Inginerie citotisulara si organe bioartificiale

an IV - Bioinginerie

Biocompatibilitatea -interactiunea biomaterial-organism

- interactiunea cu proteinele;

-interactiunea cu enzimele;

-interactiunea cu celulele.

Fenomene la interfata biomaterial-organism

Interactiunea biomaterial-organism poate fi reprezentata schematic sub forma:

Unul dintre cele mai importante fenomene care au loc la suprafata de separatie este fenomenul de sorbtie. Sorbtia este un fenomen fizico-chimic caracteristic amestecurilor formate din cel putin doua faze sau doua componente, si se datoreste fortelor de legatura dintre particulele chimice. La contactul dintre doua faze se produce o concentrare a substantelor repartizate intre aceste doua faze, la suprafata de separatie, urmata aproape intotdeauna si de o concentrare in interiorul fazelor respective, mecanismul concentrarii fiind cel mai adesea fizic ( adsorbtia fizica sau absorbtia) si chimic ( adsorbtie specifica, chemosorbtie).

Interactiunea biomaterialelor cu proteinele

Multitudinea de proteine existente la nivelul corpului uman si varietatea de structura si proprietati ale acestora, determina manifestarea unor interactiuni complexe cu biomaterialul, interactiuni care vor afecta si procesele biologice de la nivelul celulelor sau ale matricii extracelulare.

Relatia biomaterial- component proteic

Se constata prezenta atât a proteinelor fibrilare (colagenul, elastina, laminina), cât si a proteinelor globulare( albumina, imunoglobulina), deci o varietate de structuri chimice proteice si o multitudine de tipuri de amestecuri proteice. Pentru a studia , in aceste conditii, fenomenul de adsorbtie al proteinelor la suprafata biomaterialelor, trebuie abordate procesele atât din punct de vedere termodinamic cât si din punct de vedere cinetic.

Termodinamica proceselor de adsorbtieFenomenologic, un sistem se afla in stare de echilibru daca in conditii de

mediu constante nu are loc nici o modificare a sistemului. La presiune si temperatura constante, starea de echilibru a unui sistem este caracterizata de o valoare minima a energiei totale Gibbs:

STHG adsadsads = variatia energiei libere Gibbs; = variatia entalpiei la trecerea unui mol de proteina din stare conformationala nativa in stare perturbata nativa; = variatia de entropie.

Orice alta stare fata de acest minim de energie este o stare de neechilibru si se vor produce tranzitii spontane spre starea de echilibru, daca bariera energetica de-a lungul tranzitiei nu variaza in limite foarte largi.

Gads

Hads

Sads

Datele de adsorbtie a proteinelor la suprafata biomaterialelor sunt, cel mai adese, prezentate sub forma izotermelor de adsorbtie, unde, la temperatura constanta se inregistreaza variatia cantitatii de proteina adsorbita in functie de concentratia acesteia in solutie.

Izoterme de adsorbtie a proteinelor; a)izoterma de inalta afinitate; b) izoterma la care ramura descendenta arata o mai mare afinitate intre

proteina si suprafata sorbanta.

Aceasta deviere intre ramura ascendenta si cea descendenta a izotermei de adsorbtie poarta numele de histereza.

Luând in considerare caracterul adsorbtiei proteinei se poate spune ca procesul are loc in trei etape :• transportul proteinei la limita energetica a suprafetei;• interactiunea si atasarea la suprafata ( pot aparea perturbatii in structura proteinei);•relaxarea proteinei adsorbite la o stare stabila din punct de vedere conformational.

Adsorbtia proteinelor la suprafata

biomaterialelor

Cinetica proceselor de adsorbtie a proteinelor la suprafata biomaterialelorAnalizând procesul de adsorbtie din punct de vedere cinetic, adica prin

prisma variatiei in timp a cantitatii de proteina adsorbita pe suprafata, s-au propus trei faze la contactul proteina- biomaterial:

Etapele adsorbtiei proteinelor

NucleatiaNumarul de puncte disponibile pentru legaturi monomoleculare (puncte

de nucleatie) difera de la suprafata la suprafata, dar in general este de ordinul 109-1010 molecule/cm2. Este foarte dificil de masurat aceste legari initiale ca urmare a timpului de urmarire f. redus.

St Rsk t N N max

k tkT

tdes

exp

Viteza de nucleatie:

k(t) = probabilitatea de blocare a legaturii independente la punctele de legare (Nmax);N - numarul de situri de nucleatie ocupate; - frecventa de coliziune cu punctele de nucleatiedes - energia de activare a unei molecule;Rs - fluxul molecular spre suprafata ( numarul de molecule care lovesc 1 cm2 de suprafata in timp de 1 secunda) si este dependent de conditiile de difuzie si de concentratia proteinei

CrestereaFormarea unuia sau a mai multor agregate tridimensionale pe suprafata

se poate realiza daca energia libera de interactiune scade odata cu numarul de molecule adsorbite. Aceasta energie va fi rezultanta intre intensitatea interactiunilor intermoleculare proteina-proteina si interactiunile suprafata- proteina.Ecuatii cinetice pentru crestere:

St sR f t N

f t tkt kt

tsd des

1

1 exp

sd - energia libera de activare pentru difuzia moleculelor la suprafata - densitatea de situri de legare independent - frecventa de coliziune cu siturile de nucleatie Legea logistica de crestere limitata ( Smith C )

St

g tS

Se

des

kt

1max

Smax - numarul maxim de moleculeg(t) - functie de timp si corespunde probabilitatii de interactiune favorabile intre moleculele legate si cele care difuzeaza spre suprafata

DesorbtiaDependenta de timp a desorbtiei este limitata de geometria agregatelor

in adsorbite, numarul de ciocniri ale macromoleculelor cu agregatele si densitatea fluctuanta a moleculelor blocate la suprafata.

St

Skt

n des

exp

S

th S S e S So

ktdes

;0 0

h() - viteza de desorbtie, care depinde de frecventa de coliziune si durata de adsorbtieS0 - numarul de molecule la care densitatea de suprafata devine constanta

Viteza de adsorbtie, tinând cont de nucleatie, crestere si desorbtie limitata poate fi scrisa:

St

R N N k t Nf t h S Ss max 0

Adsorbtia competitiva a proteinelorEcuatiile cinetice permit descrierea procesului de adsorbtie in cazul in

care in sistem se gaseste o singura specie proteica. Intrebarea care apare este: ce se intâmpla in cazul in care in mediu se afla proteine diferite? Cum se poate aborda problema adsorbtiei in cazul plasmei sanguine, care contine peste 100 proteine diferite, din care cel putin 12 au o concentratie 1mg/ml?

Inca din anii 1960 Leo Vroman, studiind adsorbtia fibrinogenului din plasma la diferite tipuri de materiale( sticla, tantal anodizat, oxid de siliciu), pentru intervale reduse de contact, folosind tehnici imunologice (si anume urmarind reactivitatea fata de ser de antifibrinogen), constata ca in timp are loc o indepartate a acestei proteine de la suprafata.

Variatia cantitatii de fibrinogen adsorbita in timp

la suprafata:----sticlei si poli(metilmetacrilatului)

Variatia cantitatii de fibrinogen adsorbit din

plasma pe biomaterial in functie de concentratia in

plasma a acestuia

Deoarece tehnicile utilizate de Vroman nu erau suficient de performante, el nu reuseste sa deceleze cauzele care determina cresterea activitatii imunologice. El considera ca fenomenul putea fi datorat modificarilor structurale si orientationale ca urmare a imobilizarii proteinei pe suprafata solida, inlocuirii fibrinogenului de catre alte proteine plasmatice, digestiei porteolitice a fibrinogenului adsorbit de catre enzime sau mascarea fibrinogenului de catre proteinele adsorbite. Ulterior, utilizâdu-setehnici avansate (fibrinogen marcat si tehnici ELISA) s-a aratat ca fibrinogenul adsorbit este inlocuit la suprafata biomaterialelor de catre proteine plasmatice cu o afinitate mai mare la suprafata.

Totusi, ca o recunoastere in depistarea fenomenului, acest proces poarta numele de “efect Vroman”. Studiile efectuate pe alte tipuri de proteine si suprafete ( polietilena, polistiren), au aratat generalitatea efectului Vroman.

De exemplu, pentru o suprafata hidrofoba si proteina in stare hidrofoba. Atât suprafata cât si proteina vor fi inconjurare de molecule de apa aranjate nefavorabil dpdv energetic:

Adsorbtia si desorbtia proteinelor la suprafata biomaterialului

Mecanismul adsorbtiei competitive a proteinelorLuând in considerare efectul Vroman, s-a incercat elaborarea unui mecanism de adsorbtie al proteinelor la suprafata biomaterialelor, cât mai realist. Aceasta presupune stabilirea influentei fortelor de interactiune care se manifesta la interfata biomaterial – proteina si intre proteinele adsorbite si cele in curs de adsorbtie.

Molecula proteica se va deplasa ca urmare a agitatiei termice si se va ciocni cu suprafata. Acesta ciocnire va avea ca rezultat indepartarea stratului de molecule de apa dintre proteina si suprafata. Daca energia rezultata in urma acestui proces este mai mare decât energia termica a moleculei proteice, aceasta va ramâne pe suprafata. In caz contrar se intoarce in solutie.

Contributia interactiunilor electrostatice la mecanismul de adsorbtie, conform estimarilor cantitative, este secundara iar fortele Van der Waals sunt neglijabile.

Ce se poate spune despre procesul de desorbtie?

Asa cum am amintit , moleculele proteice adsorbite pot fi inlocuite de alte molecule proteice. O confirmare a acestui fapt o constituie si studiile de circulatie a unor solutii tampon peste suprafetele cu proteine adsorbite, când fenomenul de desorbtie nu se produce.

Prezenta moleculelor proteice in solutie diminueaza interactiunile dintre molecula proteica adsorbita si suprafata prin efecte asupra retelelor moleculelor de apa dispuse in jurul acestora. Acesta va determina modificarea balantei dintre fortele entropice si cele hidrofobe, producându-se desorbtia.

In cazul prezentat, daca o molecula este adsorbita pe suprafata, si alte doua molecule proteice se afla in solutie, ca urmare a interactiunilor dintre proteinele aflate in solutie si molecula adsorbita pot aparea doua situatii:

• intensitatea interactiunilor proteina adsorbita - proteina din solutie este mai mare decât intensitatea interactiunilor proteina- suprafata => desorbtia;

• intensitatea interactiunilor proteina adsorbita - proteina din solutie este mai mica decât intensitatea interactiunilor proteina- suprafata si proteina ramâne pe suprafata.

Interactiunile electristatice au si ele o contributie, viteza de desorbtie fiind dependenta de concentratia la suprafata a proteinei si concentratia totala a amestecului proteic. Constanta vitezei de desorbtie va reflecta interctiunile hidrofobe, electrostatice si entropice intre molecula proteica adsorbita si suprafata, când este inconjurata de alte molecule proteice.

Ecuatia cinetica Nadarajah A. propune o ecuatie semiempirica de viteza de adsorbtie care sa ia in considerare:• influenta fortelor moleculare dintre moleculele proteice si suprafata, tinând cont de chimia suprafetei si topografia sa;• introducerea acestor forte intr-o ecuatie de viteza microscopica, utilizând mecanica statistica, pentru mecanismul de adsorbtie/desorbtie propus;• extinderea ecuatiei microscopice la o ecuatie de viteza macroscopica

ddt

k c k c kii i i i i i i

1 1 21

ddt

kii i

2

ii

ii

i - se refera la proteina i din amestecci, c - conc molare ale proteinei i si totale pentru toate proteinele din amesteci si i - fractia din suprafata acoperita reversibil si ireversibil de proteina i.

In momentul in care o suprafata si un amestec de proteine vin in contact, initial toate proteinele sunt distribuite uniform in solutie. La contactul cu suprafata, proteinele se vor adsorbi formând un strat proteic pe biomaterial. Formarea mai multor straturi presupune manifestarea unor interactiuni puternice intre proteine si este posibila in cazul proteinelor care in solutie se afla sub forma de agregate (insulina). Proteinele cu afinitatea de suprafata cea mai mare (cel mai mare k) se vor adsorbi preferential. Totusi, procesul este limitat de transportul de masa si prima proteina adsorbita va fi una cu cea mai mare viteza de transport. Eventual, proteina cu urmatoarea valoare a vitezei de difuzie isi va creste concentratia la suprafata, dar va putea inlocui prima proteina adsorbita numai daca afinitatea de suprafata este mai mare. Procesul continua pâna când proteina cu afinitatea cea mai mare acopera suprafata, este adsorbita si mentine echilibrul.

Acest mecanism complex de adsorbtie in amestecuri de proteine este strict dependent de vitezele diferite de transfer de masa ale proteinelor si adsorbtia competitiva la suprafata.

Influenta masei moleculare medii a proteinei asupra adsorbtiei competitive a proteinelor din amestecuri

Pentru a explica influenta masei moleculare medii a proteinelor asupra adsorbtiei competitive se considera doua proteine, “A” si “B”, având masele moleculare medii (MM) si coeficientii de difuzie in conditiile:

1) MMA< MMB (masa moleculara medie a proteinei B este de doua ori mai mare decât a proteinei A);

DA>DB (coeficientul de difuzie al proteinei A este mai mare decât coeficientul de difuzie al proteinei B).

2) Fiecare proteina prezinta doua stari de adsorbtie, “1” si “2” cu diferite conformatii si stari caracteristice (1- adsorbtia initiala; 2-starea perturbata dar stabila).

Ca urmare a modificarilor conformationale, proteina poate trece din starea 1 in starea 2. Constantele vitezelor de adsorbtie(kads), desorbtie(kdes), tranzitie(ktr) si de inlocuire(kd) depind de tipul centrului de adsorbtie. Procesul poate fi schematizat:

Schema adsorbtiei competitive a proteinelor pe suprafata biomaterialului

(MMA<MMB)

Constantele vitezelor de tranzitie de la stadiul 1 la stadiul 2 se diminueaza odata cu scaderea constantelor vitezelor de adsorbtie in timp ce constantele vitezelor de desorbtie pot sa creasca odata cu scaderea constantelor vitezelor de adsorbtie. Un astfel de fenomen are loc atunci cand proteina A este albumina serica umana(MM=66000) si proteina B este - globulina umana(MM=150000) când sunt posibile situatiile:

• adsorbtia preferentiala a proteinei B cu masa moleculara mare;• competitia intre moleculele A si B pentru centrele de adsorbtie;• orientarea preferentiala a proteinelor adsorbite in starea “1”;• inlocuirea proteinei adsorbite B in starea “1” de catre proteina A(din considerente de

afinitate pentru suprafata).

Interactiunea proteinelor cu substantele tensioactive la suprafate solide

Interactiunile intre proteine si tensioactivi( agenti de suprafata sau surfactanti) se manifesta in diferite aplicatii care implica proteinele in contact cu suprafete solide. Astfel, surfactanti si proteine sau peptide pot fi prezenti simultan in timpul proceselor de izolare a proteinelor si pentru minimizarea pierderilor de substanta activa in timpul administrarii medicamentelor. Alta sfera de aplicatii a acestor interactiuni o constituie domeniul stomatologic, unde asa numitii agenti anti-tartru sunt utilizati pentru indepartarea placilor depuse. Gradul de indepartare a proteinei adsorbite, de catre surfactanti, poate fi de asemenea utilizat ca indicator al modului de atasare al proteinei la suprafata, in mod particular in evidentierea conformatiilor pe care le adopta proteina adsorbita pe o suprafata solida.

Proteina adsorbita poate exista sub forma mai multor fractii care difera prin modul de legare la suprafata. Aceste fractii pot fi diferentiate prin intensitatea legarii, fenomen care poate fi pus in evidenta prin spalare cu solutii tampon, adaos de surfactanti sau prin susceptibilitatea de modificare a conformatiilor.

Surfactantii au tendinta sa se adsoarba la cele mai multe suprafete, determinând reducerea semnificativa a energiei suprafetei.

Surfactantii sunt adesea clasificati in functie de gruparea lor de capat in:anionici, cationici si neionici. Proprietatile partii hidrofobe, ca si gruparea de capat hidrofila vor afecta afinitatea moleculei pentru suprafata. Ca urmare a tendintei puternice a partii hidrofobe de a evita contactul cu apa, are loc o autoasociere atât in solutie cât si la interfata, fenomen ce va influenta caracteristicile de adsorbtie. Autoasocierea va conduce la formarea de micele sferice, structuri lamelare sau cubice de tip reversibil

Adsorbtia surfactantilor la suprafete solide

Interactiuni proteina-surfactant in solutieIn amestecuri de proteina si surfactanti, ca urmare a interactiunilor care se manifesta intre componente, are loc formarea de complecsi proteina-surfactant, care au proprietati diferite de cele ale proteinelor pure. Legarea surfactantilor de proteina, deci formarea complecsilor va reduce concentratia de molecule de surfactant liber pentru a interactiona cu proteinele la interfata unui suport solid.Surfactantii ionici interactioneaza cu proteinele in solutie, interactiunile fiind mai puternice in general pentru cei anionici decât pentru cei cationici. Aceste interactiuni vor fi conditionate de: natura proteinei si a tensioactivului, pH, taria ionica.Surfactantii neionici interactioneaza putin cu proteinele solubile. S-a observat manifestarea a trei tipuri de interactiuni:

• legarea surfactantilor prin interactiuni electrostatice sau hidrofobe la sutusurile proteice(ex: - lactoglobulina si albumina serica);

• adsorbtia surfactantilor la proteina fara modifcari conformationale;• legarea la proteina urmata de modificari conformationale.Aceste trei tipuri de interactiuni se pot manifesta in acelasi sistem daca concentratia

surfactantului este adecvata. Modificarile conformationale conduc la transformari in structura secundara. S-a sugerat existenta a câtorva modele privind legarea surfactantilor la proteine si pentru formarea complexelor proteina-surfactant(perle, modelul helixului flexibil).

Interactiunea surfactantilor cu proteine adsorbiteIndepartarea proteinelor adsorbite de catre surfactanti a fost intens studiata de Horbett M., care introduce termenul de”elutabilitate”, termen care descrie gradul de indepartare al proteinelor de catre surfactanti.

Gradul de elutabilitate este afectat de factorii care influenteaza legarea proteinelor la suprafata:• concentratia proteinei;• temperatura;• timpul de adsorbtie;• tipul de suprafata si tipul de surfactant.

De asemenea, autoasocierea surfactantilor joaca un rol major, inlocuitorii neasociativi putând indeparta cantitati mai mari de proteina.

Influenta proprietatilor proteinelorAsa cum s-a mentionat, interactiunile intre surfactanti si proteine pot conduce la complecsi cu structura specifica, in special la concentratii mici de surfactant. La concentratii mai mari de surfactant, aceste efecte sunt mai putin pronuntate.Studiile efectuate pe 6 proteine model(cytocrom C, albumina serica bovina, -lactoglobulina, lizozom si ovalbumina), cu acelasi tip de surfactant si aceeasi suprafata au evidentiat faptul ca cantitatea de proteina indepartata este mai mica cu cât masa moleculara medie a materialului proteic este mai mare. Stabilitatea conformationala a proteinei si cresterea temperaturii de denaturare are acelasi efect. Se poate spune deci ca factorii care tin de stabilitatea structurala a proteinei au o mare importanta si ca cresterea stabilitatii conduce la scaderea gradului de indepartare.

Influenta proprietatilor surfactantilorSurfactantii pot interactiona fie cu proteina din solutie, fie cu suprafata sau cu ambele(cel mai adesea). Se pot face urmatoarele observatii:in cazul suprafetelor hidrofobe cantitatea de proteina indepartata este cu atât mai mare cu cât activitatea fata de suprafata a surfactantului creste; surfactantii neionici nu afecteaza cantitatea de proteina adsorbita la suprafete hidrofile dar au un efect considerabil in cazul suprafetelor hidrofobe; lungimea catenei agentului tensioactiv influenteaza concentratia surfactantului de la care incepe procesul de indepartare al proteinei; de asemenea, cu cât lungimea partii hidrocarbonate este mai mica se inlocuieste mai putina proteina;gruparea terminala(hidrofila) influenteaza numai in cazul suprafetelor hidrofile.

Influenta proprietatilor suprafetelorAdsorbtia si orientarea surfactantilor este dependenta de tipul de suprafata si, natural, caracterul suprafetei va influenta modul in care sunt indepartate proteinele de catre surfactanti.S-a sugerat, fara a exista insa o aplicabilitate universala, faptul ca repulsiile electrostatice intre surfactanti si suprafata sau interactiunile puternice(hidrofobe) intre catena hidrocarbonata a surfactantului si suprafata pot favoriza elutia proteinei adsorbite.Toate aceste observatii permit clasificarea efectelor surfactantilor asupra proteinelor in patru categorii:

B) Inlocuirea proteinei de catre surfactant. Aceasta inseamna ca interactiunile dintre surfactant si suprafata sunt mai puternice decât interactiunile dintre proteina sau complexul surfactant-proteina si suprafata. Adsorbtia surfactantului la suprafata este indispensabila, dar legarea surfactantului la proteina poate sa nu se produca.

C) Surfactantul poate adsorbi la suprafata si/sau la proteina dar nu are un efect net asupra cantitatii de proteina adsorbita

D) proteina adsorbita este doar partial indepartata de surfactanti. Elutabilitatea partiala a proteinelor indica prezenta unor stadii multiple de adsorbtie a proteinei.

A) Nici o molecula de proteina nu ramane adsorbita dupa adaos de surfactant. In aceste conditii surfactantul nu se adsoarbe la suprafata. Totusi, el interactioneaza cu proteina si formeaza complecsi care se desorb de la suprafata;

Este important de notat faptul ca surfactantul poate indeparta proteina fara a se lega la suprafata. Acest fenomen poate fi descris ca o solubilizare a proteinelor de catre surfactant.

Experimental, s-a aratat faptul ca prezenta de surfactanti in solutii de proteina pot influenta cantitatea de proteina adsorbita la suprafete solide in trei moduri diferite:

• inlocuirea completa a adsorbtiei proteinei;• reducerea cantitatii de proteina adsorbita fata de solutia de proteina simpla;• cresterea cantitatii de proteina adsorbita.In primul caz, completa indepartare a adsorbtiei poate fi datorata unuia dintre

motivele:- daca un complex se formeaza cu un surfactant care nu prezinta atractie pentru

suprafata;- daca surfactantii adsorb, ca urmare a activitatii lor de suprafata si a difuzivitatii,

conducând la prevenirea adsorbtiei ulterioare a proteinei sau a complexului proteina-surfactant.

In cele doua cazuri, formarea complecsilor in solutie poate conduce la cresterea sau descresterea cantitatii de proteina adsorbita. Prezenta surfactantului influenteaza cantitatea totala de proteina prin efecte sterice sau prin interactiuni electrostatice intre complecsi, fata de proteina nativa. In plus, complexul poate adsorbi sub diferite orientari fata de proteina pura.

Ca urmare a diferitelor forme ale izotermelor de adsorbtie a surfactantilor si proteinelor, a diferitelor tipuri de interactiuni, in amestecuri de proteine adsorbtia va fi puternic dependenta de concentratia componentelor. Caracterul special al izotermelor de adsorbtie a surfactantilor si existenta concentratiei critice micelare influenteaza adsorbtia proteinelor. Acest fapt si reversibilitatea cu dilutia da interactiunilor surfactant-proteina importanta deosebita. Ca si in cazul amestecurilor simple de proteina, si in prezenta surfactantilor se manifesta efectul Vroman.

In general, se poate concluziona ca surfactantii pot interactiona cu proteinele prin mecanism de solubilizare sau inlocuire, in functie de interactiunile surfactant-suprafata si legaturile surfactant-proteina. Soluibilizarea conduce la formarea complexului intre proteina si surfactant, iar inlocuirea are loc ca urmare a adsorbtiei surfactantului la suprafata. Proprietatile proteinei influenteaza gradul de elutabilitate, diferentele intre diferite situatii competitive si adaosul de surfactant dupa adsorbtia proteinelor putând fi puse in evidenta prin compararea complecsilor proteina-surfactant si perturbarea acestora in prezenta de alte proteine din sistem, fata de proteina pura. Diferentele intre difuzivitatea surfactantilor si a proteinelor afecteaza de asemenea modul de interactiune cu suprafata componentelor.

INTERACTIUNEA BIOMATERIALULUI CU FLUIDUL SANGUIN

Notiuni introductive privind functiile sângeluiSângele este un tesut lichid, eterogen, alcatuit din doua faze, una

propriuzis lichida-plasma, care este o solutie apoasa de proteine si saruri minerale, tamponata la pH=7.35- si cealalta solida, corpusculara, reprezentata prin eriltrocite, leucocite si trombocite, suspendate in partea lichida.

Data fiind pozitia sângelui in ansamblul functional al sistemelor lichide din organism- lichid interstitial, intracelular, intravascular- sângele are de indeplinit câteva roluri, care, in esenta se pot concentra in doua functii fundamentale:

functia de transport;

functia reglatoare homeostatica.

Functia de transportAceasta consta in vehicularea, in dublu sens, intrare si iesire, a tuturor

substantelor necesare vietii celulare sau a celor rezultate din metabolismul intermediar. Dintre principalele substante transportate sunt in primul rând cele legate de respiratie, oxigenul transportat de la plamân la tesuturi si CO2 in sens invers. Fiecare eritrocit contine 28milioane molecule de hemoglobina, proteina transportoare de oxigen. Urmeaza apoi substantele nutritive- aminoacizi, acizi grasi, vitamine- provenite din tractul digestiv, precum si produsele finale ale metabolismului intermediar( uree, acid uric) vehiculate pentru eliminare prin rinichi, plamân, pieele, intestin- precum si hormonii transferati de la glandele endocrine catre tesuturi tinta. Proteinele plasmatice transportate pot lega substante cu proprietati hidrofobe, dispunând de o suprafata functionala de 700000m2.

Prin proteinele transportate si proteinele plasmatice de tipul imunoglobulinelor si prin leucocitele sale, sângele ia parte la procesul de aparare specifica organismului. Prin proteinele anticorpi, limfocite, macrofage si plasmocite, sangele asigura desfasurarea proceselor imune fata de agenti infectiosi- virusuri sau bacterii- sau proteine straine.

Functia de transport are deci trei componente principale: respiratorie, nutritiva si de aparare.

Functia reglatoare homeostaticaSe realizeaza cu urmatoarele componente:

izotonie- pastrarea constanta a concentratiilor si raporturilor ionice ( cationi Na+, K+, Ca2+, Mg2+; anioni Cl-, H2PO4

-, HCO3-) si a echilibrului acido-bazic cu mentinerea

concentratiei ionilor de hidrogen la pH=7.35

izotonie- mentinerea la nivel constant a presiunii osmotice a sângelui, proportionala cu numarul de molecule de compusi nedisociati si cu numarul de ioni ai electrolitilor care se gasesc in solutie, dintre care ionii de Na+, Cl-, HCO3

- raspund de 85% din presiunea osmotica totala. Orice marire a presiunii osmotice intr-unul dintre sectoarele hidrice ( intramuscular, extracelular, intracelular) trebuie sa fie compensata, in conditii fiziologice, prin modificari de volum hidric. Izotonia este corelata cu mentinerea constanta a tebloului sanguin. Datorita continutului sau proteic, in special nivelul de concentratie al albuminelor serice, sângele exercita o presiunee coloid-osmotica datorita careia faza lichida este mentinuta in sistemul vasculat;

izotermia- mentinerea constanta a tempereaturii corpului. Se realizeaza datorita fazei lichide a sângelui. Caldura specifica, foarte ridicata a apei, face posibila distribuirea in intregul organism a caldurii ce s-ar putea produce prin reactiile exoterme la nivelul organelor metabolice extrem de active, cum ar fi, de exemplu, ficatul.

Elementele sângelui

Eritrocitele- formate din 60% apa si 40% substanta solida- se compune din:componente minerale(K+, Na+, Ca2+);componente organice hemoglobinice;componente organice nehemoglobinice;enzime.

Leucocitele- formate din:granulocite ( neutrofile, eozinofile, bazofile);monocitul.

Trombocitele ( globulinele)

Plasma: proteine; lipide; compusi anorganici; enzime.

Proteinele plasmaticeSunt un amestec eterogen de aproape 100 componente cu proprietati

fizico-chimice si functii diferite. Greutatile moleculare variaza intre 60000 si 130000.

Functiile proteinelor plasmatice sunt:- mentin volumul normal si prresiunea coloid-osmotica a sângelui, precum si schimburile dintre capilare si tesuturi- albuminele sunt preponderent raspunzatoare de aceasta functie;- transporta hormoni, metale, lipide, vitamine, pigmenti, coloranti, medicamente;participa la procesele de aparare specifica si nespecifica a organismului prin: imunoglobuline, properdina, transferina si la fenomenele de coagulare si fibrinoliza;- participa la mentinerea echilibrului acido-bazic al sângelui, ca sistem tampon, datorita caracterului lor amfoter;- influenteaza vâscozitatea si microcirculatia, contribuind la realizarea unui mediu protector pentru eritrocite, favorizându-le in acelasi timp mobilitatea;- reprezinta o rezerva proteica importanta in situatiile in care aportul proteic scade.

Relatia biomaterial- fluid sanguinRelatia biomaterial- fluid sanguin urmareste, in primul rând, asigurarea

biocompatibilitatii materialului cu functie de proteza sau implant.

Contactul dintre fluidul sanguin si suprafata unui implant declanseaza in primul rând adsorbtia superficiala a proteinelor serice, urmata de aderarea, deformarea si eliberarea plachetelor deci se produce coagularea sângelui.

Fazele si factorii principali ai coagularii

In esenta, fenomenul de coagulare a sângelui consta in transformarea fibrinogenului in fibrina. Particularitatile specifice procesului sunt:

- numarul mare de activatori si inhibitori care intervin;- existenta, ca precursori, a majoritatii factorilor coagularii;- preponderent, factorii coagularii sunt proteaze care rezulta in urma proteolizei limitate din formele lor inactive;- transformarea factorilor coagularii din forme inactive in forme active se face prin autocataliza, determinata de propriile lor produse;- unii dintre factori, ca de exemplu Ca2+ au actiune multipla, intervenind aproape in toti timpii coagularii;- procesul complex se desfasoara in cascada. Faza de latenta este formata de o avalansa de transformari accelerate ale factorilor coagularii, prin forme inactive si forme active.

Fibrinogenul este o proteina cu forma moleculara alungita, una dintre cel mai putin solubila proteina a sistemului sanguine. Are o masa moleculara medie de 330000-340000Da si un pHizoelectric de 5.3. Este alcatuit din 6 lanturi peptidice, grupate câte doua, perechile diferind intre ele prin aminoacidul N-terminal si anume: o pereche are tirozina ca aminoacid terminal, a doua are acidul piroglutamic, iar a treia alanina.Acest factor contine componente glucidice: hexoze, aminozaharuri, acid sialic, oxidarea glucidelor facându-l inapt pentru fenomenul coagularii.Fiziologic, transformarea fibrinogenului in fibrina se petrece in 2-3 secunde sub actiunea trombinei. Transformarea fibrinogenului in fibrina este un fenomen de proteoliza limitata, in cursul careia se formeaza doua lanturi polipeptidice diferite: fibrinopeptidele A si B, conform reactiei:

Fibrinogen--- fibrina + fibrinopeptide A si B

Transformare fibrinogenului in fibrinaPolimerizarea monomerilor de fibrina se face pe doua directii:- longitudinala- cu formarea fibrelor sau fibrilelor primare;- transversala- cu producerea fibrelor secundare de fibrina, datorita puntilor de hidrogen ce se stabilesc intre tirozina si histidina dintre doua fibre primare.

Mecanismul coagularii sângeluiCoagularea sângelui se desfasoara pe doua cai care se deosebesc dupa originea tisulara sau sanguinea a factorului de declansare a procesului in cascada. Calea extrinsica, scurta, cu durate de ordinul secundelor, are doua etape importante: generarea protrombinazei si producerea trombinei. Trombina actioneaza asupra fibrinogenului transformându-l in fibrina. Fibrina formata in aceasta faza este foarte fragila.

Calea intrinsica- pe aceasta cale, mai lenta, a carei durata este de ordinul minutelor sunt intâlnite patru etape:

- generarea protrombinazei;- producerea trombinei;- transformarea fibrinogenului in fibrina si stabilizarea acesteia;- sinereza si retractia cheagului.

In calea intrinsica sunt implicati numai factori sanguini. Procesul este declansat prin activare afactorului XII(factorul Hageman), ca urmare a fenomenului de suprafata de hemosorbtie, pe care-l sufera acest factor de contact la nivelul leziunilor vasculare sau prin contact cu o suprafata straina. Legarea factorului Hageman sau a kininogenului de masa moleculara mare la suprafata unui biomaterial(si in special la suprafete incarcate negativ) face mai usoara activarea acestuia.

Factorul Hageman si kininogenul de masa moleculara mare contin in catena macromoleculara zone bogarte in aminoacidul histidina.

In aceste zone secventa de aminoacizi care se repeta este (Gly-His-X) sau (His-Gly-X). Acest aminoacid cu pK> 10, la valoarea de pH a fluidului sanguine este incarcat pozitiv la N.

CH - CH2- C - N

HC CHN

H

HN

OC+ H+ CH - CH2- C - N

HC CHN

HN

OC

H H

+

Zonele incarcate pozitiv vor fi atrase de catre suprafata.

CH2- C - N

HC CHNH2

CH - NH- CO- CH2-NH-CO -

+

BIOMATERIAL- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Atractia si asocierea aminoacizilor cu grupele negative ale suprafetei determina modificari conformationale ale factorului XII, respective ale kininogenului. Astfel, legatura peptidica din dreptul unor aminoacizi devine sensibila la actiunea hidrolitica a enzimelor. In cazul factorului Hageman, desfacrea legaturii peptidice se realizeaza la nivelul aminoacizilor Arg 353-Val354.

C - CH - NH - C - CH - NH

CH2

CH

CH3 CH3

CH2

NH

C

NH NH2

..OO

H - O - Treonina..

Serina - O - H

Fragmentul proteic rezultat in urma hidrolizei reprezinta factorul Hageman activat, proteina cu conformatie si incarcare electrica diferita de a compusului macromolecular de plecare, si, implicit cu posibilitati de interactiune diferite cu proteinele plasmatice. Urmeaza o serie de pasi care conduc la formarea polimerului de fibrina, instabil, trecut in forma stabila sub actiunea factorului XIII. Fibrina devine insolubila prin constituirea unor punti disulfidice intre glicina terminala a unui monomer si gruparea unui monomer vecin. Urmeaza apoi sinereza cheagului prin expulzarea apei din ochiurile gelului, cu micsorarea spatiilor dintre fibrile. Retractia cheagului se produce numai in prezenta trombocitelor functional normale, care actioneaza prin intermediul factorului I plachetar. In punctele nodale ale retelei de fibrina plachetele functioneaza ca centri mecanici.

Sângele contine si factori inhibitori ai coagularii, care reduc viteza acestui proces. Din grupul antitrombinelor fac parte: fibrina, antitrombina I, heparina sau antitrombina II si antitrombinele III, IV si VII. Anticoagulantele cu aplicare terapeutica mai folosite sunt heparina si antagonistii vitaminei K.

Heparina are ca unitate de repetitie cantitati echimoleculare de resturi de D-glucozamina si acid D-glucuronic. Continutul de sulfat variaza intre 5 si 6,5 resturi de sulfat de tetrazaharida. Are caracter acid, fiind puternic sulfatata.

O

HH

HOH

H NH

HCH2OSO3-

-O3S

O

HH

HOH

H OSO3-

HCOO-

O

HH

HOH

H HN

HCH2OSO3-

SO3-

O

HH

HOH

H OH

HCOO-

O

HH

HOH

H NH

HCH2OSO3-

SO3-

O

HH

H

OOH

H OH

HCOO-

O O O O OH OHn

Heparina inhiba direct atât activitatea factorului X, cat si actiunea enzimatica a trombinei deja formate. Actiunea sa depinde de gradul de sulfatare.

FibrinolizaFibrinoliza este ultima faza a hemostazei, ce are ca efect eliminarea fragmentelor de cheag si a depozitelor de fibrina. Se realizeaza prin mecanism enzimatic fiind catalizata de plasmina sau fibrinolizina. Aceasta scindeaza fibrina in fragmente polipeptidice mici, solubile, care nu mai pot forma retele coerente. Plasminogenul poate fi activat in sistem intra si extravascular. Activatorii se gasesc in sânge si in toate fluidele biologice ale organismului.

Schema fibrinolizei

Produsele secundare ale fibrinolizei inhiba formare trombinei si polimerizarea monomerilor de fibrina. Plasminogenul poate fi inhibat sau activat. Streptokinaza, proteina streptococcia neenzimatica formeaza cu plasminogenul un complex, prin interactiuni hidrofobe, care transforma moleculele de plasminogen in plasmina. In urina se gaseste urokinaza, activator al plasminogenului care provine din sânge sau tesuturi.Ca inhibitori ai procesului pot fi mentionate proteinele cu o activitate antiplasmatica, ca 2- macroglobulina sau antitrombina III.