Curs 3

Factori ce influenteaza extracţia

Solubilizarea propriu-zisă a unei proteine se realizează prin tratarea sursei biologice dezintegrate cu

un volum dintr-un anumit mediu de extracţie, în diferite condiţii experimentale. Alegerea metodei

optime de extracţie a unei enzime dintr-o sursă biologică necesită o serie de experimente

preliminare prin care se stabilesc condiţiile optime de extracţie, respectiv: metoda de dezintegrare,

mediul optim de extracţie, raportul optim de extracţie (raportul dintre g de ţesut şi ml mediu de

extracţie), timpul optim de extracţie şi temperatura optimă de extracţie.

Este important ca in timpul procesarii sursei enzimatice si a prelucrarii pana la preparatul enzymatic

dorit sa se retina in acesta maximum de activitate enzimatica.

Problemele majore care apar pe parcursul extracţiei, purificării unei proteine sunt:

Denaturarea termica;

Fortele de forfecare pot distruge pe langa peretii celulari si enzimele de interes;

scăderea pH-ului mediului ca urmare a eliberării de acizi în urma dezintegrării celulare;

Dilutia;

Schimbarea structurii conformationale datorita prezentei detergentilor sau/si solventi;

Fenomene de oxidare;

prezenţa ioni metalici;

prezenţa enzimelor proteolitice în cantităţi mari;

contaminarea cu acizi nucleici, bacterii şi virusuri;

formarea radicalilor liberi;

formarea de spuma ce poate duce la distrugerea conformatiei enzimei de interes.

Aceste probleme pot fi limitate prin alegerea unui mediu de extracţie corespunzător, prin scurtarea

timpului de preparare a extractului proteic şi prin desfăşurarea procedeului de extracţie ales la

temperaturi scăzute.

Denaturarea termica

Prin cresterea temperaturii ca urmare a consumului de energie care genereaza caldura fenomen ce

caracterizeaza majoritatea metodelor de omogenizare/dezintegrare celulara.

Temperatura de extracţie este un parametru important care trebuie optimizat cu grijă.

Procesarea la temperaturi scazute este esentiala pentru cele mai multe enzyme. Totusi

1

trebuie subliniat faptul că, temperaturile scăzute nu sunt necesare în toate cazurile, pentru anumite

enzime fiind chiar nerecomandate ca de exemplu enzimele alosterice.

Prezenta unor substante cum sunt poliolii de tipul glicerolului, glucozei sau zaharozei ajuta la

stabilizarea enzimelor in conditii termice denaturante. Astfel glicerolul, în concentraţie de 50 %

(g/v) determină scăderea punctului de topire al soluţiilor apoase sub temperatura normală a

congelatoarelor (-200C). Soluţiile proteice cu glicerol se pretează de asemenea conservărilor pentru

perioade mari de timp, întrucât previne îngheţarea multor enzime.

Fortele de forfecare

Dezintegrarea celulelor prin metode severe (presare, sonicare) supune componentele celulare la

presiuni ridicate care pot conduce la inactivarea unor enzime. Efectele presiunilor ridicate asupra

enzimelor pot fi complexe. Enzimele oligomere, ca de exemplu lactat dehidrogenaza sau

gliceraldehid- 3- fosfat dehidrogenaza, supuse la presiuni moderate (de până la 2 kbari) sunt

disociate reversibil la monomeri inactivi. La presiuni ridicate monomerii se agregă şi formează o

structură denaturată, proces care este ireversibil. Pentru a minimaliza efectul dăunător pe care

metodele severe de dezintegrare îl pot avea asupra enzimelor, presiunile şi perioadele de timp de

aplicare ale acestora trebuie controlate.

pH – ul

În mod normal, valoarea pH-ului mediului de extracţie este valoarea la care enzima de interes are

activitate catalitică maximă. Insa pentru anumite enzime, pH-ul optim de acţiune nu este şi cel la

care se realizează cea mai eficientă extracţie, fiind necesară o extracţie la un pH la care enzima are

o stabilitate maximă.

De exemplu tripsina este mult mai stabilă la pH = 3 valoare la care autoliza nu se produce, decât la

valorile de pH cuprinse înttre 8 şi 9, valori la care enzima are capacitate catalitică maximă. Extracţia

unor enzyme din drojdii este mult mai eficientă la valori extreme de pH ale mediului realizate în

prezenţa unei concentraţii de 0,5 M ammoniac, denaturările suferite în aceste condiţii fiind

acceptabile.

Valoarea pH – ului ales trebuie să fie cât mai îndepărtată de cea corespunzătoare pI – ului proteinei.

Valoarea pH – ului optim în extracţia unei enzyme este realizat şi menţinut constant cu ajutorul

sistemelor tampon.

Tampoanele utilizate

2

Sistemul tampon ales pentru extracţia unei enzyme dintr-o anumită sursă biologică poate influenţa

capacitatea de solubilizare şi activitatea catalitică a acesteia prin:

valoarea pH – ului său;

tăria sa ionică şi compoziţia sa.

Soluţiile tampon sunt acele soluţii care îşi modifică pH-ul numai în mică măsură la

adăugare de acizi şi baze tari.

Tampoanele alese trebuie să asigure manifestarea unei activităţi catalitice maxime şi

stabilitatea enzimei, să nu interfere în metodele de determinare a concentraţiilor proteice, să nu fie

volatile, să nu interacţioneze cu substraturi, cu cofactori sau cu ioni metalici, să aibă solubilitate

mare în apă.

Pentru calcularea pH-ului mediilor de extractie, tampoanelor se utilizeaza relaţia Henderson

– Hasselbach:

Această relaţie stabileşte o corelaţie directă între pH-ul unei soluţii de acid, constanta sa de

aciditate şi raportul dintre concentraţia bazei sale conjugate în condiţii de echilibru. Dacă într-o

soluţie apoasă sunt prezente două cupluri acid-bază, se ajunge la relaţia :

Soluţiile tampon sunt caracterizate prin indicele de tamponare (value buffer) care se defineşte ca

fiind raportul dintre adaosul de acid tare sau bază tare, exprimat în echivalenţi la litru şi variaţia

corespunzătoare a pH-ului si arata capacitatea de tamponare a solutiilor tampon, deci:

unde: dn este numărul de echivalenţi de acid sau bază tare adăugat dpH – variaţia de pH la adaosul

de acid sau bază tare.

Maximul capacităţii de tamponare apare atunci când pH – ul mediului este egal cu valoarea pK a si

sistemele tampon au o capacitate bună de tamponare pe un domeniu de pH egal cu pKa 1.

Din ecuaţiile de mai sus se observă că valoarea de tamponare este în relaţie directă cu concentraţia

tamponului şi este de aşteptat ca aceasta să-şi menţină pH –ul după diluţie dacă, atât [HA] cât şi [A-]

sunt reduse în proporţii echivalente. Practic se constată că acest lucru se întâmplă doar atunci când

diluţia aplicată nu este foarte mare.

3

În cazul tampoanelor care au ioni monovalenţi, modificările pH – urilor cauzate de diluţie sunt

minore. De exemplu, diluţia unui tampon de concentraţie 0,1 M, care conţine cantităţi egale de HA

şi A-, produce o modificare a pH-ului acestuia de 0,024 unităţi. Dacă tamponul conţine ioni

polivalenţi (citrate sau fosfat), modificarea pH – ului poate fi semnificativă. Pentru astfel de

tampoane insa nu sunt recomandate diluţii mari.

Un alt factor care poate afecta pH-ul unei soluţii tampon este temperatura, parametru care afectează

valorile pKa. Tampoanele cele mai sensibile la modificarea temperaturii sunt cele care conţin

grupări amino. De exemplu tamponul Tris – HCl adus la pH = 8,0 la 250C, va avea la 00C un pH de

8,78. Tampoanele cele mai puţin sensibile la variaţiile de temperatură sunt cele care conţin acizi

carboxilici. Astfel tamponul acetat are un pH de 4,5 la 250C şi unul de 4, 495 la 00C. Comportarea

diferită faţă de temperatură rezidă din diferenţele care există între valorile H ale proceselor de

ionizare ale acizilor.

Din punctul de vedere al substanţelor dizolvate, soluţiile tampon sunt soluţii de electroliţi. O

marime importanta ce caracterizeaza electrolitii este taria lor ionica ce caracterizeaza câmpul

electric dezvoltat de ioni, în soluţie. Aceasta depinde de concentraţia sa, de valenţa sa (adică de

sarcina sa), de prezenţa altor ioni în soluţie şi este independent (în soluţii diluate) de natura chimică

a ionului. Pentru a ţine seama de toţi aceşti factori, a fost introdusă o noţiune, şi anume tăria ionică

(G.N.Lewis, 1921). Tăria ionică se notează cu μ şi este definită ca fiind jumătate din suma

termenilor obţinuţi prin înmulţirea concentraţiilor, c (molalităţi sau molarităţi), ale fiecărui ion din

soluţie, cu pătratul valenţei sale, Z. Astfel, pentru o soluţie conţinând mai multe specii de ioni,

notaţi cu indicii 1, 2, 3, … n, tăria ionică a tuturor ionilor din soluţie va fi:

Majoritatea proteinelor au solubilitate maximă la tării ionice moderate, cuprinse înttre 0,05 şi 0,1 M,

valori care sunt alese dacă capacitatea de tamponare a sistemului tampon este suficientă în aceste

condiţii.

Câteva tampoane utilizate pentru extracţia proteinelor sunt prezentate în tabelul Utilizarea unor

tampoane cu capacitate slabă de tamponare pentru cantităţi mari de proteine necesită verificare pH –

ului mediului, întrucât proteinele acţionează ca sisteme tampon. Tampoanele utilizate pentru

extracţia proteinelor au în general concentraţii cuprinse între 20 şi 100 mM (concentraţia unui

tampon se referă la concentraţia tuturor speciilor componente).

Tabel….

4

Sisteme tampon utilizate pentru extracţia proteinelor

Tampon Valori pKa

Acetat de sodiu 4,75;

Bicarbonat de sodiu 6,50; 10,25;

Citrat de sodiu 3,09; 4,75; 5,41;

Acetat de amoniu 4,74; 9,25;

Bicarbonat de amoniu 6,50; 9,25;

Tris - HCl 10,25;

Fosfat de sodiu 8,21;

Tris - fosfat 1,5; 7,5; 12,0; 8,21;

Tris : Tris (hidroximetil) aminometan

Compoziţia sistemelor tampon alese pentru extracţia enzimelor poate afecta capacitatea catalitică a

acestora. Unele dintre tampoanele clasice prezentate în tabelul …prezintă unele dezavantaje.

Tampoanele fosfat tind să precipite ionii bivalenţi de Mg, Ca, Fe şi alţi cationi polivalenţi. Fosfatul,

un metabolit important, inhibă unele enzime ca : kinaze, dehidrogenaze, carboxipeptidaze, ureaza,

aril sulfataza, fosfoglucomutaza. Tampoanele care conţin pirofosfat precipită cationii polivalenţi şi

au tendinţa de a forma complexe, iar cele pe bază de citrat precipită ionii buvalenţi de calciu. Astfel

de tampoane nu trebuie utilizate în extracţia enzimelor pentru care prezenţa cationilor respectivi

este esenţială în manifestarea funcţiei lor catalitice. O alternativă mai bună pentru tampoanele pe

bază de fosfaţi sunt tampoane de tip Mops sau Bes, tampoane pentru care baza conjugată are sarcina

– 1.

Mops Bes

Alegerea unui tampon adecvat este un factor esenţial în extracţia unei enzime.pH – ul din interiorul

unor organite subcelulare poate diferi de cel neutru (pH – ul din interiorul vacuolelor şi lizozomilor

este de aproximativ 5). Capacitatea de tamponare a tampoanelor utilizate în astfel de situaţii trebuie

să ţină seamă de acest lucru atunci când astfel de formaţiuni sunt supuse dezintegrării. Procesele

metabolice pot continua în extractele obţinute fapt care afectează pH – ul. Astfel degradarea

glicogenului în extractele musculare poate produce o scădere cu o unitate a pH – ului mediului în

timp de o oră, scădere datorată acumulării de acid lactic.

Un factor important care poate afecta/modifica comporatarea enzimei de interes este dilutia ce are

loc la extragerea sa.

5

Deoarece solutiile tampon sunt in general solutii destul de diluate, in evaluarea celor mai bune

tampoane pentru extractia unei enzime de interes se utilizeaza legea dilutiei sau

legea lui Ostwald. Aceasta arată dependenţa constantei de disociaţie de gradul de disociere şi de

concentraţie.:

Extracţia proteinelor din ţesuturi sau celule poate conduce la obţinerea unor soluţii de enzime foarte

concentrate. În unele compartimente celulare, cum ar fi de exemplu matricea mitocondrială,

concentraţia proteinelor este de peste 500 mg/ml. Pentru a putea determina activitatea enzimelor,

concentraţia proteică trebuie redusă la 5 mg/ml în extractele celulare şi la 5 g/ml în soluţia unei

enzime pure.

În practică s-a constatat insa că multe enzime îşi pierd rapid activitatea dacă sunt păstrate în soluţii

diluate. Acest efect poate fi contracarat prin introducerea unei proteine „inerte”, cum este albumina

serică bovină, în concentraţie de 1 – 10 mg/ml. Introducerea acestei proteine poate preveni

pierderea activităţii enzimatice datorate adsorbţiei pe suprafaţa veselei utilizate sau degradării

prioritare a acesteia de către enzimele proteolitice coprezente.

Diluţia extractelor proteice poate avea ca efect şi disocierea unor cofactori de apoenzimă, fenomen

care poate determina pierderea activităţii catalitice. Pentru ca acest efect să poată fi compensat, se

recomandă introducerea cofactorului în sistemul tampon utilizat pentru extracţie.

În concluzie, în alegerea unui tampon pentru extracţia unei enzime trebuie avuţi în vedere următorii

factori :

Tăria ionică a tamponului trebuie să corespundă unei capacităţi de tamponare suficiente

şi să determine extracţia optimă a enzimei;

Domeniul pe care tamponul menţine pH – ul mediului constant să corespundă cu cel de

stabilitate al enzimei;

Componentele tamponului nu trebuie să manifeste efecte negative asupra activităţilor

enzimatice (tampoanele polianionice de tipul citratului şi fosfatului sunt agenţi de

chelatare ai unor ioni metalici care pot fi esenţiali în acţiunea unor enzime);

Concentraţia tamponului nu trebuie să interfere în etapele ulterioare extracţiei

(concentraţii mari de tampoane polivalente pot competiţiona cu proteinele în legarea la

situsurile încărcate ale schimbătorilor de ioni).

Detergenţii

În multe cazuri proteinele care trebuie extrase sunt legate de membrane sau se găsesc sub formă de

agregate. Pentru solubilizarea unor astfel de proteine interacţiile hidrofobe în care acestea sunt

6

implicate trebuie diminuate prin utilizarea detergenţilor sau a agenţilor caotropici. Cîţiva dintre

detergenţii care se utilizează frecvent pentru extracţia enzimelor sunt prezentaţi în tabelul…

Tabel….

Detergenţi utilizaţi pentru solubilizarea proteinelor

Detergent Caracter

ionic

Efect asupra

proteinelor

Concentraţie critică

micelară

% (w/v)

Triton X – 100 neionic Denaturant slab 0,020

Nonidet P – 40 neionic

Lubrol PX neionic 0,006

Octil glucozid neionic 0,730

Tween 80 neionic 0,002

Deoxicolat de sodiu neionic 0,210

Dodecil sulfat de sodiu(SDS) neionic Denaturant puternic 0,230

CHAPS Zwiter-ioni 1,400

Unii detergenţi nu denaturează proteinele globulare sau nu interferă cu activităţile biologice ale

acestora, în timp ce alţii, cum ar fi SDS, sunt puternic denaturanţi. În prezenţa SDS proteinele

globulare suferă modificări conformaţionale puternice care le afectează funcţia biologică, iar

proteinele cu structură oligomeră dunt disociate în subunităţi.

Detergenţii trebuie utilizaţi cu discernământ în extracţia enzimelor. Pentru unele enzime detergenţii

reprezintă singura posibilitate de solubilizare din formaţiunile celulare în care sunt incluse, iar

pentru altele detergenţii sunt agenţii denaturanţi puternici. În cazul unor enzime utilizarea

detergenţilor este necesară nu numai la extracţie, ci şi pe tot parcursul procedeelor de purificare, la

finalul purificării obţinându-se complexe detergent – enzimă. Detergenţii sunt molecule amfipatice.

Când concentraţia lor în mediu creşte, ei pot forma micele, la aşa numita concentraţie critică

micelară. Deoarece micelele formate îngreunează purificările prin procedee cromatografice, trebuie

utilizate concentraţii sub valoarea celei critice micelare.

Agenţii reducători

Grupările tiol ale resturilor de cisteină din structura proteinelor pot suferi modificări pe parcursul

procedeelor folosite pentru extracţia acestora. În interiorul celulelor, catenele laterale ale resturilor

de cisteină sunt menţinute în forma redusă (-SH)datorită mediului reducător existent. În urma

dezintegrării, celulele devin expuse oxigenului şi apare tendinţa ca grupările SH să formeze punţi

disulfurice sau să fie oxidate. Protejarea grupărilor SH contra oxidării se realizează prin includerea

7

în mediul de extracţie a unor agenţi reducători ca :acidul ascorbic, mercaptoetanolul, 1,4-

ditioeritritol (DTE) şi 1,4-ditiotreitol (DTT). Structura acestor agenţi reducători este prezentată în

tabelul ... . de obicei concentraţii cuprinse între 10 şi 25 mM sunt suficiente în protejarea grupărilor

tiolice din structura proteinelor, fără a produce scindarea punţilor disulfurice.

Tabel..

Structura unor agenţi reducători

Agent Structură

2 - mercaptoetanol HS-CH2-CH2-OH

1,4-ditioeritritol (DTE) HSCH2-HCOH-HCOH-CH2SH (cis)

1,4-ditiotreitol (DTT) HSCH2-HCOH-HOCH-CH2SH (trans)

2 – mercaptoetanolul este un lichid dens, cu un miros neplăcut şi toxic. Prezenţa acestuia în

concentraţii de 10 – 20 mM în mediul de extracţie asigură protecţia grupărilor tiol din structura

proteinelor pe o perioadă de 24 ore. Ditiotreitolul şi ditioeritritolul, substanţe reducătoare puternice,

realizează protecţia grupărilor tiol la concentraţii mai scăzute ale acestora în mediu (1 mM).

Potenţialul redox standard al ditiotreitolului la pH = 7,0 este -0,33 V, cu 0,12 V mai negativ decât

cel al cisteinei. Principalul dezavantaj al ditiotreitolului este preţul său de cost ridicat.

Un studiu întreprins asupra stabilităţii soluţiilor agenţilor reducători a evidenţiat că aceştia sunt

puţin stabili la valori ridicate de pH, la temperaturi ridicate şi în prezenţa unor concentraţii mici de

ioni de Ca2+. Includerea în soluţiile de acid etilendiamino tetraacetic (EDTA) le măreşte stabilitatea.

Prezenta ionilor metalici

Prezenţa ionilor metalelor grele (Cu, Pb, Hg, Ni) în mediu poate deteriora funcţia biologică a unor

enzime dar pot fi si activatori pentru unele enzime.

Multe enzime necesită prezenţa în mediu a ionilor de Ca2+ ( - amilaza), de Zn2+ (alcool

dehidrogenaza) sau a altor ioni bivalenţi, ioni care sunt complexaţi de EDTA. În astfel de situaţii,

fie EDTA este introdus în mediu în cantităţi mici, fie mediul de extracţie se suplimentează cu ionul

metalic respectiv. Suplimentul de ion metalic trebuie realizat cu reactivi foarte puri pentru a se evita

o potenţială contaminare cu metale grele.

8

Unii ioni au actiune toxica deoarece reacţionează cu grupările tiol din structura proteinelor sau

intensifică oxidarea acestora în prezenţa oxigenului. Metalele grele pot proveni din ţesutul utilizat

ca sursă biologică, din sticlărie sau din reactivi. Protecţia contra efectelor induse de metalele grele

se realizează prin introducerea în mediul de extracţie a unor agenţi de chelatare ai acestora. Cel mai

utilizat agent de chelatare este EDTA, care la concentraţii 1 mM în mediul de extracţie

minimalizează efectele metalelor grele, capacitatea de chelatare a acestora crescând cu creşterea pH

–ului. Având în vedere că EDTA este un tampon, se recomandă adiţia sării disodice a acestuia

înainte de ajustarea pH – ului final al mediului.

Prezenta enzimelor proteolitice

Una dintre cel mai dificile probleme care apare atât în timpul extracţiei cât şi pe parcursul purificării

enzimelor este controlul degradării acestora de către enzimele proteolitice endogene mai ales in

cazul surselor bogate in enzime proteolitice(de exemplu tesuturile animale ca ficatul, splina sau

rinichii). Degradarea proteolitică a unei enzime este evidenţiată prin următoarele constatări

experimentale :

Enzima este izolată cu un randament scăzut;

Pierderea activităţii enzimatice la incubarea enzimei;

Obţinerea unei rezoluţii slabe prin electroforeză în gel de poliacrilamidă în prezenţă de

dodecil sulfat de sodiu (SDS – PAGE), datorată unei heterogenităţi la nivelul masei

moleculare a enzimei;

Discrepanţe între proprietăţile enzimei raportate în alte cercetări şi cele determinate

experimental.

Există o serie de strategii care minimalizează sau suprimă proteoliza nedorită. Acestea includ :

manipulări la temperaturi scăzute la care acţiunea proteazelor este încetinită; alegerea ca sursă

biologică a unor ţesuturi cu puţini lizozomi sau a unor tulpini microbiene deficitare în enzime

proteolitice; extracţia rapidă a omogenatului proaspăt într-o soluţie apoasă a unui polimer în sistem

bifazic; adsorbţia proteazelor pe adsorbanţi prin interacţii hidrofobe. Inhibarea proteazelor se poate

realiza şi prin ajustarea pH – ului mediului la o valoare la care acestea nu acţionează, cu condiţia ca

această valoare de pH să nu afecteze stabilitatea proteinei supusă purificării.

Cea mai utilizată metodă implică utilizarea, în etapele de extracţie şi în cele ulterioare, de inhibitori

ai enzimelor proteolitice. Inhibitorii reacţionează şi modifică ireversibil unele resturi de aminoacizi

implicate în funcţia enzimelor proteolitice. Câteva exemple de astfel de substanţe sunt :

Diizopropil fluorofosfatul (DIP), inhibitor ireversibil al serin – proteinazelor la concentraţii

de 1 mM în mediu, substanţă foarte toxică şi instabilă în soluţii apoase:

9

E-OH +

+ HF

Fluorură de fenilmetansulfonil (PMSF), inhibă puternic toate serin proteinazele, la

concentraţii cuprinse între 0,1 şi 1 mM, cât şi unele tiol proteinaze. PMSF trebuie

manipulat cu atenţie pentru că este foarte toxic:

E-OH +

+ HF

EDTA – ul, substanţă solubilă în apă, la concentraţii cuprinse între 1 şi 10 mM inhibă

proteazele activate de metale;

Acidul monoiod acetic sau moniod acetamida ( IAA, IAN), sunt inhibitori ai cistein –

proteinazelor la concentraţii mici, cuprinse între 10 şi 100 M:

E – SH + ICH2- CONH2E – S – CH2- CONH2 + HI

IAN

Cistatinele, inhibitori naturali de natură peptidică, se leagă reversibil şi inhibă unele tiol

proteinaze;

Pepstatina A, o substanţă naturală, cu structură asemănătoare unei pentapeptide, secretată de

unele specii de Streptomyces, inhibă la concentraţii de 1 M unele proteaze acide cu resturi

de acid aspartic în centrul catalitic activ.

Pentru a inhiba toate tipurile de enzime proteolitice prezente într-un extract proteic total se

utilizează amestecuri de astfel de inhibitori.

Exemple de amestecuri de inhibitori necesar minimalizării acţiunii principalelor tipuri de enzime

proteolitice din diferite ţesuturi sunt prezentate în tabelul....

Tabelul..

10

Inhibitori utilizaţi pentru controlul proceselor de proteoliză

Tip de ţesut Tipuri de proteinaze Inhibitori adăugaţi Soluţii stoc utilizate

Ţesuturi

animale

Serin-proteinazeMetalo-proteinazeAspartic- proteinaze

PMSF (1mM)EDTA (1mM)Benzamidă (1mM)Leupeptină (10 g/ml)Pepstatină A(10 g/ml)Aprotinină (1 g/ml)

0,2 M în metanol0,1 M în apă0,1 M în apă1 mg/ml în apă5 mg/ml în metanol0,1 mg/ml în apă

Ţesuturi ale

plantelor

Serin-proteinazeCistein-proteinaze

PMSF (1mM)Chimostatină(20g/ml)EDTA (1mM)E64 (10 g/ml)

0,2 M în metanol1 mg/ml în DMSO0,1 M în apă1 mg/ml în apă

Drojdii, fungi Serin-proteinazeAspartic- proteinazeMetalo-proteinaze

PMSF (1mM)Pepstatină A(15 g/ml)Fenantrolină (5 mM)

0,2 M în metanol5 mg/ml în metanol1 M în etanol

Bacterii Serin-proteinazeMetalo-proteinaze

PMSF (1mM)EDTA (1mM)

0,1 M în metanol0,1 M în apă

E64 : L – trans – epoxisuccinil leucilamino (4-guanidino) butan

Amestecurile de inhibitori prezentate în tabel sunt numai orientative. Pentru fiecare enzimă şi

pentru fiecare sursă biologică sunt necesare experimente prealabile prin care să se stabilească

tipurile de inhibitori care stopează cel mai eficient procesele de proteoliză care pot afecta funcţia

catalitică a enzimei supuse studiului.

Câteva aspecte legate de utilizarea inhibitorilor enzimelor proteolitice trebuie cunoscute:

Măsuri de protecţie. PMSF trebuie manipulat cu atenţie pentru că este foarte toxic. O alternativă

mai puţin periculoasă este înlocuirea lui prin 3,4 – dicloroisocumarină (DCI), compus mult mai

puţin toxic şi mai reactiv faţă de serin – proteinaze, dar mult mai scump. DCI este greu solubil în

apă (se prepară în dimetilsulfoxid – DMSO) şi este destul de instabil, timpul de viaţă a acestuia la

pH neutru fiind de 20 – 30 minute. Concentraţia acestuia în mediile de extracţie trebuie să fie de

0,1 mM.

Stabilitatea. PMSF este instabil în soluţii apoase, având la 250C şi pH = 7,0 un timp de

înjumătăţire de 30 minute. Acest dezavantaj poate fi înlăturat prin adăugarea repetitivă de volume

mici din soluţiile stoc la extractele proteice.

Solubilitate. Unii inhibitori, prezentaţi în tabel, sunt puţin solubili în apă şi de aceea se prepară

soluţii stoc în solvenţi organici. Volumul din soluţiile stoc care se adaugă în mediul de extracţie

trebuie să fie cît mai mic pentru a minimaliza efectul denaturant al solvenţilor organici;

Contaminarea cu microorganisme(mai ales bacterii şi virusuri)

O modalitate de a evita creşterea bacteriană în soluţiile proteice este utilizare soluţiilor tampon care

au fost în prealabil sterilizate şi filtrate. Unele tampoane, cum ar fi cele pe bază de fosfat, acetat şi

11

carbonat, la pH neutru sunt medii bune de dezvoltare a microorganismelor. Tampoanele cu pH – uri

sub 3,0 şi cele cu pH peste 9,0 nu permit în mod normal creşterea microorganismelor cu excepţia

unor mucegaiuri. Pentru prevenirea contaminării bacteriene se recomandă adăugare de agenţi

antibacterieni la soluţiile tampon. Cei mai eficienţi agenţi bacteriostatici sunt : azida de sodiu în

concentraţie de 0,001 M, mertiolatul în concentraţie 0,005 M şi unii alcooli, ca de exemplu

butanolul în concentraţie de 1%. Azida prezintă dezavantajul că este o substanţă nucleofilă care

leagă metalele. În cazul în care aceste substanţe interferă în determinările de activitate enzimatică

sau în separări cromatografice se recomandă adăugarea lor doar la soluţiile proteice supuse

conservării.

Formarea radicalilor liberi;

Extractele celulare preparate prin ultrasonicare sunt supuse acţiunii radicalilor liberi care apar ca

urmare a scindării moleculelor de apă la temperaturi locale ridicate induse în această metodă de

dezintegrare. Studiile intreprinse au arătat că efectele nedorite induse de ultrasunete asupra

proteinelor pot fi minimalizate prin sonicare unor suspensii având concentraţii celulare mari în

prezenţa în mediu a unor compuşi de tipul zaharurilor sau a N2O, compuşi cu acţiune protectoare

contra radicalilor liberi.

Formarea de spuma poate duce la distrugerea conformatiei enzimei de interes. Evitarea sau

micsorarea cantitatii de spuma ce poate aparea in procesul de separare/extractie a proteinelor este de

adaugare a unor antispumanti inerti cum sunt de exemplu uleiul alimentar sau Tween.

12