţii privind tehnologiile innovative pentru masurarea tensiunilor din tesutul tumoral. Rezultatele medicale obţinute a fost diseminate prin publicare (2 articole) şi comunicare (3 manifestari ştiinţifice internaţionale).

Partenerul P1 a realizat un review detaliat al metodelor de studiere a mecanicii intratumorale asa cum este descris in detaliu mai jos. O parte din aceste informatii au fost sintetizate intr-un articol tip review numit „New targeted therapies in pancreatic cancer” publicat in jurnalul World Journal of Gastroenterology si al carui abstract este listat mai jos. Abstract Patients with pancreatic cancer have a poor prognosis with a median survival of 4-6 mo and a 5-year survival of less than 5%. Despite therapy with gemcitabine, patient survival does not exceed 6 mo, likely due to natural resistance to gemcitabine. Therefore, it is hoped that more favorable results can be obtained by using guided immunotherapy against molecular targets. This review summarizes the new leading targeted therapies in pancreatic cancers, focusing on passive and specific immunotherapies. Passive immunotherapy may have a role for treatment in combination with radiochemotherapy, which otherwise destroys the immune system along with tumor cells. It includes mainly therapies targeting against kinases, including epidermal growth factor receptor, Ras/Raf/mitogenactivated protein kinase cascade, human epidermal growth factor receptor 2, insulin growth factor-1 receptor, phosphoinositide 3-kinase/Akt/mTOR and hepatocyte growth factor receptor. Therapies against DNA repair genes, histone deacetylases, microRNA, and pancreatic tumor tissue stromal elements (stromal extracellular matric and stromal pathways) are also discussed. Specific immunotherapies, such as vaccines (whole cell recombinant, peptide, and dendritic cell vaccines), adoptive cell therapy and immunotherapy targeting tumor stem cells, have the role of activating antitumor immune responses. In the future, treatments will likely include personalized medicine, tailored for numerous molecular therapeutic targets of multiple pathogenetic pathways. O alta metoda care va fi folosita in acest proiect este fine-needle aspiration in timpul procedurii de EUS. Aceasta metoda va fi folosita pentru a se obtine o biopsie a tesutului tumoral urmata de introducerea senzorului de presiune tumorala in cavitatea ramasa de la biopsie. Acest studiu a fost publicat de P1 cu titlul „Harmonic Contrast-Enhanced Endoscopic Ultrasonography for the Guidance of Fine-Needle Aspiration in Solid Pancreatic Masses” publicata in jurnalul Ultraschall Med.

8

Abstract Purpose: The global accuracy of fine-needle aspiration guided by endoscopic ultrasound (EUSFNA) for pancreatic adenocarcinoma is about 85 %. The use of contrast agents during EUS to highlight vessels and the necrotic parts of pancreatic masses may improve biopsy guidance. Our aim was to assess whether the guidance of FNA by harmonic contrast-enhanced endoscopic ultrasound (CH-EUS) would increase diagnostic accuracy relative to conventional EUS-FNA in the same pancreatic masses. Patients and Methods: In a prospective study, EUS-FNA was performed in patients with pancreatic masses on CT scan, followed by harmonic CH-EUS using SonoVue. A second cluster of CHEUS- FNA was performed on contrast-enhanced images. The final diagnosis was based on the results of EUS-FNA and surgery, or the findings after 12 months’ follow-up. Results: The final diagnosis was adenocarcinoma (n = 35), chronic pancreatitis (n = 10), or other (n = 6). The diagnostic accuracy based on core histology was 78.4 % for EUS-FNA and 86.5 % for CHEUS- FNA (p = 0.35). The accuracy increased to 94 % when the two methods’ results were combined.The two false-negative EUS-FNA cases were correctly appreciated by CH-EUS. Neither core histology size nor the presence of necrosis was significant for the true-positive diagnosis of malignancy. Conclusion: CH-EUS-FNA had an insignificant incremental effect on diagnostic accuracy compared with conventional EUS-FNA in our small group. The presence of necrosis did not influence the results of CEUS-FNA. Qualitative assessment of the contrast uptake within the lesion was useful in false-negative EUS-FNA cases.

In studiul detaliat, sunt prezentate premisele studierii mecanicii intratumorale, factorii care influenţează rigiditatea tumorală cu detalieri asupra celulelor tumorale, matricei extracelulară si presiunii fluidului interstiţial. S-a prezentat modul de reglare moleculară a rigidităţii matricei extracelulare cu accent asupra utilităţii studierii rigidităţii tisulare. S-a prezentat detalat tehnicile aplicate pentru măsurarea rigidităţii celulare (Metoda măsurării indentaţiei celulare folosind microscopia atomică de forţă; Analiza citometrică microfluidică; Micropipetarea celulară automată; Metoda magnetic tweezer system; Tehnica traction force microscopy; Tehnica optical stretching) şi pentru măsurarea viscozităţii si elasticităţii tumorale (elastografia şi metoda acoustic radiation force impulse (ARFI)).

Urmeaza descrierea detaliata a celor mai moderne metode biologice de caracterizarea proprietatilor mecanice ale tumorilor.

Desmosplasia este o caracteristică a majorităţii tumorilor solide şi conduce la fibroză intratumorală prin depunere anormală de matrice extracelulară (ECM), remodelare, şi modificări posttranslaţionale. Stroma tumorilor rigide compromite nu numai integritatea vasculară ce induce hipoxie celulară şi împiedică livrarea intracelulară a chimioterapicelor, dar de asemenea, promovează agresivitatea tumorală prin potenţarea activităţii de creştere, invazie, si supravietuire celulară. Curios, multe dintre mecanismele de semnalizare protumorigenice, sunt activate de rigiditatea mecanică. Matricea extracelulară rigidă afectează preluarea glucozei şi glicoliza aerobă, rezultând un metabolism modificat care este un semn distinctiv de cancer (1).

Mediul mecanic in care se găseşte o entitate celulară cuprinde proteine solubile şi insolubile, zaharuri, alte celule, iar compoziţia acestuia şi orientarea în spaţiu este responsabilă de interaţiunile mecanice la care este supusă o celulă. Forţele endogene sunt generate de celula însăşi, fiind produse de forţele contractile ale citoscheletului. Forţele exogene includ gravitaţia, forţele de forfecare şi de tensiune transmise prin matricea extracelulară. De aceea, aprecierea rigidităţii matricei extracelulare este importantă pentru explicarea comportamentului celular. De exemplu, încărcarea cartilajelor şi oaselor este responsabilă de compoziţia ematricei extracelulare. In condiţii de imobilizare, scade densitatea minerală şi conţinutul in proteoglicani al cartilajelor. Imponderabilitatea

9

este de asemenea responsabilă de reducerea densităţii osoase, deoarece osteoblastele nu pimesc informaţii suficiente pentru sinteza de matrice extracelulară.

Mecanica intratumorală este rezultatul rigidităţii modificate la nivel celular şi la nivelul matricei extracelulare, ceea ce influenţează presiunea interstiţială şi transportul inter- şi intracellular(2). Rigiditatea celulară este diferită la nivelul diferitelor organe (Figura 1).

Figura 1. Rigiditatea tisulară este organ-specifică (reproduced from Liu et al Int. J. Mol.

Sci. 2015, 16, 15997-16016) FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ RIGIDITATEA TUMORALĂ

Principalii factori care influenţează rigiditatea tumorală sunt: • celulele tumorale • matricea extracelulară • presiunea fluidului interstiţial

Celulele tumorale au proprietăţi diferite faţă de celulele sănătoase. In primul rând, au capacitatea de proliferare infinită, bazată pe eludarea apoptozei şi pierderea răspunsului autolimitat la semnalele de creştere. In al doilea rând, au capacitatea de răspândire în organism, local sau prin metastazare la distanţă. In al treilea rând, celulele tumorale îşi reprogramează metabolismul energetic astfel încât pot supravieţui mediului din jur. In al patrulea rând, celulele tumorale au capacitatea de a promova si tolera inflamaţia.

Aparent, rigiditatea tumorală ar contrazice efectul de scăpare celulară in spaţiile intercelulare care să permită metastazarea. Au fost intens studiate capacitatea celulelor tumorale de a depăşi membrana bazală prin secreţia de proteaze, care acţionează şi asupra citoscheletului (referinte). Măsurarea caracteristicilor mecanice pentru celulele tumorale a demonstrat faptul că celulele tumorale, mai ales metastatice, sunt mai moi decât cele netumorale, cu indentaţia măsurată prin microscopia de forţă atomică mai redusă şi mai heterogenă decât la celulele benigne. In plus, celulele maligne izolate sunt mai rigide decât acelaşi tip de celule din biopsii, probabil datorită influenţei mediului asupra tensiunii intracelulare(3).

Matricea extracelulară este constituită dintr-o reţea macromoleculară in care se află dispuse diferite celule. Rigiditatea tumorală creşte şi prin numărul mare de celule care forţează pătrunderea in organele învecinate. Lysil oxidaza produce creşterea rigidităţii colagenului din matricea extracelulară, fapt asociat cu creşterea invazivităţii tumorale. Dacă filamentele de colagen sunt dispuse paralel cu marginea tumorală, invazivitatea este redusă, dar dacă sunt dispuse perpendicular, atunci invazivitatea este crescută. Fibroblastele, care in mod normal ar trebui să coordoneze matricea extracelulară, in cazul celulelor tumorale devin permisive pentru promovarea invaziei celulelor tumorale(4-8). Fortele de intindere şi forfecare de la nivelul matricei extracelulare induc productia intraepitelială de miARN, implicat in stimularea oncogenelor şi inhibarea genelor tumorale supresoare(9).

Presiunea fluidului interstiţial este de asemenea o cauză de creştere a rigidităţii tumorale. Astfel, in ţesutul normal, presiunea interstiţiala variaza intre -3 mm Hg şi +3 mm Hg. In tesutul tumoral, presiunea poate ajunge la 60 mm Hg, ceea ce ar putea împiedica irigarea tisulară corespunzătoare (6).

10

REGLAREA MOLECULARĂ A RIGIDITĂŢII MATRICEI EXTRACELULARE Intermedierea dintre rigiditatea celulară şi matricea extracelulară se realizează prin anumiţi

receptori transmembranari numiţi integrine. Acestea se leagă de liganzi ai matricei extracelulare, (focal adhesion kinase, vinculin, paxilin, tensin) care permit adeziunea focale dintre celule şi matricea extracelulară, iar astfel se activează forţe de atracţie a celulei in regiuni ale matricei extracelulare cu rigiditatea mai crescută(10-12).

Calea de semnalizare Rho/ROCK pare de asemenea implicată in reglarea rigidităţii. S-a arătatca activitatea Rho este reglementată de rigiditatea ECM, o matrice rigidă duce la creşterea activării RhoA, urmată de contractilitatea citoscheletului de actină. Efectorii acestei căi sunt protein kinază Rho-asociată(ROCK) şi mDia(13,14). ROCK este o serină / treonină kinaza care poate fosforila o varietate de substraturi,inclusiv subunitatea de legare a miozină pentru a spori contractilitatea actomiozinei. mDia catalizează nucleaţia actinei şi polimerizarea acesteia pentru a produce filamente de actină lungi, drepte. Un alt membru al familiei Rho, Rac-1, este implicat in reglarea celulelor muscular netede vasculare prin intermediul ciclinei D(15)(Figura 2).

Figura 1.2. Reglarea moleculară a rigidităţii matricei extracelulare

UTILITATEA STUDIERII RIGIDITĂŢII TISULARE

Studierea rigidităţii tisulare este extrem de utilă datorită următoarelor considerente

1. Diferenţa de rigiditate celulară poate fi exploatată pentru a crea strategii pentru discriminarea transformări neoplazice in cadrul populaţiilor de celule umane şi pentru proiectarea de instrumente complementare, inovatoare, pentru identificarea de markeri tumorali moleculari specifici, ceea ce ar conduce la posibile aplicaţii în diagnosticul şi tratarea bolilor canceroase.

2. Cunoaşterea proprietăţilor mecanice tumorale permite o mai bună decizie a terapiei adaptată rigidităţii tumorale specifice. Din păcate este dificil de interpretat funcţia distinctă a celulelor tumorale de a celor stromale, de aceea interacţiunea acestora este de interes pentru intelegerea proliferării, supravieţuirii şi rezistenţei la chimioterapice (4,5,16,17).

Măsurarea rigidităţii este dificil de realizat, şi se bazează pe masurători la nivel celular (măsurarea ridităţii celulare) sau la nivel tisular (masurarea viscozităţii si elasticităţii tumorale).

Măsurarea rigidităţii celulare Metoda măsurării indentaţiei celulare folosind microscopia atomică de forţă Culturile celulare, introduse intr-o cuvă specială, sunt supuse unei forte de 0.03N/m, cu

aplicarea presiunii la nivelul centrului celulei şi in periferie si măsurarea curbei fortă(F)-indentatie(δ) la

11

0,2 Hz. Rigiditatea celulelor se determină folosind formula F= a[exp(bδ)-1]; unde a este un index al formei F-δ si b corespunde schimbărilor de deformare.

Cu această formulă se depăşesc inconvenientele rezultate din aprecierea modulului Hertzian la compresie sau a modulului Young (18). De asemenea nu exista diferenţe la măsurarea indentaţiei la compresiunea central sau periferică (18). In Figura 3 este prezentat principiul măsurării indentaţiei celulare folosind microscopia atomică de forţă

Figura 1. 3. Principiul măsurării indentaţiei celulare folosind microscopia

atomică de forţă

Celulele tumorale metastatice prelevate din colecţia pleurală au fost măsurate comparativ cu celulele normale de la acelaşi pacient. Măsurarea modulului Young a arătat că celulele tumorale sunt mai mari faţă de cele benigne. Aceleaşi rezultate au fost obţinute la celulele de cancer de sân, dar nu au fost confirmate la melanom(Tabelul I). Noi studii, bazate pe non-linearitatea deformîrii celulare la compresiune au demonstrat că rigiditatea meai redusă a celulelor tumorale se datorează modificărilor citoscheletului, in special datorită reducerii cantităţii de actină(18).

Tabel I. Măsurarea indentaţiei celulare folosind microscopia atomică de forţă in diferite studii. Autor, anul Celule

tumorale Metode Celule

meligne/benigne Modul

elastic (kPa) Profunzime

Cross 2007(19)

Celule colectie pleurală

Conica , 37C Malign Benign

0.53 1.97

<400 nm

Li 2008(20) Celule epiteliale san

Sferoidal, 37C

Malign Benign

0,39 0,54

<200pm

Nikkhah 2011(21)

Celule epiteliale san

Sferoidal, 37C

Malign Benign

0,50 1,11

<196 nm

Pogoda 2012(22)

Melanom Conica Metastatic Primare

5,10 5,20

200nm

Lekka 2012(23)

Prostata Conica Malign Benign

1,95 3,09

400nm

Ramos 2014(24)

Vezica urinara

Conica Malign Benign

3 16

<300 nm

Hayashi 2015(18)

Cervicale Conica Malign Benign

2,48 5,50

<150nm

O altă metodă ”creep compression tests”se bazează pe extragerea de celule prin metoda

proteazic-independent, cu păstrarea proteinelor structural importante de tipul integrinelor sau caderinelor, urmată de compresiunea cu microscopul atomic de forţă, permite o mai buna apreciere a deformabilitaţii celulare (25). Analiza citometrică microfluidică

Prin analiza citometrică microfluidică se separă celulele canceroase la o lăţime de bandă superioară la trecerea prin micropori, pe baza criteriului de “deformabilitate”. Se imită perfuzia celulelor canceroase prin spaţiile înguste ale sistemului circulator in timpul metastazării pe baza capacităţii microfluidice a separării si sortării particulelor pentru un rezultat ridicat al screeningului parametrilor mecanici ai celulelor.

Platforma posedă două caracteristici cheie:

12

(1) deplasarea deterministică laterală, o tehnică microfluidică de sortare a particulelor pe bază de mărime care foloseste rânduri înclinate ale aparatului, pentru a separa celulele canceroase după mărime,

(2) o micromatrice rectangulară cu bariere de prindere cu spaţii ce descresc in lăţime de la 15 µm la 4 µm, care este comparabilă cu diametrul capilarelor sangvine cuprinse intre 6 si 9 µm, pentru a captura celulele.

Aceste caracteristici separă celulele intr-o unică distribuţie bidimensională; celulele cu diametre crescânde sunt distribuite de-a lungul lăţimii dispozitivului. iar deformabilitatea creşte in direcţia fluxului. Deformabilitatea celulară este un termen ce descrie efectul rigidităţii celulare si proprietatea de frecare a suprafeţei celulare, şi caracterizează scurgerea dinamică a celulelor canceroase prin spaţiile inguste, spre deosebire de deformarea statică.

Deformabilitatea şi rezultatele imunohistochimice demonstrează că periferia tumorii conţine un număr mai mare de celulele tumorale invazive cu o deformabilitatee mai mare decât centrul tumorii (26).

Micropipetarea celulară automată

Micropipetarea celulară automată se bazează pe aspirarea controlată şi automată a celulelor pe baza elasticităţii celulare şi a vâscozităţii. Astfel, se controlează deformabilitatea celulară intr- o manieră operator independentă, din ţesuturile solide sau lichide (27). Magnetic tweezer system

Magnetic tweezer system reprezintă un instrument de măsură a sistemelor macromoleculare sau polimerice care supun sistemele la forţe de torsiune sau de compresiune. Acest instrument a permis demonstrarea faptului că rigiditatea celulară se corelează invers cu capacitatea de migrare şi de invazie printr-o membrană bazală tridimensională, demonstrând pentru prima dată utilitatea unui model fenotipic de tip mechanic pentru apreciarea invaziei tumorale (28).

Reţelele polimerice tridimensionale au la bază faptul că atunci cand celulele intră in contact cu o matrice de adeziv, ele încep să se răspândească şi să migreze cu o viteza care depinde de rigiditatea matricei extracelulare. Pe o suprafaţă plană,in vivo, viteza de migrare scade cu rigiditatea matricei datorită adeziunilor focale. Glutaraldehida ca agent de reticulare pentru a creşte rigiditatea reţelor auto-asamblate de biopolimeri colagen independent de concentraţie colagen sau dimensiunea porilor pare o solutie optimă (29, 30). Traction force microscopy

Traction force microscopy este o tehnică experimentală utilizată pentru a cuantifica forţele contractile generate de celule aderente. Celulele sunt însămânţate pe un substrat flexibil si sunt urmărite deplasarile substratului cauzate de contracţia celulelor şi care se transformă într-un câmp de stres de tracţiune. Magnitudinea acestor tensiuni de tracţiune sunt în mod normal folosite ca o măsură a forţei contractile a celulelor.

Rezultatele înregistrate sugerează că schimbările in rigiditatea celulelor si densitatea de energie de adeziune pot modifica în mod semnificativ fortele de tractiune, independent de contractilităţii. Aplicarea unor corecţii la astfel de măsurători poate produce estimări mai exacte ale contractilităţii celulei (31, 32). Optical stretching

Tehnica optical stretching se bazează pe producerea de forţe la suprafaţa celulară prin aplicarea a două unde successive laser care acţionează asupra celulelor suspendate. Celulele se comportă diferit in funcţie de provenienţă (fibroblaste vs celule epiteliale de sân) sau de stadiul carcinogenezei (normale sau metastatice) (33).

13

Masurarea viscozităţii si elasticităţii tumorale

Un instrument similar cu palparea manuală a fost descris in 2014, aplicat la o profunzime prestabilită (34). Un instrument similar a fost evaluat pentru măsurarea forţei tisulare la compresiune (35-40). Imitarea palpării manuale a fost încercată, dar evaluarea dinamică pare a fi metoda cantitativă de viitor. Elastografia

Tehnica quasistatică elastografia foloseste imagistica cu ultrasunete pentru a obtine deformări ale ţesutului rezultate din stimularea mecanică prin compresiune. Sistemul presupune o unitate de imagistica cu ultrasunete sau rezonanţă magnetică. Un tesut dur este susceptibil de a fi malign, sau ţesutul hepatic mai rigid este susceptibil de a fi patologic. Este o metodă utilă pentru evaluarea tiroidei, sânului sau prostate, dar şi ca metodă aditivă la evaluarea ecoendoscopică a tumorilor pancreatice sau pentru discriminarea malignităţii in cazul ganglionilor limfatici. In Figura 4 este prezentat schematic principiul elastografiei

Figura 1.4. Principiul elastografiei

Aprecierea calitativă foloseşte albastru pentru a reprezenta ţesutul dur şi roşu sau verde

pentru a reprezenta ţesutul moale. Intr-o regiune selectionată, sunt necesare mai multe determinări pentru a obţine o valoare medie (Figura 5)

Aprecierea cantitativă poate folosi histogramele, cu evaluarea in timp real a leziunii urmărite

sau raportul de deformare între masa analizată şi ţesutul înconjurător. Rezultatele aprecierii cantitative au o sensibilitate foarte bună, de 95%, dar specificitatea este

de 67%(42). In figura 6 este prezentată evaluare ecoendoscopică elastographic cantitativă

Figura 1.5 Aprecierea calitativă

14

Figura 1. 6. Evaluare ecoendoscopică elastographic cantitativă: (I) pancreas sănătos

(raport de deformare, 1,82, zona A, 0,25%), iar 3 mase pancreatice diferite, inclusiv (II) masa inflamatorie (raport de deformare, 4.08, zona A, 0,14%); (III) adenocarcinom

pancreatic (raport de deformare, 17.41, zona A, 0,01%), şi (IV) tumoră neuroendocrină pancreatică (insulinom) (raport de deformare, 56.73, zona A, 0,01%). A, zona A, reprezentant al masei; B, zona de referinţă moale; B / A (coeficient), raportul de

deformare(41) Acoustic radiation force impulse (ARFI)

Metoda acoustic radiation force impulse (ARFI) se bazează pe apreicerea vitezei undelor ultrasunetelor pentru aprecierea elasticităţii ţesuturilor.

ARFI este o metodă in care nu mai este necesară compresiunea externă, fiind astfel operator independent, dar poate evalua rigiditatea tisulară in profunzime. In figura 7 este prezentat principiul ARFI

Figura 1. 7. Principiul ARFI

Forţele de radiaţie acustică, de scurtă durată (sub 1 ms) generează dislocări ale

parenchimului intr-o regiune de interes selectată in imaginea ecografică B convenţională. Cuantificarea vitezei undelor a permis stabilirea unui cu-off de 1,77m/s pentru o sensibilitate de 90%, fiind superioară fibroscanului in evaluarea fibrozei mai mari de F2. Rolul acestei tehnici in evaluarea leziunilor focale hepatice este încă in curs de evaluare(43).

15

Noi metode de măsurare a presiunii interstiţiale intratumorală ar putea reprezenta cheia pentru studierea rigidităţii tumorale, cu viză diagnostică a malignităţii şi de suport terapeutic oncologic. A2.2. Dezvoltarea modelului artificial pentru testare (I) Rezultat: Raport.

Pe baza rezultatelor obtinute in cadrul activitatii precedente au fost determinate conditiile

experimentale optime de producere a straturilor subtiri de BT-NBT atat in forma policristalina cat si epitaxiala prin PLD. Deasemenea, am efectuat si depuneri de strat subtire de BT-NBT pe suport flexibil de Pt/Kapton prin tehnica MAPLE. Probele obtinute in conditii optime si caracterizate morfologic, structural si electric au fost selectionate si investigate din punct de vedere piezoelectric. Cu ajutorul unui sistem de microscopie de raspuns piezoelectric bazat pe un AFM PARK XE-100 au fost testate cu succes proprietatile piezoelectrice ale filmelor obtinute. Astfel, utilizand cantilevere de Pt a fost aplicat un camp dc pe proba, iar un semnalul de test ac a fost generat de un amplificator lock-in. Valorile coeficientului piezoelectric efectiv obtinute in functie de camplu dc aplicat sunt prezentate in figura 7. Probele de BT-NBT prezinta un raspuns piezoelectric mare, d33

efectiv= 80 pm/V, mult superioare chiar decat celor aratate de materiale pe baza de plumb - PbZrTiO3 sau PbTiO3 [44, 45].

Figura 7. Dependenta valorilor coeficientului piezoelectric efectiv de campul aplicat pentru straturile subtiri de BT-NBT

Fiind indeplinita cu succes aceasta importanta functionalitate a straturilor subtiri de BT-NBT,

urmatoarea activitate intreprinsa a fost de testa raspunsul biocompatibil al acestor straturi. Acest lucru este foarte important datorită tehnicii de aplicare invazive de monitorizare a micro-senzorului solid-stres. Au fost efectuate teste de proliferare de celule pe straturile subtiri obtinute. Celulele HEK 293 embrionare epiteliale umane din rinichi si celulele de melanomn malign uman A 375 au fost puse pe biomaterialul BT-NBT, pe lamele de sticla si direct pe 48 de Godeuri (Costar cu capac si fundul plat, sterile ), la o densitate initiala de 4×104 celule pe suport si respective 2×104 celule pe suport in 300 µl de DMEM suplimentat cu GlutaMax. Dupa 48 de ore in atmosfera umidificata cu 5% CO2 la 37°C, materialele au fost clatite de trei ori cu PBS pentru a se inlatura toate celeulele non-aderente si transferate in godeuri noi. In fiecare godeu a fost adaugat 200 µl de DMEM suplimentat cu GlutaMax (Gibco) , urmat de 40 µl methyl tetrazole sulfate (MTS) (CellTiter 96® Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega, USA). Dupa 20 de minute de incubare, 100 µl din

16

solutia de cultura a fost transferata in 96 de godeuri tranparente (Nunc, Thermo Scientific) si a fost masurata densitatea optica cu ajutorul unui cititor de placi (Mithras LB 940 DLReady) la 450 nm.

Desi celulele de melanomn malign uman A 375 au fost puse cu o densitate mai mica ( < 50%) de cat celulele HEK 293 embrionare epiteliale umane din rinichi, proliferarea celulelor maligne dupa 48 de ore de la depunere a fost cu 25% mai mare , comparativ cu celulele umane nomale depuse pe aceeasi suprafata (arie) de material. Rezultatele deasemenea sugereaza ca materialul senzoristic BT-NBT a condus la o crestere a nivelului de proliferare comparativ lamelele de sticla borosilicata indiferent de linia celulara testate- Figura 8.

Celulele HEK 293 si celulele A375 puse pe biomaterialul BT-NBT pentru 48 de ore au fost spalate cu PBS si fixate cu 2.5 % in solutie tampon de glutaraldehidă timp de 20 de minute. Dupa aceea esantioanele au fost supuse unei dezhidratari si uscarii graduale in doua etape, a cate 15 minute fiecare, cu solutie de etanol si 50%, 75% hexametildisilazan (HDMS) si dupa in solutie pura de 100% HDMS. Imagistica SEM a fost facuta cu un microscop electronic cu emisie de câmp (Inspect S Electron Scanning Microscope, FEI Company)- Figura 9.

Figura 9. Imagini SEM ale celulelor HEK 293 si A 375, fixate pe senzorul din materialul BT-NBT si

pe suprafata acoperita cu sticla , dupa 48 de ore de la depunere la o marire de 1000x ( cu imagini inserate la 5000x). Scala de marime 50μm.

Imaginile SEM dovedesc (arata) ca materialul BT-NBT este compatibil la adeziunea celulara si mai mult, ca ambele linii celulare prezinta o sporire a proliferarii celulare pe materialul senzorului comparativ cu esantionul de control ( placate de sticla borosilicata).

17

În această etapă s-au realizat si primele variante din versiunea 1 de senzor de stress tumoral, in care s-au utilizat timbre tensometrice din comert. Aceasta este varianta simpla a senzorului, realizata in scopul demonstrarii conceptului si care se va testa pe un model artificial. Aceasta varianta constructiva precum si un sistem original pentru achizitia semnalului de la acesti sensori s-a realizat in cadrul coordonatorului proiectului, Medinsys SRL precum si a partenerului P3 - IPA SA. O serie de studii medicale pentru o testa in urmatoarea etapa acesti senzori, in ambele variante, au fost realizate tot in cadrul acestei activitati, de catre partenerul P1 – Universitatea de Medicina si Farmacie din Cluj.

Varianta constructivă I, realizata in activitatea 1.1. din 2014 conține un ax de 0.8 mm diam cu două placuțe flexibile, pe care s-au montat două timbre tensometrice HBM LY11-0.3/120 de lațime 0.8 mm. Valorile acestor timbre s-au citit cu un sistem de achizitie dezvoltat special in cadrul acestei etape.

Designul axului cu placuțe flexibile s-a făcut în două variante (fig. 1). În ambele axul de nitinol sau otel aliat s-a frezat pe o distanță de 8 mm, pe două fețe opuse și s-au sudat în zona frezată de diametru mai mic, două placuțe flexibile de nitinol, de lungime 8 mm, lațime 0.8 mm și grosime 0.2 mm într-o variantă și două placuțe de oțel aliat inoxidabil de grosime 0.1 mm în alt caz. S-au realizat două versiuni, una cu placuțele sudate numai la un capat (figura 8, a) și alta cu placuțele sudate la ambele capete (figura 2.1, b). Sudarea s-a realizat pe un sistem Nd:YAG LASAG KLS 246.

a b

c

Figura 2.1. Construcția acului cu timbre tensometrice în varianta de oțel (a) și nitinol (b) și montajul timbrelor tensometrice.

Sistemul de achizitie (Fig. 2.2.a) realizat in cadrul acestei etape, este format din 2 tipuri distincte

de echipamente:

- un modul de adaptare a semnalului responsabil de transformarea variatiei timbrului de masura (Fig. 2.b) in semnal unificat 4..20mA, curent ce este parte a unei punti de masura;

- un echipament de achizitie de semnale (curent, semnal unificat, 4..20mA) (Fig. 2.c).

18

a b

c Figura 2.2. Sistemul de achizitie original, realizat in cadrul acestei etape, utilizat impreuna cu prima varianta constructive de senzori. (a) Sistemul cu senzori si softul dezvoltat, care sunt

conectate la un PC pe care ruleaza un software dezvoltat tot in cadrul acestei etape de catre echipa proiectului, (b) module de adaptare, (c) echipament de achizitie

S-a ales aceasta solutie pentru ca este una flexibila si robusta din punct de vedere al perturbatiilor. Modulul de adaptare al semnalului are ca si componenta principala amplificatorul de instrumentatie

AD623, care este cu circuit usor de utilizat, de inalta performanta si care are ca si domenii principale de aplicatie:

- echipamente medicale de joasa putere; - interfete pentru traductoare; - amplificatoare pentru termocuple; - amplificatoare pentru interfete implicate in controlul proceselor; - amplificatoare diferentiale; - sisteme de achizitie de mica putere.

Acest circuit poate fi alimentat atat unipolar cat si bipolar. O caracteristica importanta a amplificatorului AD623 este aceea ca iesirea sa poate varia pe intregul domeniu de alimentare. Castigul amplificatorului de instrumentatie AD623 poate fi setat, programat prin intermendiul unei singure rezistente, ceea ce constituie, de asemenea, un avantaj deosebit. In situatia in care circuitul nu este prevazut cu un astfel de rezistor, castigul este unitar (GAIN = 1). Cu rezistenta suplimentara, castigul poate fi programat pana la maxim 1000 (GAINMAX = 1000).

Consumul redus al acestui amplificator (1,5mW la 3V) il face ideal pentru aplicatiile ce necesita alimentarea de la baterii.

19

Puntea de masura este excitata cu ajutorul unei tensiuni de referinta obtinuta de la circuitul specializat LT1009.

In afara amplificatorului de instrumentatie si a referintei de tensiune, modulul este prevazut si cu un amplificator neinversor de uz general, cu zgomot redus (OP07) care are rolul de a adapta dezechilibrul puntii de masura astfel incat sa poata fi transformat in semnal de curent unificat 4..20 mA. Aceasta conversie se face cu circuitul specializat AD694 care este un convertor tensiune – curent de inalta performanta. Prin conexiunile sale, circuitul este astfel setat incat sa transforme domeniul de tensiune 0..10V in semnal de curent unificat 4..20mA.

Modulul de adaptare a semnalului de la puntea de masura a fost proiectat astfel incat sa fie integrat intr-o carcasa robusta, de aluminiu.

Figura 2.3. Schema electronica a modulului de adaptare a semnalului

20

Figura 2.4. Cablajul imprimat pentru adaptorul de semnal – amplasarea componentelor (scara 1:1)

Figura 2.5. Cablajul imprimat pentru adaptorul de semnal – fata cu componente (scara 1:1)

Figura 2.6. Cablajul imprimat pentru adaptorul de semnal – fata cu lipituri (scara 1:1)

Sistemul de achizitie de date a fost dezvoltat in jurul unui microcontroler RISC (PIC18F8722), un

microcontroler ale carui resurse il recomanda intr-un numar mare de aplicatii.

21

In componenta echipamentului de achizitie, in afara microcontrolerului sunt o serie de componente ce flexibilizeaza sistemul in ansamblu, el putand fi utilizat si in alte aplicatii. De fapt, aceasta caracteristica a stat la baza conceptiei initiale a echipamentului.

Microcontrolerul are integrat un convertor analog – digital, periferic ce a fost utilizat in aplicatia curenta. Intrarile analogice ale microcontrolerului accepta o variatie de tensiune cuprinsa intre 0 si 5Vcc (VREF), motiv pentru care a fost necesara integrarea in echipament a unui bloc de conversie curent – tensiune responsabil de adaptarea semnalului de curent unificat (4..20mA) in tensiune (0..5Vcc).

Acest modul de conversie curent – tensiune are la baza o rezistenta de masura de 100Ω si doua etaje de amplificare realizate cu un amplificator diferential cu castig 1 dupa care imaginea curentului ce parcurge rezistenta de masura se transforma in tensiune ce variaza in gama 0,4 .. 2V si un amplificator neinversor ce amplifica semnalul de tensiune pana la atingerea limitei superioare de 5Vcc (castigul este de 2,5).

Figura 2.7. Modul conversie curent (4..20mA) – tensiune (1..5Vcc) – canalul analogic 0.

In afara canalelor de intrare analogica, in etapa de proiectare a echipamentului s-au prevazut

conectori si pe pinii portului de intrare / iesire PORTD, iar pe bitul cel mai putin semnificativ al portului H s-a integrat un tranzistor de comutatie ce poate fi utilizat ca si driver de mica putere.

Figura 2.8. Microcontrolerul PIC18F8722

Alimentarea componentelor logice si a celor analogice se face prin intermediul unor convertoare

DC/DC ce admit la intrare o tensiune de 18 – 36 Vcc.

22

Figura 2.9. Convertoarele DC-DC ale echipamentului de achizitie

Comunicatia dintre echipamentul de achizitie si calculator se face printr-o interfata RS232,

semnalele specifice fiind obtinute cu ajutorul unui driver specializat.

Figura 2.10. Driver TTL-RS232

Pentru programarea microcontrolerului s-e poate utiliza metoda de programare in sistem (ISP)

utilizand portul special prevazut.

23

Figura 2.11. Port programare microcontroler

Pentru a asigura buna functionare a echipamentului acesta a fost prevazut si cu un supraveghetor al tensiunii de alimentare prin intermediul caruia microcontrolerul este resetat in cazul scaderii tensiunii de alimentare sub un anumit prag.

Figura 2.12. Circuit RESET si supraveghere alimentare

Cablajul imprimat a fost proiectat in 2 straturi si este special dimensionat pentru a intra intr-o

carcasa de aluminiu. Programarea microcontrolerului a fost facuta in limbaj de nivel inalt (C).

Figura 2.13. Cablajul imprimat al echipamentului de achizitie (1:1) – amplasarea componentelor

24

Figura 2.14 Cablajul imprimat al echipamentului de achizitie (1:1) – fata cu componente

Figura 2.15. Cablajul imprimat al echipamentului de achizitie (1:1) – fata cu lipituri

25

Codul aplicatiei software dezvoltata de echipa proiectului, care controleaza sistemul de achizitie de date, si permite prezentarea vizuala si analiza grafica a lor, este prezentat in Apendix 1.

Proiectul TUMORSENSE urmăreşte realizarea unui sistem medical inovativ pentru monitorizarea tensiunilor interne in ţesutul tumoral in scopul îmbunătăţirii tratamentului oncologic. In cadrul prezentei etape a fost dezvoltat modelul experimental al sistemului TUMORSENSE pe baza studiului asupra tehnologiilor innovative pentru masurarea tensiunilor din tesutul tumoral.

Detaliile tehnice au fost realizate de coordonatorul de proiect. Urmează ca modelul creat, modelul experimental al sistemului TUMORSENSE, să fie testat in

cadrul etapelor urmatoare. S-au realizat loturile de studiu pe baza criteriilor de includere stabilite in proiect şi cu

respectarea principiilor de confidenţialitate, în coformitate cu cerinţele Comisiei de Etică a UMF Cluj. Pacienţilor incluşi în studiu li s-a solicit şi obţinut acordul informat. Tabelul II prezintă lista cu pacienţii cu adenocarcinom pancreatic incluşi in studiu pentru a furniza date clinice pentru modelul experimental pentru evaluarea presiunilor interstiţiale intratumorale

Concluzii

• Mecanica intratumorală este rezultatul rigidităţii modificate la nivel celular şi la nivelul matricei extracelulare, ceea ce influenţează presiunea interstiţială şi transportul inter- şi intracelular • Rigiditatea matricei poate determina comportamentul celular, alterarea căilor de semnalizare intracelulară, carcinogeneza, progresia tumorală şi răspunsul tumoral la terapie. • Celulele tumorale, mai ales metastatice, sunt mai moi decât cele netumorale, cu indentaţia măsurată prin microscopia de forţă atomică mai redusă şi mai heterogenă decât la celulele benigne.In plus, celulele maligne izolate sunt mai rigide decât acelaşi tip de celule din biopsii, probabil datorită influenţei mediului asupra tensiunii intracelulare. • Rigiditatea mai redusă a celulelor tumorale se datorează modificărilor citoscheletului, in special datorită reducerii cantităţii de actină iar măsurarea ei implică metode foarte sofisticate, inca experimentale • Măsurarea viscoelasticităţii tisulare se bazează pe măsurarea deformării tisulare in timpul examinării cu ultrasunete, dar specificitatea metodei elastografice este moderată, iar tehnica ARFI este inca in curs de evaluare pentru leziunile focale • Noi metode de măsurare a presiunii interstiţiale intratumorală ar putea reprezenta cheia pentru studierea rigidităţii tumorale, cu viză diagnostică a malignităţii şi de suport terapeutic oncologic. • A fost format lotul de pacienţi pentru lotul de studiu, cărora li s.-a solicitat şi obţinut acordul informat pentru includere în studiul TUMORSENSE, în conformitate cu normele UMF Cluj-Napoca Rezultatele etapelor si gradul de realizare a obiectivelor

Rezultate obtinute: - s-au realizat primele prototipuri de senzori cu strat piezorezistiv, noutate la novel

mondial, in urma studiilor, un material nou, pe baza de barium titanate doped sodium si bismuth titanate sub forma de straturi subtiri– (1-x)-Na0.5Bi0.5TiO3-xBaTiO3 sau NBT-BT – obtinut prin procesarea cu laser folosind radiofrequency beam assisted pulsed laser deposition (RF-PLD), a tintelor de (1-x)Na0.5Bi0.5TiO3.

- s-au realizat primele prototipuri inovative de senzori cu timbru tensometric, impreuna cu sistemul de achizitie pentru acestia, si software-ul aferent.

26

- s-a realizat un studiu documentar upgradat cu ultimele informatii privind tehnologiile innovative pentru masurarea tensiunilor din tesutul tumoral

- s-a realizat lotul de studiu al pacienţilor cu adenocarcinom pancreatic pentru a furniza date clinice pentru modelul experimental pentru evaluarea presiunilor interstiţiale intratumorale

- s-a obtinut acordul informat al pacienţilor incluşi în studiul TUMORSENSE.

Diseminarea rezultatelor Articole 1. Seicean A, Badea R, Moldovan-Pop A, Vultur S, Botan EC, Zaharie T, Săftoiu A, Mocan T,

Iancu C, Graur F, Sparchez Z, Seicean R. Harmonic Contrast-Enhanced EndoscopicUltrasonography fortheGuidanceofFine-NeedleAspiration inSolidPancreaticMasses, Ultraschall Med. 2015 Aug 14.

2. Seicean A, Petrusel L, Seicean R. New targeted therapies in pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 2015 May 28;21(20):6127-45.

3. V. Dinca, A. Bercea, M. Icivezi, A. Roseanu, L. Gruionu, R. Birjega, M. Dinescu, N. D. Scarisoreanu, BCZT thin films based-bio interfaces obtained by MAPLE technique, Applied Surface Science, submitted, 2015.

Presentări - poster 1. “EUS-plus” – the role of contrast harmonics, elastography and nCLE. 6th European EUS

Congress,11-12 November 2015, Edinburgh, Scotland, UK. 2. Operabilitatea în cancerul de pancreas. Ecoendoscopia (EUS). AL XXXV-LEA Congres

National de Gastroenterologie , Hepatologie si Endoscopie Digestiva Iasi 2015.

Prezentare orală 1. Core-histology obtained during endoscopic ultrasonography for pancreatic masses by using a

standard 22G needle. 6th European EUS Congress,11-12 November 2015, Edinburgh, Scotland, UK.

Bibliografie

1. Tung JC, Barnes JM, Desai SR, Sistrunk C, Conklin MW, Schedin P, Eliceiri KW, Keely

PJ, Seewaldt VL, Weaver VM.Tumor mechanics and metabolic dysfunction. Free Radic Biol Med. 2015 Feb;79:269-80.

2. Mouw JK, Ou G, Weaver VM. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014 Dec;15(12):771-85.

3. Nagelkerke A, Bussinkb J, Rowana AE, Spanb PN. The mechanical microenvironment in cancer: How physics affects tumours . Seminars in Cancer Biology 35 (2015) 62–70

4. Kalluri R, Zeisberg M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 2006;6(5):392–401.

27

5. Langley RR, Fidler IJ. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr Rev. 2007;28(3):297–321.

6. Plodinec M, Loparic M, Monnier CA, Obermann EC, Zanetti-Dallenbach R,Oertle P, et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nanotechnol 2012;7(11):757–65.

7. Cross SE, Jin YS, Rao J, Gimzewski JK. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nat Nanotechnol 2007;2(12):780–3.

8. Guck J, Schinkinger S, Lincoln B, Wottawah F, Ebert S, Romeyke M, et al.Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence. Biophys J 2005;88(5):3689–98.

9. Mouw JK, Yui Y, Damiano L, Bainer RO, Lakins JN, Acerbi I, Ou G, Wijekoon AC, Levental KR, Gilbert PM, Hwang ES, Chen YY, Weaver VM. Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression. Nat Med. 2014 Apr;20(4):360-7.

10. Steward AJ, Kelly DJ. Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation. J Anatomy 2014;

11. 11. Sreenivasappa H, Chaki SP, Lim SM, Trzeciakowski JP, Davidson MW, Rivera GM, Trache A. Selective regulation of cytoskeletal tension and cell-matrix adhesion by RhoA and Src. Int Biol 2014; 6:743-54;

12. Bae YH, Mui KL, Hsu BY, Liu SL, Cretu A, Razinia Z, Xu T, Pur_e E, Assoian RK. A FAK-Cas-Raclamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling. Sci Signaling 2014; 7:ra57

13. Plotnikov SV, Pasapera AM, Sabass B, Waterman CM. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell 2012; 151:1513-27

14. Huang X, Yang N, Fiore VF, Barker TH, Sun Y,Morris SW, Ding Q, Thannickal VJ, Zhou Y. Matrix stiffness-induced myofibroblast differentiation is mediated by intrinsic mechanotransduction. Am J Resp Cell Mol Biol 2012; 47:340-8;

15. Chaudhuri O, Koshy ST, Branco da Cunha C, Shin JW, Verbeke CS, Allison KH, Mooney DJ. Extracellular matrix stiffness and composition jointly regulate the induction of malignant phenotypes in mammary epithelium. Nat Materials 2014; 13:970-8;

16. Pietras K, Ostman A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Exp Cell Res.2010;316(8):1324–1331.

17. Fraldi M, Cugno A, Deseri L, Dayal K, Pugno NM5. A frequency-based hypothesis for mechanically targeting and selectively attacking cancer cells. J R Soc Interface. 2015;12(111).

18. Hayashi K, Iwata M. Stiffness of cancer cells measured with an AFM indentation method. J Mec Behavior Biomed Materials2015; 49: 105–111.

19. Cross, S.E., Jin, Y.-S., Rao, J., Gmzewski, J.K., 2007. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nat. Nanotech. 2, 780–783.

20. Li, Q.S., Lee, G.Y.H., Ong, C.N., et al., 2008. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 374, 609–613.

21. Nikkhah, M., Strobl, J., Schmelz, E.M., et al., 2011. Evaluation of the influence of growth medium composition on cell elasticity. J. Biomech. 44, 762–766.

22. Pogoda, K., Jaczewska, J., Wiltowska-Zuber, J., et al., 2012. Depth- sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data. Eur. Biophys. J. 41, 79–87.

23. Lekka, M., Gil, D., Pogoda, K., et al., 2012. Cancer cell detection in tissue sections using AFM. Arch. Biochem. Biophys. 518, 151–156.

24. Ramos, J.R., Pabijan, J., Garcia, R., et al., 2014. The softening of human bladder cancer cells happens at an early stage of the malignancy process. Beilstein J. Nanotechnol. 5, 447–457.

28

25. Venugopalan G, Camarillo DB, Webster KD, Reber CD, Sethian JA, Weaver VM, Fletcher DA, El-Samad H, Rycroft CH. Multicellular architecture of malignant breast epithelia influences mechanics.PLoS One. 2014;9(8):e101955.

26. Liu Z , LeeY, Jang J, Li Y, Han X, Yokoi K,Ferrari M, Zhou L, Qin L. Microfluidic cytometric analysis of cancer cell transportability and invasiveness. Scientific Reports | 5:14272

27. Shojaei-Baghini E, Zheng Y, Sun Y. Automated micropipette aspiration of single cells.Ann Biomed Eng. 2013 Jun;41(6):1208-16.

28. Swaminathan V, Mythreye K, O'Brien ET, Berchuck A, Blobe GC, Superfine R.Mechanical stiffness grades metastatic potential in patient tumor cells and in cancer cell lines. Cancer Res. 2011 Aug 1;71(15):5075-80.

29. Lang NR, Skodzek K, Hurst S, Mainka A, Steinwachs J, Schneider J, Aifantis KE, Fabry B. Biphasic response of cell invasion to matrix stiffness in three-dimensional biopolymer networks. Acta Biomater. 2015 Feb;13:61-7.

30. Cassereau L, Miroshnikova YA, Ou G, Lakins J, Weaver VM. A 3D tension bioreactor platform to study the interplay between ECM stiffness and tumor phenotype.J Biotechnol. 2015 Jan 10;193:66-9.

31. Zielinski R, Mihai C, Kniss D, Ghadiali SN. Finite element analysis of traction force microscopy: influence of cell mechanics, adhesion, and morphology. J Biomech Eng. 2013 Jul 1;135(7):71009.

32. Piotrowski AS, Varner VD, Gjorevski N, Nelson CM. Three-dimensional traction force microscopy of engineered epithelial tissues. Methods Mol Biol. 2015;1189:191-206.

33. Guck J, Schinkinger S, Lincoln B, Wottawah F, Ebert S, Romeyke M, Lenz D, Erickson HM, Ananthakrishnan R, Mitchell D, Käs J, Ulvick S, Bilby C. Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence. Biophys J. 2005 May;88(5):3689-98.

34. H. Oflaz, O. Baran. A new medical device to measure a stiffness of soft materials. Acta Bioeng Biomech 2014, 16: 125–13

35. Ahn BM, Kim J, Ian L, Rha KH, Kim HJ. Mechanical property characterization of prostate cancer using a minimally motorized indenter in an ex vivo indentation experiment. Urology, 76 2010:1007–1011

36. Carson WC, Gerling GJ, Krupski TL, Kowalik C, Harper JC, Moskaluk CA.Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic. Med. Eng. Phys, 33;2011: 302–309

37. Phipps S,Yang TH, Habib FK, Reuben RL,McNeill SA. Measurement of the mechanical characteristics of benign prostatic tissue: a novel method for assessing benign prostatic disease. Urology 2005, 65: 1024–1028

38. Ahn B, Kim Y,Oh CK, Kim J. Robotic palpation and mechanical property characterization for abnormal tissue localization. Med. Biol. Eng. Comput 2012, 50:961–971

39. Sangpradit K, Liu HB, Dasgupta P, Althoefer K, Seneviratne LD. Finite-element modeling of soft tissue rolling indentation. IEEE Trans. Biomed. Eng 2011, 58:3319–332

40. Palacio-Torralba J, Hammer S, Good DW, Alan McNeill S, Stewart GD, Reuben RL, Chen Y.Quantitative diagnostics of soft tissue through viscoelastic characterization using time-based instrumented palpation. J Mech Behav Biomed Mater. 2015 Jan;41:149-60.

41. Iglesias-Garcia J, Larino-Noia J, Abdulkader I, Forteza J, Dominguez-Munoz JE.Quantitative endoscopic ultrasound elastography: an accurate method for the differentiation of solid pancreatic masses.Gastroenterology. 2010 Oct;139(4):1172-80.

42. Li X, Xu W, Shi J, Lin Y, Zeng X. Endoscopic ultrasound elastography for differentiating between pancreatic adenocarcinoma and inflammatory masses: a meta-analysis. World J Gastroenterol. 2013 Oct 7;19(37):6284-91.

29

43. Mirko D’Onofrio, Stefano Crosara, Riccardo De Robertis, Stefano Canestrini, Emanuele Demozzi, Anna Gallotti, and Roberto Pozzi Mucelli. Acoustic radiation force impulse of the liver. World J Gastroenterol. 2013 Aug 14; 19(30): 4841–4849.

44. T.Takenaka, Piezoelectric Properties of Some Lead-Free Ferroelectric Ceramics, Ferroelectrics. 1999, Vol. 230. pp 87-98.

45. A. Morelli, Sriram Venkatesan, B. J. Kooi, G. Palasantzas, and J. Th. M. De Hosson, Piezoelectric properties of PbTiO3 thin films characterized with piezoresponse force and high resolution transmission electron microscopy, J. Appl. Phys. 105, 064106 (2009).

Director Proiect, Dr. Gabriel Gruionu

Apendix 1. Codul aplicatiei software pentru sistemul de achizitie de date.

/* Aplicatie monitorizare canale analogice prin comunicatie seriala RS232. Transmisia se face temporizat, prin utilizarea timer-ului 0 generandu-se intrerupere la fiecare 25ms sau 10ms. Microcontroler: PIC18F8722 Oscilator: 20.000MHz */ unsigned int adc_rd[8]; unsigned char pachet[50]; void citire_canale_analogice(void) adc_rd[0] = ADC_Read(0); // Citire valoare CAN canal 0 adc_rd[1] = ADC_Read(1); // Citire valoare CAN canal 1 adc_rd[2] = ADC_Read(2); // Citire valoare CAN canal 2 adc_rd[3] = ADC_Read(3); // Citire valoare CAN canal 3 adc_rd[4] = ADC_Read(4); // Citire valoare CAN canal 4 adc_rd[5] = ADC_Read(5); // Citire valoare CAN canal 5 adc_rd[6] = ADC_Read(6); // Citire valoare CAN canal 6 adc_rd[7] = ADC_Read(7); // Citire valoare CAN canal 7 void calcul_crc(void) unsigned char tt, suma8biti; unsigned int suma; suma = 0; // Initializare suma de control for (tt=0;tt<26;tt++)

30

suma += pachet[tt]; // Insumare date pachet suma8biti = suma % 256; // Extragere octet inferior din suma de suma8biti = ~suma8biti; // control si calculul complementului fata suma8biti += 1; // fata de 2 pachet[26] = suma8biti / 128; // Impachetarea CRC-ului in pachetul de date pachet[27] = suma8biti % 128; void pregatire_pachet_date(void) pachet[0] = 0xFF; // Setare antet pachet date pachet[1] = adc_rd[7] / 128; // Pregatire valori pe 7 biti canal analogic 7 pachet[2] = adc_rd[7] % 128; pachet[3] = adc_rd[6] / 128; // Pregatire valori pe 7 biti canal analogic 6 pachet[4] = adc_rd[6] % 128; pachet[5] = adc_rd[5] / 128; // Pregatire valori pe 7 biti canal analogic 5 pachet[6] = adc_rd[5] % 128; pachet[7] = adc_rd[4] / 128; // Pregatire valori pe 7 biti canal analogic 4 pachet[8] = adc_rd[4] % 128; pachet[9] = adc_rd[3] / 128; // Pregatire valori pe 7 biti canal analogic 3 pachet[10] = adc_rd[3] % 128; pachet[11] = adc_rd[2] / 128; // Pregatire valori pe 7 biti canal analogic 2 pachet[12] = adc_rd[2] % 128; pachet[13] = adc_rd[1] / 128; // Pregatire valori pe 7 biti canal analogic 1 pachet[14] = adc_rd[1] % 128; pachet[15] = adc_rd[0] / 128; // Pregatire valori pe 7 biti canal analogic 0 pachet[16] = adc_rd[0] % 128; pachet[17] = 0; // Date stare semnale digitale 0..6 pachet[18] = 0; // Date stare semnale digitale 7..13 pachet[19] = 0; // Date stare semnale digitale 14..20 pachet[20] = 0; // Date stare semnale digitale 21..27 pachet[21] = 0; // Date stare semnale digitale 28..34 pachet[22] = 0; // Date stare semnale digitale 35..41 pachet[23] = 0; // Date stare semnale digitale 42..48 pachet[24] = 0; // Date stare semnale digitale 49..55 pachet[25] = 0; // Date stare semnale digitale 56..62 calcul_crc(); // Calculare suma de control void setare_port_serial(void) UART1_Init(38400); // Setare baudrate Delay_ms(100); // Intarziere 100ms pentru stabilizare modul // comunicatie seriala void transmisie_date(void) unsigned char ii;

31

for (ii = 0; ii<28; ii++) UART1_Write(pachet[ii]); // Transmisie seriala date in ciclu "for" void timer0_interrupt_settings(void) // 25 ms T08BIT_bit = 0; // Configurare timer pe 16 biti T0CS_bit = 0; // Setare clock intern ca sursa de incrementare PSA_bit = 0; // Setare utilizare prescaler T0PS0_bit = 0; // Presetare prescaler la T0PS1_bit = 1; // valoarea 010 T0PS2_bit = 0; TMR0IF_bit = 0; // Resetare fanion intrerupere Timer0 GIE_bit = 1; // Setare bit validare generala intreruperi TMR0IE_bit = 1; TMR0ON_bit = 1;

// 10 ms /* T08BIT_bit = 0; // Configurare timer pe 16 biti T0CS_bit = 0; // Setare clock intern ca sursa de incrementare PSA_bit = 1; // Setare neutilizare prescaler TMR0IF_bit = 0; // Resetare fanion intrerupere Timer0 GIE_bit = 1; // Setare bit validare generala intreruperi TMR0IE_bit = 1; TMR0ON_bit = 1; */ void interrupt(void) // Rutina de intrerupere if (TMR0IF_bit) // Testare fanion de intrerupere TIMER0 // 25 ms TMR0L = 0xFC; // Presetare in TMR0L si TMR0H a unei valori pentru TMR0H = 0xC2; // obtinerea temporizarii dorite (25ms in acest caz) // 10 ms /* TMR0L = 0xAF; // Presetare in TMR0L si TMR0H a unei valori pentru TMR0H = 0x3C; // obtinerea temporizarii dorite (10ms in acest caz) */ TMR0IF_bit = 0; // Resetare fanion de intrerupere PORTC = 0xFF; // Setare PORTC citire_canale_analogice(); pregatire_pachet_date(); transmisie_date(); PORTC = 0x00; // Resetare PORTC

32

void main() CMCON |= 7; // Dezactivare comparatoare ADCON1 |= 0x00; // Configurare pini AN ca intrari analogice setare_port_serial(); TRISC = 0; // Setare PORTC ca port de iesire PORTC = 0x00; // Resetare PORTC // 25 ms TMR0L = 0xFC; // Presetare in TMR0L si TMR0H a unei valori pentru TMR0H = 0xC2; // obtinerea temporizarii dorite (25ms in acest caz) // 10 ms /* TMR0L = 0xAF; // Presetare in TMR0L si TMR0H a unei valori pentru TMR0H = 0x3C; // obtinerea temporizarii dorite (10ms in acest caz) */ timer0_interrupt_settings(); // Apel rutina setare TIMER0 do while(1); // Bucla intreruptibila