METODE DE DIAGNOSTIC MOLECULAR

=studiul bazelor moleculare ale procesului de replicare,transcriere și translație a materialului genetic.

ADN

ARN

Proteine

• Transcripția = primul pas în expresia genică.

ADN ARN

• Transcripția este procesul de creare a unei copii de ARN echivalentă a unei secvențe de ADN.

• In timpul transcrierii, o secvență de ADN este citită de ARN polimeraza, care produce o, catenă complementară de ARN.

• Translația = primul pas în biosinteza proteinelor.

Transcripție

Revers transcripție

Tehnici de biologie moleculară

Izolarea ADN sau ARN• Verificarea purității și determinarea cantității de ADN sau ARN• Reacția de polimerizare în lanț (Polymerase chain reaction - PCR)• Electroforeza în gel de agaroză• Secvențierea• Clonarea moleculară și Expresia genelor

• Tehnici bazate pe hibridizarea acizilor nucleici:• Northern Blot• Southern Blot• FISH• PCR• Microarray

Extracția materialului genetic

Metoda coloanelor cu membrană de siliciu

Tehnica cu particule magnetice

Sondele de acizi nucleici• Asocierea spontană a ADN-ului pe baza de complementaritate

reprezintă baza pentru tehnicile folosite în detectarea șicaracterizarea genelor.

• Sondele (primerii) sunt utilizate pentru a identifica geneindividuale sau secvențe de ADN.

• Sonda de acid nucleic reprezintă un segment scurt de ADNsau ARN de secvență cunoscută utilizată pentru a identificaprezența unei singure catene complementare de ADN înproba de cercetat.

• Legarea între cele două secvențe (sonda si proba de cercetat)este cunoscută sub numele de hibridare.

• Cele două secvențe trebuie să împărtășească cel puțin 16-20baze consecutive de complementaritate perfectă pentru aforma hibrid stabil.

• Sondele pot fi marcate: radioizotop, fluorocrom, enzimă sausubstrat chemiluminescent.

• Hibridarea poate avea loc în mediu suport solid sau lichid.

• este o tehnică ce poate localizasecvențe de acid nucleic înmaterialul celular.

• Metoda foloseste sondefluorescente care se leagă numai laacele părți ale catenei față de careprezință un grad ridicat decomplementaritate.

• Microscopul cu fluorescență estefolosit pentru a afla localizareasondei fluorescente.

FISH(Fluorescent In-Situ Hibridization)

EXEMPLU

Aplicații ale metodei în diagnosticul de laborator

Microarrays (tehnica cipurilor ADN)• Un cip ADN (ADN microarray) este un biosenzor care

analizează informații de segmente genomice provenitede la bacterii, virusuri, paraziți, fungi.

• Aceasta se bazează pe principiul complemetaritățiicele patru baze azotate: A (adenina), T (timină), G(guanina) și C (citozina) în care A este pereche cu T șiG este pereche cu C prin legături de hidrogen.

• O secvență de ADN cunoscută (sonda de ADN) esteplasată în plăci de sticlă cu microspoturi (cu diametrulde câțiva microni în diametru, aranjate în mai multerânduri).

• Segmentele de gene sunt extrase din materialepatologice diferite (de ex sânge, țesuturi), apoiamplificate și depuse în cipuri de ADN.

Principiu test: Rapid, cu rezultate precise ce evidențiază care alergeni la care este sensibil un animal.

Proba patologică: Indiferent de talia animalului de companie și de vârstă, este nevoie de doar 1-2 ml de sânge integral (sau mai mult de 0,2 ml de ser / plasma) pentru testare.

EXEMPLU

Aplicații ale metodei în diagnosticul de laborator

PCR (Polymerase chain reaction)

• Reacția de polimerizare în lanț este o tehnică pentru copierea ADN-ului.

• PCR-ul permite copierea unei singure secvențe de ADN (milioane de ori).

• PCR-ul are mai multe variante:• Revers-transcription PCR (RT-PCR) pentru amplificarea ARN

• PCR în timp real (qPCR) care permit măsurarea cantitativă a moleculelor de ADN sau ARN.

• Multiplex PCR-ul permite amplificarea mai multor segmente de ADN într-un singur experiment PCR.

ETAPELE REACȚIEI PCR

Principiul tehnicii PCR clasic

Principiul tehnicii real time PCR cu sonde

TaqMan

metoda PCR (tehnică calitativă)

EXEMPLE

Aplicații ale metodei în diagnosticul de laborator

Metoda real-time PCR (metodă cantitativă)

Referință

Valoare prag

Număr cicluri de amplificare

Sem

nal

flu

ore

scen

t

Fază exponențială

Fază lineară

Platou

TaqMan RT-PCR pentru detecție Enterovirus

Martor pozitiv

Ser

Urină

LCR

Număr cicluri de amplificare

EXEMPLU

Aplicații ale metodei în diagnosticul de laborator

Secvențierea ADN-ului• Metoda se bazează pe acțiunea ADN-

polimerazelor de a sintetiza o a doua catenăcomplementară secvenței de ADN matriță:

• Adăugarea de di-deoxinucleotide (ddNTP,lipsite 3'-OH necesară pentru formarealegăturii fosfodiester între 2 nucleotide) într-o concentrație scăzută pentru a seamesteca, termină prelungirea polimeruluiADN la puncte aleatorii.

• O serie de fragmente terminate la punctealeatorii în secvența de ADN sunt apoigenerate și analizate dând succesiunea ADN.

• Coloranți dichlororhodamine sunt folosiți pentru a marca ddNTP.FiecareddNTP este marcat cu o anumită variantă colorant, cu diferite lungimi deundă de emisie (de exemplu culoare diferită), rezultând într-o singură reacțiegeneratoare fragmente aleatorii, fiecare fragment fiind marcat cu un colorantcare corespunde bazei terminal.

• Aceste fragmente sunt separate folosind electroforeza în gel capilar.

• Detectarea se face prin intermediul unui laser ce emite la diferite lungimi deundă corespunzătoare pentru a detecta orice fluorescență.

• Se generează o urmă cromatografică a patru lungimi de undă de emisie (carecorespund celor patru ddNTP marcate).

METAGENOMICA

Prin această metodă suntextrași toți acizii nucleici(ADN și ARN) din materialulpatologic.

Ion Proton

Illumina

Principalele avantaje ale metode:• Identificarea de noi patogeni,

respectiv noi gene.• Secvențierea întregului genom.• Identificarea microbiotei așa cum

se găsește ea în natură.• Incadrarea filogenetică a

agenților patogeni.

Utilizările metagenomiciiîn bacteriologie

Probă/Material patologic

Utilizările metagenomicii în virusologie

EXEMPLU

Aplicații ale metodei în diagnosticul de laborator

Analiza filogenetică

• este reprezentarea istorieievolutive a unei specii sau grupde specii înrudite;

• este prezentată sub forma unuiarbore filogenetic;

EXEMPLU

Aplicații ale metodei în diagnosticul de laborator