7/30/2019 Curs 4 Punerea La Punct a Unei Metode Cromatografice de Analiza

1/10

Dezvoltarea unei metode in cromatografia in faza inversa

* Atributele generale ale unei metode cromatografice noi:

- rezolutie adecvata a analitilor studiati

- timpi scurti de separare

- robusta (nu este afectata puternic de variatii ale conditiilor delucru)

* Etapele dezvoltarii unei metode

1. Stabilirea scopului;

2. Selectarea metodei de pregatire a probei;

3. Alegerea detectorului

7/30/2019 Curs 4 Punerea La Punct a Unei Metode Cromatografice de Analiza

2/10

Atributele unei bune separari:

- 0.5 K 20

- Rezolutie 2

- Presiune de operare 15MPa

- 0.9 asimetrie 1.5

Optimizarea cu un solvent organic

Alegerea solventului organic:

1. Acetonitril

2. Metanol

3. Tetrahidrofuran

7/30/2019 Curs 4 Punerea La Punct a Unei Metode Cromatografice de Analiza

3/10

Selectarea modului de separare

Solutul se dizolva in apa sau in solventi organici ?

Ghid de lucru in HPLC

7/30/2019 Curs 4 Punerea La Punct a Unei Metode Cromatografice de Analiza

4/10

Timpul(tm) necesar fazei mobile sa traverseze o coloana HPLC de 4.6-mm-

diametru, estimata cu ecuatia tm Ld2c/ (2F), undeL este lungimea

coloanei(cm),dc este diametrul coloanei(mm), si

F

este debitul(mL/min)

7/30/2019 Curs 4 Punerea La Punct a Unei Metode Cromatografice de Analiza

5/10

Dezvoltarea in triunghi a unei metode HPLC. THF este tetrahidrofuran.

1 : 1

1 : 1 1 : 1

7/30/2019 Curs 4 Punerea La Punct a Unei Metode Cromatografice de Analiza

6/10

Dupa optimizarea solventului, se poate imbunatati si rezolutia prin:

- Descresterea debitului

- Cresterea lungimii coloanei

- Descresterea dimensiunilor particulei

Temperatura ca variabila

- Afecteaza retentia relativa a diferitilor compusi

- Influenteaza separarea compusilor ionici si a moleculelor cu substituenti

polari

7/30/2019 Curs 4 Punerea La Punct a Unei Metode Cromatografice de Analiza

7/10

Separarea cu gradient

Volumul util de lucru (dwell)volumul dintre punctul in care solventii sunt

amestecati si inceputul coloanei;

Timpul util de lucru (dwell)timpul necesar gradientului sa intre in coloana

volumul dwell (mL)

tD = debitul (mL.min)

Masurarea timpului util de

lucru

7/30/2019 Curs 4 Punerea La Punct a Unei Metode Cromatografice de Analiza

8/10

Elutia cu gradient reprezinta o modalitate utila de abordare a separarii?

- Prima separare cromatografica a unui amestec nou trebuie facuta prin elutie

cu gradient

- Daca t/tG > 0.25, se utilizeaza elutia cu gradient.

- Daca t/tG < 0.25, se utilizeaza elutia izocrata.- Solventul izocratic utilizat should have the composition applied to the column

halfway through the period t

7/30/2019 Curs 4 Punerea La Punct a Unei Metode Cromatografice de Analiza

9/10

Pentru separari mai dificile- se schimba solventul

- se utilizeaza coloane mai lungi

- seutilizeaza particule cu dimensiuni mici

- se modifica fazele

7/30/2019 Curs 4 Punerea La Punct a Unei Metode Cromatografice de Analiza

10/10