1

Curs de Biofizică

Prof.dr. Cipriana ŞtefănescuDisciplina de Biofizică

şi Fizică medicală

9

Vă rugăm: gândiţi!

MICROSCOPIA ELECTRONICĂ

Antarctic Mite -

Principiul fizic al microscopiei electronice Interacţiunea dintre un fascicul de electroni şi

preparat Partile principale ale unui microscop electronic

- Microscopul electronic de transmisie -TEM- Microscopul electronic de baleiaj - SEM

Tehnici în relaţie cu microscopia electronică

Subiecte principale:

2

Istoria microscopiei electroniceDATA NUME EVENIMENT

1897 J. J. Thompson Descoperirea electronului

1924 Louis de Broglie Identificarea lungimii de unda a electronilor in miscare

l=h/mvunde:l = lungimea de unda h = constanta lui Planck m = masa v = viteza

(Pentru un electron la 60kV, l = 0.005 nm)

1926 H. Busch Efectul de lentila (asupra electronilor) al câmpurilor magnetice sau electrice

1929 E. Ruska (Teza de doctorat) cu privire la lentilele magnetice

1931 Knoll & Ruska Construirea primului microscop electronic

1931 Davisson & Calbrick Proprietatile lentilelor electrostatice

1934 Driest & Muller Depăşirea rezoluţiei MO

1938 von Borries & Ruska Primul EM (Siemens) - 10 nm rezolutie

1940 RCA EM comercial cu rezolutie 2.4 nm

1945 1.0 nm rezolutie

Microscopie electronica TEM imagini ale membranei

Scala lucrurilor vizibile macro si microscopic:

3

Rezoluţia

Microscopia optica: detalii care nu sunt vizibile cu ochiul liber. Microscopia electronica putem vedea detalii care nu sunt vizibile nici

cu ochiul liber si nici in microscopia optica.a) Drosophila melanogaster, o musculiţă des folosita ca model animalb) detalii din zona capului (microscopie optica)c) detalii ale ochiului (SEM) (Tobin, Morell)

Principiul fizic al microscopiei electronice

4

Ipoteza: Orice particulă în mişcare asociază o undă cu lungimea de undă l

Ecuaţia lui Louis de Broglie, 1923:

l = h/p = h/mv

unde:h – constanta lui Planckp = impulsul particuleim = masa particuleiv = viteza particulei

Dacă viteza creşte, l scade, puterea de rezoluţie creşte:

l = h/p = h/mvdar

d = l/2n sin upr = 1/d = 2n sinu / l

unde:pr = puterea de rezoluţied = distanţa minimă dintre 2 puncte care pot fi văzute separatn = indicele de refracţieu = unghiul de deschidere al microscopului.

Ex: pt 10 kV, - 130 nm, pt 100 kV, - 30 nm .

Interactiunea dintre

fasciculul de electroni si

preparat

5

Tipuri de semnal dupa interactiunea fascicului de elctroni cu preparatul

Fascicul incident de electroni (5-40 kV)

Electroni transmişi: TEM

Raze X:nuclear

microanalysis

Electroni secundari: SEM

Electroni retrodifuzaţi

Semnal în vizibil, U.V., I.R. Fenomen de cato-

doluminescenţa

preparat

electroni Auger

Electroni împrăştiaţi inelastic

Electroni împrăştiaţi elastic

Electroni transmişi nedeviaţi

Producerea diferitelor tipuri de particule la interactiunea electronilor incidenti cu atomii:

6

Imagini TEM

Părtile principale ale unui microscop electronic:

- Microscopia electronica de transmisie - TEM

- Microscopia electronica de baleiaj - SEM

Comparatie intre principiul microscopului optic si cel al microscopului electronic:

7

Partile principale ale unui microscop electronic:

Tunul electronic :

Fascicol de electroni

Anod

Filament Tungsten

Catod

Efect termionic

Sursa de electroni

8

Lentilele electromagnetice•Un câmp magnetic intenseste generat prin trecerea unui curent electric printr-ospirală metalică.

•Acest câmp magnetic acţionează ca o lentilă convexă asupra traiectoriei electronilor.

•Distanţa focală poate fi modificată prin modificarea intensităţiicurentului electric.

•Imaginea este rotită dependent de puterea lentilei.

Microscopul electronic prin transmisie

Principiul TEM Se folosesc electroni

transmişi elastic prin probă

e sunt focalizaţi de 2 lentile condensor,

În final e trebuie să iradieze toată suprafaţa probei

Proba este aşezată pe o grilă electrostatică

Lentilă obiectiv Lentilă intermediară,

reglaj fin Lentile de proiecţie Ecran fluorescent sau film

9

Microscopul electronic de transmisiecomparatie cu microscopul optic

Sursa Lentile condensor Lentile obiectiv Lentile de proiecţie

Grilă electrostatică: 100 nm grosime (cupru, molibden, aur platina)

Grosime preparat: sute de nanometri

Imagine MET

Cross section through rat ventricular myocytes. A. Nucleus, B. Mitochondria, C. cross section of

myosin (thick filaments) and actin (thin filaments), D. caveolae, scale bar 500nm

Parisa Asghari, Researcher in Dr. Ed Moore's lab, Department of Cellular and Physiological

Sciences, UBC

Bacillus subtilus

10

Microscopul electronic prin transmisie

11

Calitatea imaginii

Mărirea: raportul dintre mărimea imaginii şi mărimea obiectului

Rezoluţia: 0,1 – 0,2 nm Luminozitatea: depinde de numărul de

electroni transmişi (intensitatea fascicolului incident + caracteristicile probei)

Marcheri electrono-opaci: elemente cu numar atomic mare (Osmiu, Plumb) care cresc contrastul (absorb electroni)

Calitatea imaginii mărirea, raportul dintre mărimea imaginii/mărimea

obiectului, rezoluţia, cu atât mai bună cu cât l este mai mică şi

apertura mare (care, însă, măreşte aberaţiile de sfericitate) la diafragme de 20-70 m rezoluţia este 0,1-0,2 nm,

luminozitatea imaginii depinde de numărul de electroni transmişi

intensitatea fascicolului incident caracteristicile probei,

raportul semnal/zgomot (semnal util/perturbator), marcherii electrono-opaci utilizaţi.

Microscopul electronic cu baleiaj

12

Principiu Un spot de electroni baleiază suprafaţa probei (punct cu

punct) Se folosesc electronii secundari emişi din probă Energie mică (0 – 50 eV) Imaginea se formează pe un ecran fluorescent sau pe o

peliculă fotografică Se obţin imagini ale suprafeţei unei celule, a unui

microorganism sau a unui ţesut, de unde impresia de imagine tridimensională.

Mărire maximum 200 000 x, cu rezoluţie de 3,5 nm.

Microscopul electronic cu baleiajAlcătuire:- tun electronic: fascicol de e cu diametrul de 50nm- 2-3 lentile condensoare: spot e de 2 nm- o lentilă condensoare de reglaj fin- detector , cristal de scintilaţie, amplificare- ecranul unui tub catodic sau al unui monitor

13

Caracteristici Mărire: maxim x 200 000 (dependentă de

lungimea baleiajului orizontal) Rezoluţie 3,5 nm; cu atât mai bună cu cât

diametrul spotului este mai mic Luminozitatea fiecărui punct depinde de

numărul de e secundari emişi şi înregistraţi din punctul respectiv (unghiul sub care cade spotul de e pe preparat, prezenţa metalelor grele – emit mai mulţi e).

Un fascicul de e cu energie prea mare smulge mai mulţi e secundari; scade contrastul.

Proporţii

Influenţarea emisiei de electroni secundari:

- unghiul sub care cade spotul pe preparat,

- elementele grele apar mai luminoase, deoarece emit mai mulţi electroni secundari,

- energia electronilor incidenţi: un fascicol de electroni de energie mare smulge mai mulţi electroni secundari, din toate zonele preparatului, astfel încât micşorează contrastul.

14

MEB - des érythrocytes humains vieilles

limphocyt B

Différents grains de pollen

Transformare in sferocit

Leptocit si microsferocit

Transformare in echinocit

Hematii normale

TEM versus

SEM

15

In TEM electronii traversează preparate foarte subţiri (50-1000 nm). Fascicol de e care iradiază toată suprafaţa probei (“bulk”).

In SEM semnalul (electroni secundari) este emis de pe suprafaţa preparatului care are grosime mai mare. Fascicolul de e este foarte fin (subţire).

SEM: imagini ale suprafeţei

TECHNIQUE RESULTS

Scanning electron micro-scopy (SEM). Micrographs takenwith a scanning electron micro-scope show a 3D image of the surface of a specimen. This SEM shows the surface of a cell from a rabbit trachea (windpipe) covered with motile organelles called cilia. Beating of the cilia helps moveinhaled debris upward toward the throat.

(a)Cilia

1 µm

16

TEM: detalii ale structurii interne:

Transmission electron micro-scopy (TEM). A transmission electron microscope profiles a thin section of a specimen. Here we see a section through a tracheal cell, revealing its ultrastructure. In preparing the TEM, some cilia were cut along their lengths, creating longitudinal sections, while other cilia were cut straight across, creating cross sections.

(b)

Longitudinalsection ofcilium

Cross sectionof cilium

1 µm

TEM/SEM

Glomerular membrane The head of an ant

TEM / SEM: limfocit infectat de un retrovirus

17

TEM SEM

Microscopul electronic de transmisie (TEM)1: Tunul de electroni.. 2 Lentile electro-magnetice pentru dirijarea si focalizarea fascicolului de electroni in interiorul coloanei. 3: Sistemul pompelor de vid. 4: Deschiderea prin care se introduc obiectele pentru observatie in camera de vidare. 5: Panouri de operare (stanga pentru aliniere; dreapta pentru marire si focalizare; sageti pentru pozitionarea obiectului in interior). 6: Ecran pentru afisarea meniului si a imaginii. 7: Apa pentru racirea instrumentului.

Microscopul electronic de baleiaj (SEM)1: Tunul de electroni. 2 Lentile electro-magnetice pentru dirijarea si focalizarea fascicolului de electroni in interiorul coloanei. 3: Sistemul pompelor de vid. 4: Deschiderea prin care se introduc obiectele pentru observatie in camera de vidare in modul SEM normal. 5: Panoul de operare cu instrumente de focalizare, aliniere si marire precum si un joystick pentru pozitionarea obiectului. 6: Ecran pentru afisarea meniului si a imaginii. 7: Unitate-Cryo pentru prepararea materialelor inghetate inainte de introducerea in camera de observare in modul Cryo-SEM . 8: Partea de electronica a microscopului aflata sub masa de lucru.

Tehnica de criofractură :

Criofractura a permis evidenţierea aranjării proteinelor în biomembrane

18

SEM imagini ale hematiei:

Paianjen acoperit cu atomi de aur, preparat pentru MEB

19

Imaginea MEB (SEM) a unui paianjen …

Electron microscope image of a fly foot

Avian flu virus is one of at least a dozen potentially deadly

infectious diseases that may become more widely distributed

because of global climate change.

Microanaliza nucleară

1948-1950, Raymond Castaing –părintele microanalizei nucleare

(teza de doctorat)

20

La interacţia unui fascicul îngust (sub un micrometru) de electroni cu un eşantion, fiecare element chimic produce radiaţii X cu o lungime de undă caracteristică, conform legii Moseley.

Cu ajutorul unui spectrograf de radiaţii X se obţine reprezentarea grafică a lungimilor de undă a radiaţiilor X emise şi se poate afla, deci, natura chimică a elementelor prezente.

- MEC

- microsonda electronica

- spectrograf de radiatii X

1 – tun electronic, 2 – anod, 3 – lentila condensor, 4 –spectrometru cu raze X, 5 –lentila objectiv, 6 – preparat, 10 – sistem vacuum (vid).

PrincipiuLegea Moseley: se referă la radiaţia X caracteristică emisă de atomi.

Frecventa radiatiei X emise de un atom depinde de:

-Numărul atomic Z al ellementului

-Numerele cuantice principale ale nivelelor între care are loc tranziţia(n,k)

-2 constante (Riedberg - R, o constantă de ecran - s)

nkn = R(Z-s)2 (n-2 - k-2)

21

Microscopia ionica

Imaginea unor atomi de tungsten – prima

imagine in microscopia ionica

Principiu asemanator cu al MEB, dar se utilizeaza un fascicul de ioni (rezultat din trecerea unui curent printr-un mediu intens ionizat) care interactioneaza cu suprafata

probei, determinand producerea de alti ioni, in relatie cu natura atomilor de suprafata.

Acestia sunt colectati de un spectrometru de masa si determina formarea imaginii.

Imaginea unui

fragment de ADN văzut

pentru prima oară graţie

MET.

Imaginea obţinută cu ajutorul unui MET -

se poate distinge poziţia atomilor

Atom de aur - imagine obţinută cu MET

Schema de principiu

Microscopul prin efect tunel(MET)

22

Microscopul electronic cu baleiaj prin efect tunel (MET)

A fost proiectat (inventat) de Gerd BINNING (Germania) şi Heinrich ROHRER(Elveţia) în anul 1982. În 1986 cei doi fizicieni au fost distinşi cu premiul Nobel pentru

Fizică, împreună cu Ernst RUSKA (Germania, pentru proiectarea şi construirea în 1933 a primului microscop electronic prin transmisie).

În cazul microscopului cu efect tunel (MET) nu este necesară o sursă externă de radiaţii, energia fiind furnizată de înşişi electronii din stratul superficial al preparatului.

În conformitate cu fizica clasică, un electron poate părăsi atomul numai dacă primeşte o energie mai mare decât energia sa de legătură. Adică, trebuie să treacă

„peste” bariera de potenţial. În mecanica cuantică, dat fiind caracterul dual al electronilor, corpuscul şi undă, şi datorită incertitudinii poziţiei lor (principiul lui

Heisenberg) electronii pot trece „prin” bariera de potenţial, cu o probabilitate cu atât mai mare cu cât bariera de potenţial este mai îngustă.

Acest efect poartă numele de EFECT TUNEL.Similar, în cadrul fizicii clasice, electronii nu pot părăsi proba decât dacă primesc

suficientă energie. Conform mecanicii cuantice, ei formează, prin efect tunel, un nor de electroni deasupra suprafeţei. Densitatea norului de electroni variază exponenţial cu

distanţa: scade de 10 ori la o distanţă de 1Å (10-10 m sau 0,1 nm). Acest fapt este folosit în microscopul cu efect tunel.

În principiu, MET este alcătuit dintr-un electrod (ac extrem de fin, cuvârful format dintr-un singur atom), o parte electronică şi un calculator. Electrodulse apropie de suprafaţa probei de examinat la o distanţă de circa 10Å pt a pătrundeîn norul electronic al atomilor probei. Se aplică o diferenţă de potenţial de câţivazeci de milivolţi între electrod (+) şi suprafaţă. Între electrod şi suprafaţapreparatului apare un curent electric datorită efectului tunel care, după cum ammenţionat, constă în trecerea unor electroni prin bariera de potenţial. Acest curentare o intensitate foarte slabă, de câţiva nA sau chiar pA. Ca urmare, esteindispensabil un sistem de amplificare. Electrodul baleiază o parte din suprafaţa decâţiva micrometri pătraţi. În timpul acestui baleiaj un sistem electronic forţeazăelectrodul să îşi modifice distanţa (faţă de poziţie medie) astfel încât intensitateacurentului tunel să fie păstrată constantă. Prin înregistrarea acestor variaţii dedistanţă se obţine un fel de hartă în relief şi în perspectivă a suprafeţei. Cea maimare dificultate constă în eliminarea oricărei vibraţii mecanice, care ar falsificarezultatele. De asemenea, este necesară prepararea suprafeţei în ultravid, pentruprevenirea contaminării acesteia. Totodată, se impune controlul manevrelor deapropiere a electrodului şi baleierea unor distanţe foarte mici ale suprafeţei. Dacăse baleiază o lungime de 1 nm, care se afişează pe un ecran de 10 cm, rezultă omărire de 100 000 000 (108). Se poate obţine o rezoluţie laterală de 2Å. Cumicroscopul cu efect tunel pot fi identificate elementele chimice, deoarece norulelectronic are o configuraţie specifică fiecărui element.

MET- elemente esentiale

Densitatea norului de electroni variază exponenţial cu distanţa.

EFECT TUNEL rezoluţie de 2Å Cu microscopul cu efect tunel pot fi

identificate elementele chimice, deoarece norul electronic are o configuraţie specifică fiecărui element.

23

Microscopia de forta atomica

BINNING a inventat în 1986 microscopul de forţă

atomică.

În acest caz se foloseşte pentru explorarea suprafeţei, în locul

curentului tunel, deplasarea acului datorită forţei

exercitate între probă şi ac.

Comparison of resolutions of different

microscopes.STM: shaded area. HM: high-resolution optical microscope. PCM: phase-contrast microscope (S)TEM: (scanning) transmission electron microscope SEM: scanning electron microscope REM: reflection electron microscope FIM: field ion microscope. Binnig and Rohrer, 1982