Curs 7 Analiza si Controlul Medicamentelor

SpectrofotometrieBazata pe interactiunile dintre materie si radiatiile electromagnetice.

O metoda optica spectrala cuprinzand spectrofotometria IR , UV-VIZ, fata de metodele optice nespectrale (refractrometria si polarimetria).

Proprietatea substantelor de a absorbi selectiv radiatiile electromagnetice sta la baza spectrofotometriei de absorbtie si este folosita pentru identificarea, determinarea puritatii, dozarea.

Spectrele de absorbtie se obtin la trecerea unui fascicul de radiatie prin substanta de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia. Cantitatea de energie absorbita este in functie de structura si de nr de molecule si de atomi al substantei cu care interactioneaza fasciculul de radiatii.

In functie de domeniile spectrale in care are loc absorbtia luminii se deosebesc:

- Spectrofotometria in UV – care se desfasoara la lungimi de unda 185-400 nm

- Spectrofotometria in VIZ – 400-800 nm

- Spectrofotometria in IR – > 800 nm

Starile energetice ale moleculei

Moleculele pot exista in anumite stari sau nivele de energie, starea de energie cea mai joasa numindu-se stare fundamentala, spre deosebire de starile de energie mai ridicate, stari excitate.

Energia absorbita trebuie sa corespunda diferentei de energie dintre 2 nivele energetice posibile ale moleculei, pentru ca tranzitia sa aiba loc, de unde si denumirea de energie de tranzitie.

Spectre de absorbtie in domeniul UV si VIZ, numite si spectre electronice, se datoreaza tranzitiilor dintre nivelele energetice ale starilor electronice ale moleculei.

Spectrele de absorbtie in domeniul IR se datoreaza tranzitiilor de rotatie, vibratie si rotatie-vibratie ale moleculei.

Atunci cand lumina alba (care este o lumina policromatica, care contine tot spectrul de lungimi de unda), din regiunea VIZ trece printr-un obiect, acesta va absorbi anumite lungimi de unda, resturi de radiatii fiind transmise si percepute drept culoare.

O molecula poate inmagazina energie sub forma de energie de translatie , energie de rotatie, energie de vibratie sau sub forma de tranzitii electronice.

La originea tranzitiilor electronice stau gruparile cromofore care includ diverse tipuri de electroni. Cromoforii sunt grupe de atomi existente in anumite molecule care absorb radiatii de o anumita lungime de unda producatoare de culoare.

1

In moleculele organice exista si auxocromi, care sunt grupe ce nu absorb radiatii, dar modifica absorbtia cromoforilor de care sunt legati, sau altfel spus lungimea de unda la care absorb cromoforii.

O radiatie elctromagnetica se caracterizeaza prin:

- lungimea de unda (λ) – exprimata in Ao/nm

- frecventa (nr de unde pe unitatea de timp) (ν) – exprimata in cm-1 sau ???kayser???

Legea fundamentala a absorbtiei = legea lui Bouguer-Lambert-Beer (Lambert-Beer)

La trecerea unui fascicul luminos printr-o substanta, intensitatea lui scade datorita absorbtiei, reflexiei si difuziunii.

In cazul in care reflexia si difuziunea sunt neglijabile, cauza principala a scaderii intensitatii este absorbtia.

Masura cantitativa a efectului produs de procesul de absorbtie este absorbanta sau transmitanta, care depinde de natura mediului, adica de compozitia sa, notata cu epsilon, de grosimea stratului strabatut, l, si de nr centrelor absorbante, c, adica concentratia.

Expresia matematica a legii LB este:

I=I 0 ∙ 10− ε

c

I – intensitatea lum transmiseI0 – intensitatea lum incidenteε – o constanta caracteristica fiecarei substante

Transmitanta / transmisia = T

Este raportul dintre intensitatea luminii transmise si intensitatea luminii incidente.

T= II 0

Absorbanta = A / extinctia / densitatea optica a unei solutii este logaritmul zecimal al inversului transmitantei, respectiv logaritmul zecimal al raportului dintre intensitatea luminii incidente , I0 si intensitatea luminii transmise, I. si este proportionala cu concentratia in substanta de analizat a solutiei, c, si cu grosimea stratului absorbant.

A=lg1T

=lgI 0

I=ε ∙ c ∙ l

2

Absorbanta specifica/extinctia specifica ( A1cm1% ) la o anumita lungime de unda reprezinta

absorbanta corespunzatoare unui strat de solutie cu grosimea de 1 cm care contine un gram de substanta in 100 ml si este o constanta caracteristica fiecarei substante.

Cunoscand valoarea absorbantei specifice se poate calcula concentratia in substanta de analizat conform formulei:

c= A

A1 cm1 %

Spectrofotometria in UV-VIZ si VIZ se bazeaza pe masurarea luminii absorbite atunci cand este respectata legea LB – care stabileste relatia dintre lumina absorbita, structura si concentratia in substanta de analizat a solutiei si grosimea stratului absorbant pentru o anumita lungime de unda exprimata in nm.

Pentru stabilirea puritatii unei substante se poate efectua raportul absorbantelor, adica A(landa 1)/A(lamda 2), sau diferenta absorbantelor, la 2 lungimi de unda diferite.

Spectrele de absorbtie in UV si VIZ se obtine grafic prin reprezentarea absorbantei sau a transmitantei in functie de lungimea de unda.

Ca si aparatura utilizata: spectrofotometrul de absorbtie UV-VIZ pentru inregistrarea spectrelor electronice, compus din:

- sursa de radiatie - un sistem de dispersie combinat cu un monocromator- suportul pt cuve - detectorul- amplificatorul- inregistratorul.

Sursa de radiatie/tii este un bec cu filament de wolfram pentru domeniul VIZ si o lampa de H / deuteriu pt UV.

Monocromatorul si cuvele sunt confectionate din sticla pt domeniul VIZ si din cuart pt domeniul UV.

Pentru determinarile spectrofotometrice se folosesc 2 cuve identice. Una pt solutia substantei de analizat, adica solutia proba si una pentru lichidul de compensare constituit din solventul/tii si reactivii folositi la prepararea probei.

Concentratiile solutiilor se aleg astfel incat valorile absorbantelor sa fie cuprinsa intre 0,3 si 0,7 intre care se obtine o precizie satisfacatoare a determinarilor. In monografiile respective se

3

prevede concentratia solutiilor, natura solventului si atunci cand este necesar conditiile de pH in care se efectueaza determinarile.

Daca in monografia respectiva nu se prevede lichidul de compensare determinarea se efectueaza folosind ca lichid de compensare solventul de la prepararea solutiei proba.

Inaintea inceperii determinarii se face o etalonare a aparatului folosind o solutie de K2Cr2O7 – substanta de referinta (S.R.). (60 mg K2Cr2O7 dizolvat in H2SO4 0,005 mol/L in balon cotat la 1000 ml), la care se cunosc valorile absorbantelor corespunzatoare unui strat de solutie cu grosimea de 1 cm.

λ = 235 nm – corespunde A = 0,745 ± 0,01λ = 257 nm – corespunde A = 0,879 ± 0,01λ = 313 nm – corespunde A = 0,290 ± 0,01λ = 350 nm – corespunde A = 0,645 ± 0,01

Inregistrarea spectrelor este una din problemele esentiale in detectia si dozarea substantelor medicamentoase, prin reprezentarea grafica a absorbantei/transmitantei, functie de lungimea de unda.

Inregistrarea spectrelor se face pe solutii ale analitilor, in diferiti solventi. Alegerea solventului potrivit este o problema deosebita, deoarece solventul nu trebuie sa absoarba in regiunea spectrala folosita pentru determinarea analitului.

Pentru determinarile spectrofotometrice UV-VIZ – principalii solventi utilizati sunt:

- apa- etanolul- metanolul- cloroformul- benzen- toluen- xilen- hexan- ciclohexan- dioxinat – adica solventi incolori.

Abateri de la legea LB

1. Legea este valabila doar pentru solutii diluate, deoarece la concentratii mari solutiile au o forta ionica ridicata, iar interactiunile electrostatice dintre componentele probei sunt mai intense si nu mai exista o liniaritate intre absorbanta si concentratie.

2. Abateri exista si atunci cand analitii pot interactiona cu solventii = abateri chimice; aductii formati au o absorbtivitate diferita de cea a analitului.

4

3. Legea LB este limitata si de radiatiile policromatice, de aceea legea se respecta numai daca se lucreaza la radiatii monocromatice obtinute din surse de radiatii policromatice din care se selecteaza cu ajutorul unor fante o fanta ingusta de radiatii cu lungimi de unda dispuse simetric de o parte si de alta a lungimii de unda dorite.

Aplicatii ale spectrofotometriei in UV in controlul medicamentelor

Spectrul UV poate fi utilizat la determinarea structurii, identitatii si puritatii substantelor medicamentoase.

Absorbtia luminii in UV reprezinta alaturi de celelalte constante fizice (p.t., indice de refractie etc.) o caracteristica a produsului pur.

In vederea identificarii subst medicamentoase pure se recomanda fie compararea spectrului UV al substantei de determinat cu cel obtinut in aceleasi conditii experimentale pentru aceiasi substanta in stare pura, fie se indica cu precizie lungimile de unda la care se inregistreaza maximele si minimele de absorbtie ale spectrului.

Ex 1:

Spectrul de absorbtie in UV al clorhidratului de oxitetraciclina in HCl 0,01% prezinta 2 maxime: la 268 nm si 353 nm., iar extinctia solutiei 0,001%, masurata in cuve de 1 cm este cuprinsa intre 0,37-0,40 la 268 nm si 0,27-029 la 353 nm.

Proba de identificare a produsului reprezinta de cele mai multe ori si un test de puritate.

Ex 2:

Ciancobalamina vitamina B12

Spectrul UV are 3 maxime: 278 nm, 361 nm si 550 nm. In acest caz conditia de puritate pt o solutie apoasa 0,05% este data de rapoartele: E261/E278 trebuie sa fie cuprinsa intre 1,6-1,9, iar E261/E550 trebuie sa fie cuprinsa intre 2,8 si 3,4. Aceste valori constituie parametrii spectrofotometrici ai produsului de analizat.

Se realizeaza si determinari cantitative in UV fie a substantei pure ca atare, fie a substantei medicamentoase din forme farmaceutice dupa separarea lor prealabila.

Ex: dozarea codeinei din siropul de codeina – se realizeaza dupa diluarea siropului cu alcool 60 grade si trecrea unei cantitati determinate peste o coloana cromatografica cu schimbatori de ioni. De pe coloana codeina retinuta prin schimb ionic se elueaza cu metanol amoniacal si extinctia solutiei se citeste spectrofotometric la 287 nm in cuve de 1 cm fata de solventul mentionat. Extinctia specifica = 49.

5

Aplicatii ale spectrofotometriei in VIZ in controlul medicamentelorDaca in solutia substantei de analizat intr-un solvent adecvat prezinta o coloratie stabila in anumite intervale de timp si pH – ea poate fi evaluata in cadrul determinarilor cantitative si calitative, in domeniul vizibil al spectrului.

Metoda de determinare in vizibil – poate fi extinsa si la un numar mare de substante necolorate care prin complexare cu diferiti reactivi dau coloratii stabile. Masuratorile se efectueaza la un colorimetru sau un fotometru cu flitre sau spectrofotometru cu prisme pentru cele care absorb intr-o regiune ingusta. Pentru orice determinare spectrofotometrica se traseaza mai intai curba de etalonare si se stabileste limita de concentratii in care se aplica legea LB.

Ex: dozarea riboflavinei (ca si subst colorata) din solutiile injectabile. – se aplica metoda colorimetrica, directa, pe baza coloratiei proprii a substantei, care respecta legea LB in limitele de concentratii stabilite. Se determina extinctia la 465 nm in cuve de 1 cm fata de apa, iar concentratia se determina prin extrapolarea extinctiei pe o curba de etalonare, intocmita in prealabil. Similar decurge si determinarea albastrului de metilen.

Spectrofotometria in IR

Spectrul de absorbtie in IR se obtine grafic prin reprezentarea transmitantei in procente in functie de nr de unda, adica T% = I/I0*100, in care T% - transmitanta substantei de analizat.

Radiatiile IR constituie acea parte a spectrului electromagnetic ale carui lungimi de unda sunt superioare spectrului vizibil si inferioare undelor radio si microundelor.

Numarul de unda folosit in IR este o marime proportionala cu frecventa si este inversul lungimii de unda in vid.

Ca unitate de masura: cm-1.

Benzile de absorbtie in IR si intensitatile acestora sunt caracteristice substantelor si se pot folosi pentru identificare si dozare.

Spectrul in IR al probei de analizat, lichida sau solida, prelucrata prin una din metodele indicate in FR X se compara cu spectrul in IR, obtinut cu o substanta de referinta prelucrata in aceleasi conditii cu proba de analizat.

Una din principalele aplicatii ale spectrofotometriei in IR este aceea de identificare a formelor polimorfe ale subst medicamentoase pentru ca fiecare polimorfa are parametri sai fizici proprii, care determina diferentele intre ei.

Ex: barbitalul – 6 forme polimorfe

Spectrele in IR pot fi folosite la identificarea substantelor medicamentoase, determinarea puritatii, determinarea cantitativa.

6

Validarea metodelor analitice

Experienta utilizarii metodelor analitice pentru efectuarea unor determinari arata ca oricat de ingrijit ar lucra un analist pentru a obtine rezultate exacte si precise, acestea sunt insotite de erori, intamplatoare si sistematice, ceea ce face ca orice masuratoare analitica sa aiba o anumita imprecizie, nesiguranta, incertitudine. Rezultatele analitice se supun unei distributii gaussiene in raport cu media aritmetica a tutoror rezultatelor. Se admite ca si erorile intamplatoare se supun acelorasi legi de distributie normala gaussiana.

Pe de alta parte, matricea probei poate avea o actiune de micsorare sau chiar de suprimare a semnalului analitic, dat de un aparat, numit efect de matrice, efect care poate fi influentat si de balanta analitica care ofera o valoare a masei probei, valoare purtatoare a impreciziei balantei, deci purtatoare a unei erori sistematice, ceea ce se reflecta in obligitatea/abaterea unui rezultat intr-o anumita directie + sau -.

Datorita acestor aspecte, rezultatele analitice obtinute cu o anumita metoda sunt insotite de incertitudini, care trebuie sa fie cat mai mici pentru ca aceste rezultate sa se incadreze intr-un interval de siguranta acceptabil dpdv stiintific.

Pentru a evalua calitatea unei metode de analiza data de performantele sale este necesara validarea ei.

Prin analiza unei substante de referinta sau standard, prin aceasta metoda, in final, calculandu-se regasirile procentuale (R.S.D.%).

Procesele de validare implica o comparare a rezultatelor obtinute cu metoda care se valideaza, cu rezultatele oferite/obtinute, de o alta metoda acceptata si validata, care este metoda de referinta.

In general, cantitatea masurata printr-o metoda validata se presupune a fi constanta in timp, cantitatile masurate avand o distributie gaussiana, ceea ce permite sa se considere ca exista o sansa de 1 la 20 (5%) ca valorile masurate sa se situeze in afara a 2 deviatii standard dintr-o valoare cunoscuta si o sansa de 0,3% ca valorile masurate sa se afle in afara intervalului de siguranta.

Obtinerea unor valori ale masuratorilor care nu se inscriu in intervalul de siguranta conduce la ideea calibrarii necorespunzatoare a metodei, alterarii reactivilor sau a unor defecte in functionarea aparatului cu care se face masuratoarea.

De altfel, aparatele trebuie sa fie validate de producatori, iar analistul trebuie sa controleze frecvent validarea aparatelor cu care lucreaza.

In contextul exigentelor actuale referitoare la exactitatea, precizia, selectivitatea, sensibilitatea metodelor de analiza si control, puritatea materiilor prime si a celor auxiliare, precum si a reactivilor cu referinta in special la substantele biologic active au o importanta cu totul deosebita, deoarece impuritatile din aceste materiale au efecte nedorite si adesea daunatoare.

In general, impuritatile constituie interferente in determinarile analitice alterand substantial rezultatele experimentale si scazand performantele analitice.

7

In cazul medicamentelor o serie de impuritati cum sunt cele de metale grele (Hg, Pb, Cd, As), cianuri, prezinta un potential toxic ridicat iar urme dintr-un izomer chiar si in cantitati foarte mici poate avea efecte catastrofale asupra omului (pt talidomida).

In general, legislatia in vigoare din intreaga lume este restrictiva fata de impuritatile din apa, aer, sol, alimente, medicamente, cosmetice de uz uman s.a.m.d.

Pentru caracterizarea gradului de puritate al unui reactiv exista diverse denumiri.

- “reactiv pur” – acesta trebuie sa contina minim 99,5% component principal

- “reactiv pentru analiza” (p.a.) – semnifica o puritate mai avansata decat reactivul pur (ex: sarea Mohrr – sulfat dublu de amoniu si fer, cristalizata cu 6 molecula de apa – utilizata curent in analiza, contine min 99,5% sulfat de amoniu si fer*6 H2O, diferenta de 0,5% fiind contituita din impuritati diverse; sarea Mohrr p.a. – utilizata si ca substanta etalon, trebuie sa contina 99,95% sulfata de amoniu si fer * 6 H2O, iar dintre impuritati cel mult 0,002% ion clor, 0,01% compusi de Fe3+)

- “reactiv chimic pur” – semnifica o puritate si mai mare (ex: KCl chimic pura, trebuie sa contina min 99,98% KCl)

- “reactiv spectral pur” – care semnifica o puritate atat de mare incat continutul de impuritati sa fie extrem de mic pentru a nu se putea detecta prin metode spectrale.

- “reactiv nuclear pur” – care semnifica o puritate atat de inalta, incat substanta sa contina un singur izotop

- “reactiv cromatografic pur” – ale carui impuritati trebuie sa fie atat de mici incat sa nu stanjeneasca separarile si detectiile cromatografice

- “reactiv farmaceutic pur” / “reactiv de puritate farmaceutica” (R) – trebuie sa corespunda exigentelor FR X. In acest caz, nu deranjeaza ionii comuni, dar deranjeaza intotdeauna metalele grele, As si alte impuritati toxice.

In prezent, se acorda o atentie sporita metodelor de analiza si performantelor lor pentru realizarea carora se utilizeaza instrumente sofisticate, automatizate, capabile de autoreglare, incluziv in privinta reducerii zgomotului de fond si interferentelor, instrumente care beneficiaza de programe de calculator variate si performante in prelucrarea statistica a datelor.

In determinarile analitice este cunoscut si acceptat faptul ca semnalul analitic masurat este alcatuit din 2 componente: semnalul analitic adevarat/propriu-zis si semnalul analitic intamplator/parazit/zgomotul de fond.

Cantitatea si structura zgomotuli de fond depinde de experiment adica de tipul si de conditiile de lucru.

8

Mijloacele de curatire/netezire a semnalului analitic de zgomotul de fond au drept scop reducerea matematica a semnalului parazit/zgomotului de fond – acesta avand de regula o frecventa relativ mai inalta decat cea a semnalului analitic, care intereseaza.

De multe ori, este dificila eliminarea matematica a zgomotului, fara a elimina unele informatii chimice, de mare interes.

Validarea este o metodologie prin care trebuie sa se demonstreze ca o metoda analitica corespunde scopului propus si se realizeaza pe baza unui plan strategic care trebuie sa includa:

- scopul - caracteristicile- performantele - limitele de acceptanta - parametri examinati- limita de cunatificare- limita de detectie- acuratetea/exactitatea- precizia/fidelitatea- selectivitatea/specificitatea- liniaritatea- robustetea/soliditatea- conditiile experimentale- domeniul de concentratie si aplicare - intreg calculul statistic.

Validarea si revalidarea metodelor de analiza trebuie sa se faca:

- inaintea folosirii lor in analiza curenta

- cand se modifica una/mai multe conditii pentru care a fost elaborata sau validata

- cand este modificata o metoda astfel incat aceasta nu mai corespunde scopului initial pentru care a fost elaborata

Validarea se desfasoara in conformitate cu strategia generala stabilita prin norme intocmite de agentiile de supraveghere in domeniu.

9