INTRODUCERE ÎN CULTURILE DE CELULE ŞI ŢESUTURIVEGETALE

Sfârşitul mileniului doi se caracterizează printr-o puternică implicare a

biotehnologieiîn viaţa omului, în toate domeniile de activitate. Cu ajutorul

metodelor biotehnologice s-aufăcut progrese uriaşe în crearea de noi genotipuri de

plante şi rase de animale cu însuşirifavorabile şi cu randamente sporite faţă de

materialul de la care s-a plecat.Dezvoltarea biologiei moleculare din ultima

jumătate de secol s-a făcut, în principal, pe organisme simple ca mod de organizare

(bacterii, drojdii, alge, etc.), organismeunicelulare. Odată cu abordarea

organismelor pluricelulare trebuia verificat dacă noţiunileacumulate anterior erau

valabile şi dacă existau şi alte procese specifice modului complex deorganizare.

Cunoscându-se comportamentul organismelor simple, cercetătorii au început să

segândească la cultura pe medii artificiale a unor porţiuni de plante sau chiar

celule. Problemacare a apărut a fost aceea a menţinerii viabilităţii acestor celule, de

la prelevarea de pe plantamamă până la trecerea pe mediu nutritiv artificial sau mai

departe până la regenerarea(refacerea) unei noi plante.Ajungerea la cultura in vitro

nu a fost aşa de simplă cum s-a presupus fiind necesar mult timp şi multe cercetări,

la început fără succes, dar apoi totul s-a clarificat.În 1882, Sachs a fost cel care a

elaborat teoria conform căreia plantele îşi sintetizeazăsubstanţele ce determină

formarea organelor, substanţe ce au o dispunere polară, iar primeleîncercări de

culturi de ţesuturi au fost făcute în 1902, de către Haberland, din nefericire,

fărărezultatele dorite. Primele rezultate privind cultura de celule şi ţesuturi încep să

apară din anul1922, când Knudson reuşeşte germinarea seminţelor de orhidee in

vitro

Iar Robbins obţine prima cultură de ţesut de rădăcină în condiţii artificiale.Pe baza

conceptului de totipotenţă celulară, conform căruia fiecare celulă conţineinformaţia

genetică necesară obţinerii prin regenerare a unui organism vegetal complet, înanul

1

1952 Morel şi Martin au stabilit şi au perfecţionat o metodologie de cultivare pe

mediiaseptice a explantelor meristematice caulinare, obţinând prin creşterea in

vitro a acestora plante sănătoase, libere de viroze, pornind de la plante mamă

contaminate cu diferite viroze.În acest mod se produce material de plantat

devirozat, cu o rată de multiplicare într-un ritmimposibil de imaginat prin utilizarea

tehnicilor tradiţionale de înmulţire vegetativă, evitându-se şi degenerarea soiurilor

din cauza infecţiilor virale, transmisibile prin înmulţire vegetativă.În anul 1962,

după mulţi ani de studii şi încercări, Murashige şi Skoog, au reuşit săelaboreze un

mediu de cultură considerat ca fiind de bază , care – cu mici modificări – poate

fiutilizat pentru aproape toate tipurile de culturi de ţesuturi.Reuşita experienţelor

lui Coking în 1960 privind izolarea enzimatică a protoplaştilor dinmezofil foliar, a

făcut posibilă obţinerea unor populaţii mari de protoplaşti iar apoi producereade

hibrizi somatici.Anul 1966 este considerat drept începutul etapei moderne a

cercetărilor privind culturade explante vegetale in vitro.

Această etapă s-a caracterizat, în primul rând prin elaborarea detehnici eficiente în

generarea, cultivarea şi fuzionarea protoplaştilor vegetali. Cu ajutorul

protoplaştilor, odată cu descoperirea noilor tehnici (electrofuziune, vectori virali

transmiţătoride gene izolate) s-au obţinut plante rezistente la acţiunea unor agenţi

stresanţi cum ar fi: pesticide, linii celulare rezistente la stres hidric, termic etc.Atât

pe continentul american cât şi pe cel european sau asiatic, culturile in vitro

suntfolosite în special pentru multiplicarea speciilor floricole ornamentale, urmat

de multiplicareaspeciilor arboricole ornamentale şi fructifere, dar şi pentru

realizarea de noi genotipuri saumai ales pentru regenerarea celor create prin

inginerie genetică.

2

CULTURILE IN VITRO

1. DEFINIŢIE, CARACTERIZARE ŞIAPLICABILITATE

1.1. Definiţie

În sens general, prin cultura in vitro se înţelege creşterea pe medii artificiale,

încondiţii de asepsie deplină şi de factori ambientali bine controlaţi, a unor organe,

părţi deorgane, ţesuturi sau celule vegetale. Reuşita culturii depinde de o

multitudine de factori şi estevizibilă în momentul în care explantul

creşte.Explantul, numit şi inocul, este porţiunea de plantă (organ, ţesut, celulă) care

sedesprinde de pe planta donor (planta mamă), şi se inoculează în condiţii sterile

pe un mediuartificial de cultură. Evoluţia explantului este dirijată de operator în

funcţie de scopul urmărit.Acesta poate evolua formând o nouă plantă (sau mai

multe plante - neoplantule), prinstimularea dezvoltării organelor aeriene (tulpina şi

frunzele) şi a rădăcinii, sau poate formacalus, prin stimularea înmulţirii

nediferenţiate a celulelor.Explantul constituie unitatea vie ce conţine în celule

întreaga informaţie genetică a plantei mamă şi pe baza totipotenţei este capabil de a

regenera una sau mai multe planteidentice cu planta donor.Totipotenţa, este

însuşirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce şi de aforma o plantă

identică cu planta mamă. Teoretic fiecare celulă vie este totipotentă, însă în

practică s-a observat că nu toate celulele au capacitatea de a-şi exprima acest

caracter, datorită pe de o parte diferenţierii celulare şi îmbătrânirii, iar pe de altă

parte gradului mare despecializare al acelor celule.Astfel, s-a demonstrat practic

că, într- plantă matură, celulele specializate careconstituie ţesuturile, de exemplu:

traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la carelipseşte citoplasma şi

nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este explicat chiar prin faptulcă întreaga

informaţie genetică a celulei totipotente se află în cromozomii din nucleu.La

plantele cormofite, odată cu înaintarea în vârstă, o parte din celule îşi

3

pierdcapacitatea de totipotenţă sau aceasta se reduce foarte mult. Rămân, însă,

anumite zone în careactivitatea celulelor este intensă, având loc diviziunea şi

formarea aproape continuă de noicelule. Aceste celule sunt mici în dimensiuni,

poligonale, bogate în citoplasmă, au vacuolămică şi nucleu mare dispus central şi

prezintă o membrană celulozică, formând ţesutul cudenumirea de meristem.

Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creşterii în lungime şi

grosimea plantelor, fiind dispuse terminal atât în tulpină cât şi în rădăcini.

1.2 Caracteristicile culturilor in vitro

Spre deosebire de multiplicarea tradiţională, unde se operează cu seminţe sau

porţiunimari de plantă (marcote, butaşi, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc

explante mici, deordinul milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplaşti),

explante care în condiţiinormale de cultură nu ar reuşi să crească opunând

rezistenţă agenţilor patogeni şisintetizându-şi singure substanţele nutritive

necesare.Din acest motiv, pentru reuşita culturii de celule şi ţesuturi se cer

respectateurmătoarele condiţii:-prepararea unui mediu de creştere care să asigure o

bună nutriţie heterotrofă a explantului, prin asigurarea sursei de carbon organic

uşor accesibil explantelor;

-asigurarea şi controlarea factorilor de mediu (temperatură, lumină, umiditate) în

limiteleoptime pentru fiecare specie, soi şi fază de creştere, în funcţie de cerinţele

acestora şi scopulurmărit;-stimularea creşterii şi diferenţierii sau dediferenţierii

organelor prin utilizareacorespunzătoare a substanţelor stimulatoare de creştere;-

asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro

, prin dezinfecţiamaterialului vegetal, sterilizarea mediului şi a vaselor de cultură,

precum şi efectuarea tuturor operaţiilor în hota cu flux de aer laminar steril,

folosind instrumentar sterilizat prin flambare.

4

1.3 Domenii de aplicare a culturilor in vitro

Datorită spectrului larg de probleme la care culturile in vitroau răspuns afirmativ,

suntutilizate în prezent în agricultură, silvicultură, farmacie, industria alimentară,

industria uşoară,etc. În agricultură, în general şi în horticultură în special, culturile

de ţesuturi şi celule suntfolosite pentru multiplicarea unor specii, soiuri sau clone

valoroase, pentru ameliorareaspeciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei

horticole, pentru obţinerea de metaboliţisecundari.Avantajele culturii in vitro sunt

multiple, dintre care amintim:-asigură multiplicarea clonală rapidă a unor soiuri,

hibrizi sau clone valoroase pornindde la cantităţi mici de material vegetal. Teoretic,

se asigură o multiplicare exponenţială, princare în circa 6 luni se pot obţine 1

milion de plante;-se poate produce material săditor liber de viroze şi micoplasme,

material mai viguros, precoce şi productiv;-necesită spaţii mici de cultură şi se

valorifică bine spaţiul din laborator prin cultura peverticală pe 3-5 nivele

suprapuse;-obţinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte

explante de ţesuturigenerative (cu n cromozomi);-dă posibilitatea obţinerii

hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro , hibrizi careîn condiţii normale

sunt imposibil de obţinut;-selecţia de plante rezistente la stres, boli şi dăunători;-se

evită efectul sezonier de pepinieră;-se pot obţine seminţe artificiale;-se pot obţine

plante pe rădăcini proprii evitând astfel cheltuielile de altoire;-asigură multiplicarea

clonală a portaltoilor care nu înrădăcinează în condiţii normalede cultură;-asigură

păstrarea materialului în faza de plantulă până la primirea unor comenziferme de

multiplicare.Cu toate aceste avantaje, există specii care nu răspund bine la cultura

in vitro şi care,deocamdată rămân să fie înmulţite tradiţional.Există însă şi câteva

impedimente în utilizarea acestei metode pentru înmulţirea înmasă a plantelor, cum

ar fi:-necesitatea unui laborator cu dotările minime: instalaţii şi aparate

5

indispensabileactivităţilor de micropropagare, care sunt costisitoare;-necesitatea

unui personal specializat în multiplicarea clonală şi manipularea in vitro

;-utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi şi puţin accesibili tuturor unităţilor de

producţie;-nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care

nu răspundla metodele cunoscute de multiplicare;-există riscul apariţiei şi

multiplicării mutaţiilor recesive, cu afectarea autenticităţiisoiurilor;

creşte şi este apoi înlăturat fiind ulterior altoit pe alt portaltoi. După mai multe

altoiri altoiulîncepe să prezinte caracterele juvenile, ceea ce-l face apoi apt pentru

propagare prin butăşire.La culturile in vitro , s-au observat fenomene similare la

meristeme. Prima frunzuliţăce se formează are caractere juvenile (prima frunzuliţă

a meristemului la viţă de vie arecaracteristici similare celei dezvoltate din sămânţă,

de asemenea, şi la orhidee meristemeledezvoltă, în cultura in vitro , protocorm

identic cu cel obţinut din sămânţă). Rejuvenilizareaobservată este deseori obţinută

din prima subcultură, însă uneori sunt necesare mai multesubculturi pentru a obţine

aceste efect, în funcţie de specie.Întoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorată

supresiei de informaţii citoplasmaticesau datorită diminuării considerabile a

acestora determinând astfel posibilitatea regenerării denoi celule. Mecanismele

exacte ce determină aceste fenomen nu sunt încă pe deplincunoscute. Se pare că

citochininele sunt implicate, cel puţin parţial, în acest proces, dar ele nuacţionează

singure.Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci

când plantele donor sunt în stadiul reproductiv. Se pare că schimbările ce apar în

ritmul defuncţionare al meristemelor este favorabil şi determină în ţesuturi un

echilibru optim culturii in vitro .Se pot obţine culturi din ţesuturi prelevate de la

plante aflate în stadiul de senescenţă,dar rezultatele sunt în general slabe sau

incomplete.

6

2.Selecţia explantelor în funcţie de vârsta explantului

Problemele legate de vârsta explantului apar la speciile perene în care se

poatedistinge un stadiu activ şi unul lent, latent, între care reacţiile fiziologice sunt

diferite. Astfel, primele experimente, ce vizau cultivarea de meristeme la plantele

lemnoase, au eşuat atuncicând s-a încercat iniţierea unei culturi de ţesuturi din

meristeme prelevate de pe ramuri învegetaţie, dar au avut succes atunci când s-a

pornit de la meristeme prelevate din muguridorminzi.De-a lungul unui ciclu anual,

echilibrul intern al plantelor se schimbă. Primăvaraorganele cresc şi analizele

relevă prezenţa regulatorilor de creştere de tipul auxinelor,giberelinelor şi

citochininelor. Vara transportul fitohormonilor prin vasele conducătoare

sediminuează, iar toamna se sintetizează inhibitorii creşterii. De aceea, nu e

surprinzător faptulcă explantele, prelevate de la aceeaşi plantă în perioade variate

ale vegetaţiei, vor darăspunsuri diferite chiar dacă vor fi plasate pe acelaşi tip de

mediu.De aceste considerente trebuie să se ţină seama atunci când se are în

vederemicropropagarea speciilor lemnoase. Unele explante au tendinţa de a

înrădăcina uşor atuncicând sunt prelevate în anumite faze de vegetaţie, în special

dacă sunt excizate în perioada devegetaţie, când concentraţia de auxină este

maximă.La speciile cunoscute deja ca „recalcitrante” la cultura in vitro , pentru

realizarearejuvenilizării se poate supune planta mamă, pentru o perioadă scurtă,

unui tratament cutemperaturi scăzute, unui regim de lumină particular sau unui

tratament cu fitohormoni pentrumodificarea echilibrului lor intern în vederea

stimulării rizogenezei.

2.1.Selecţia explantelor în funcţie de amplasarea plantei donor

După determinarea stadiului şi perioadei optime explantele pot fi prelevate. După

tipulde organizare a fragmentului ce urmează a fi cultivat in vitro se pot lua în

considerare douăcazuri:

7

Explantele ce au o structură rudimentară sau organizată, cum e cazul

mugurilor,apexurilor caulinare, meristemelor şi apexurilor florale, sunt cele mai

utilizate pentru iniţiereaunei culturi de ţesuturi, deoarece acestea sunt receptive şi

ridică cele mai puţine probleme,generând cu uşurinţă, în condiţiile unui mediu de

cultură adecvat, structuri organizate (deexemplu, organe). Dacă mediul de cultură

nu este potrivit poate tulbura funcţiile explantuluişi conduce la dediferenţierea

celulelor, generând calus.Utilizarea acestui tip de explante este similară unei

microbutăşiri şi este tehnica celmai des folosită atunci când se urmăreşte

micropropagarea pe scară largă a unei specii.Interesant de amintit este faptul că

explantele posedă un fel de memorie a tipului decreştere ce l-au prezentat in vivo ,

acest fenomen fiind în special întâlnit la speciile lemnoase.La mai multe plante la

care corelaţiile de creştere sunt puternice, explantele provenite dinramuri laterale

au generat plante cu rădăcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor planteculcate la

pământ şi nu erecte. Unele cercetări au evidenţiat faptul că această

„memorie”aparţine celui mai apropiat internod de lângă meristem.2.Explantele

constituite din diferite tipuri de ţesuturi, cum ar fi fragmente de tulpină,frunze, flori

şi fructe, cărora, inoculate pe mediu de cultură, li se induce o reversie completăcu

scopul de a restaura capacitatea celulelor de a se divide şi de a-şi câştiga din

noucapacitatea organogenică.Pentru aceste explante, în funcţie de specie, s-a

dovedit că toate părţile plantei suntcapabile să urmeze procesul dediferenţierii

conducând spre o nouă organizare structurală. Dar,în acest caz, diferenţele între

specii sunt uriaşe. Unele specii, cum ar fi violetele de Parma,sunt capabile să

regenereze din toate părţile plantei (peţiol, limb, rădăcini, petale, stamine, polen,

ovule), alte specii sunt mai recalcitrante, cum ar fi Actinidia sinensis , la care

rezultatenotabile au fost obţinute doar din fragmente de tulpină. Unele specii sunt

total recalcitrante,nereuşindu-se iniţierea culturii de ţesuturi din explantele

amintite, iar la unele conifere s-areuşit obţinerea de propaguli doar din

8

cotiledoane.În general, cele mai bune rezultate au fost obţinute, la cele mai multe

specii, dinfragmente de limb foliar şi tulpini tinere.

2.2 Selecţia explantelor în funcţie de mărimea şi natura acestora

Mărimea explantului ce urmează a fi cultivat prezintă cea mai mare importanţă. Cu

câtexplantul este mai mare cu atât echilibrul endogenic al acestuia este mai

determinant şimediul de cultură va avea o influenţă limitată. În cazul explantelor

de dimensiuni micidirecţionarea acestuia în sensul dorit se face mai uşor, deoarece

explantul este receptiv lasubstanţele din mediul de cultură, şi anume la regulatorii

de creştere existenţi.Explantele organizate cuprind în general un nod, un apex sau

un mugure (solzii protectori sunt înlăturaţi), fiind o unitate suficient de completă

pentru care mediul va favorizacreşterea, sau în cazul diferenţierii axilare, va bloca

creşterea apicală. Pentru meristemele cetrebuie să aibă dimensiuni foarte mici,

există o mărime minimă ce conţine domulmeristematic cu două primordii foliare.

Sub această mărime supravieţuirea explantului estefoarte dificilă şi pierderile sunt

mari, peste această dimensiune, răspunsul la cultura in vitro este mult mai bun ,

însă în detrimentul eliminării virusurilor.Dimensiunile explantelor variază între 5 şi

10 mm, ceea ce corespunde uneimanipulări uşoare a materialului vegetal, sub

aspectul excizării sau prelevării, fasonării şiinoculării acestora. De exemplu, prin

cultivarea pe acelaşi mediu de cultură, a mai multefragmente de peţiol de

Saintpaulia , de 1,5; 3; 5 şi 7 mm, s-a observat că doar fragmentele de peste 3 mm

au generat plantule normale. Fragmentele de 1,5 mm au generat două tipuri

derezultate: unele explante s-au veştejit, iar altele au format doar rădăcini. Fără

îndoială, în ultimul caz, auxinele prezente în mediu au jucat cel mai important rol,

pe când în cazulfragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat în joc şi

fitohormonii endogeni.Se pot fasona explante din diferite tipuri de ţesuturi:

epidermal, cortical, parenchimmedular, dar şi răspunsurile vor varia. Cel mai

9

regenerativ tip de ţesut este cel epidermal.Ţesuturile corticale şi cambiale prezintă

de asemenea rezultate bune, dar rămân deseori înstadiul de calus. Parenchimul

medular este ţesutul cel mai puţin regenerant, aceste ţesuturi cer o armonizare

perfectă între regulatorii de creştere, un exemplu fiind dat de Skoog, care afolosit

măduvă de tutun pentru a determina rolul echilibrului dintre auxine şi

citochinine.Din ţesuturi epidermale de câteva straturi grosime a fost posibilă

orientarea regenerăriispre stadiul caulogenic (lăstari), rizogenic (rădăcini),

calusogenic sau reproductiv. Acestexperiment confirmă ipoteza unei activităţi

crescute a fitohormonilor asupra explantelor dedimensiuni reduse.Cel mai mic

explant este constituit dintr-o singură celulă, cum e cazul protoplaştilor izolaţi

mecanic sau enzimatic. Protoplaştii sunt capabili de a se divide şi a reproduce

plante,dar nun sunt capabili de inducerea meristemelor florale.

2.3 RĂSPUNSUL EXPLANTELOR ÎN CULTURĂ

Prima problemă ce trebuie rezolvată, atunci când se iniţiază o cultură in vitro

estemenţinerea viabilităţii (pe lângă problema asepsiei) explantului. Deseori se

poate observa,după fasonarea explantului, o brunificare a celulelor,mai ales a celor

ce vin în contact directcu mediul de cultură, fenomen datorat oxidării substanţelor

fenolice sintetizate în mediu,oxidare ce are efect toxic asupra celulelor vegetale.

Mai mult, celulele moarte pot diminua sauanula schimburile dintre explant şi

mediul de cultură. Nu toate speciile prezintă fenomenul de brunificare a

explantelor, deoarece la aceste specii problema este parţial rezolvată prin

imersiaexplantelor într-o soluţie antioxidantă (soluţie de acid ascorbic cu acid citric

în proporţie de0,5 % respectiv 0,05%), imediat după fasonarea acestuia sau prin

adiţia în mediul de cultură aunor substanţe adsorbante sau detoxificante, cum ar fi

cărbunele activ (1 până la 4 g/l) sau polivinilpirolidonă (5 până la 10g/l).Odată

10

rezolvată această problemă este necesară orientarea explantului, în funcţie denatura

sa, în direcţia dorită de operator.

2.4. Explante cu structură rudimentară

Explantele din această categorie pot fi cultivate prin două metode.Prima metodă

constă în inducerea creşterii apicale prin adiţia în mediul de cultură

afitohormonilor din clasa auxinelor şi/sau a giberelinelor, foarte rar se pot adăuga

şicitochinine, întotdeauna într-o doză foarte mică.După iniţierea pe acest tip de

mediu se observă apariţia unor formaţiuni calusare la baza explantelor. Este de

dorit ca aceste explante să rămână de dimensiuni mici, deoarecedacă acest calus

creşte în dimensiune, ceea ce deseori se întâmplă, indică existenţa unuidezechilibru

între substanţele minerale sau fitohormonii din mediul de cultură. După

formareacalusului, ce are rol protector (asemeni calusului format la o rană) se

formează primafrunzuliţă, apoi prima rozetă de frunze şi mai târziu are loc

elongarea tulpinii (axului principal). Aceste etape morfogenice pot avea loc pe

acelaşi tip de mediu la unele speciiornamentale (crizanteme, garoafe) sau pe două

medii succesive, la speciile lemnoase. Primulmediu va iniţia creşterea, putând fi

utilizat ulterior şi pentru propagarea fragmentelor cu unnod (microbutăşire). Al

doilea mediu, îmbogăţit cu auxine (cel mai frecvent, acidul indolilacetic), serveşte

ca mediu de înrădăcinare ( Actinidia , măr, numeroase specii lemnoase).

Cultura plantelor superioare in vitro

Posibilitatea de a cultiva celule izolate şi, mai ales, de a realiza culturi de

protoplaşti, permite unele manipulări genetice (fuziuni celulare, transfer de gene),

imposibil de realizat în alte condiţii.

Practicarea culturii in vitro presupune existenţa unui spaţiu amenajat şi

echipat în acest scop, a unor vase din sticlă sau material plastic, a mediilor de

11

cultură adecvate şi, desigur, a materialului biologic, sub formă de celule, ţesuturi,

organe sau plante. Asepsia (absenţa microorganismelor) este o condiţie sine qua

non a reuşitei fiecărei culturi in vitro. Deoarece mediile nutritive folosite cu

această ocazie le oferă condiţii foarte bune de dezvoltare, bacteriile şi ciupercile

invadează culturile in

vitro într-un timp foarte scurt dacă nu se asigură asepsia spaţiilor de transfer,

vaselor de cultură, mediului, instrumentelor şi materialului biologic adecvat. După

J. Huang (1982), sursele de infecţie pot fi:

- aerul, care conţine o mare cantitate de microorganisme sub formă de spori;

- ţesutul vegetal, la suprafaţa căruia se pot găsi ciuperci şi/sau bacterii;

- corpul uman, care vehiculează pe piele sau prin aerul expirat numeroase

microorganisme.

Sterilizarea se poate realiza prin două tipuri de metode:

- fizice, folosind vapori de apă sub presiune (121°C), aer uscat fierbinte

(180°C) ori iradierea (raze ultraviolete sau gamma) - metode care distrug

microorganismele - sau efectuând filtrarea sub presiune, care elimină

microorganismele al căror diametru depăşeşte 0,22 microni;

- chimice, care constau în tratamente cu compuşi sterilizanţi, cum sunt

hipocloritul de sodiu sau calciu, alcoolul, clorura mercurică, diversele produse

bactericide şi fungicide.

Pentru funcţionarea eficientă a unui laborator de culturi in vitro, este nevoie

de spaţii repartizate, amenajate şi echipate corespunzător pentru executarea

următoarelor activităţi:

12

►prepararea mediilor de cultură;

►pregătirea, prin spălare şi sterilizare, a sticlăriei necesare pentru prepararea

mediilor şi realizarea culturilor;

►depozitarea sticlăriei, substanţelor chimice, mediilor nutritive,

etc.;

►iniţierea şi transferul culturilor;

► incubarea culturilor, în condiţii de temperatură controlată (17- 27°C) şi

fotoperioadă.

Dotarea minimă a unui asemenea laborator include:

- lupe binoculare;

- microscoape inversate;

- balanţe de precizie (0,01 g) şi analitice (0,0001 g);

- pH-metru;

- autoclave;

- maşini de spălat sticlăria;

- etuve pentru sterilizat sticlăria;

- dulapuri climatizate;

- mese cu flux de aer laminar, orizontal sau vertical;

- frigidere, congelatoare;

- aparate pentru distilat şi demineralizat apa.

13

Cultura in vitro poate fi practicată în vase de sticlă sau din material plastic de

forme şi mărimi diferite. Vasele din sticlă utilizabile atât pentru prepararea

mediilor cât şi pentru cultură sunt cele existente în cele mai multe laboratoare:

baloane Erlenmayer, pahare Berzelius, pipete, cilindrii gradaţi, baloane cotate,

vase Petri. Vasele de cultură din sticlă nu trebuie să elibereze cationi toxici. Din

această cauză, se recomandă folosirea celor confecţionate din sticlă Pyrex sau

borosilicat (Badea, E„ 2001).

Deşi scumpe, vasele de cultură din material plastic au început să

înlocuiască vasele de sticlă, deoarece prezintă numeroase avantaje. Calitatea

materialului face posibilă atât confecţionarea unor recipiente foarte variate ca

formă şi dimensiuni, absolut adaptate cerinţelor, cât şi sterilizarea acestora la

121°C. în laboratoarele comerciale, se recurge însă şi la borcane din sticlă

obişnuită, folosite în mod curent pentru ambalarea alimentelor.

Pregătirea sticlăriei ocupă un loc important în activitatea unui laborator de

cultură in vitro. Din această cauză, spaţiul destinat spălării şi sterilizării trebuie

echipat corespunzător, cu surse de apă deionozată, distilată şi bidistilată, ca şi cu

14

Figura 12. Vase de cultură şi sticlărie de laborator

diferite tipuri de etuve. Sticlăria uscată se sterilizează prin expunerea la aer

fierbinte (180°C), timp de 2-3 ore, în etuve. O serie de alte materiale (filtre, apă

distilată, capace din material plastic, dopuri din bumbac sau tifon) se sterilizează

prin autoclavare (cu vapori de apă sub presiune), timp de 15-20 de minute, la

121°C (Badea, E., 2001).-

2.4.1. Medii de cultură in vitro

Un mediu de cultură in vitro are o componentă anorganică, constituită din săruri

minerale şi o componentă organică, ce include carbo- hidraţi, vitamine şi substanţe

reglatoare ala creşterii. Mediile folosite pentru culturi statice conţin şi un agent

gelifiant, care de obicei, este agarul. Apa folosită pentru prepararea mediilor

trebuie să fie purificată, deionizată, distilată, filtrată. Diferiţi cercetători au studiat

cerinţele de elemente minerale ale ţesuturilor cultivate şi au elaborat medii cu

compoziţii bine definite care le poartă numele: White, Murashige şi Skoog,

Gamborg, Schenck şi Hildenbrandt, Nitsch, etc.

Componenta anorganică a mediilor de cultură in vitro include elementele

esenţiale pentru creşterea plantelor, la care se adaugă uneori, aluminiul şi nichelul.

în funcţie de cantităţile care se găsesc în diferitele formule de mediu, acestea se

împart în:

- macroelemente (N, P, K, S, Mg, Ca)

- microelemente (B, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo, Al, I, Fe).

Toate elementele sunt incluse în mediu sub formă de săruri, alese îndeosebi

după criteriul solubilităţii.

Componenta organică. Celulele şi ţesuturile cultivate in vitro nu sunt

autotrofe, adică nu sunt capabile să sintetizeze carbohidraţi prin asimilarea CO2 în

15

timpul fotosintezei. Din această cauză, în mediile în care sunt cultivate trebuie

introdusă zaharoză, într-o concentraţie de 2- 3%. In culturile de celule sau de

ţesuturi in vitro, absenţa sau insuficienţa unor vitamine constituie tot atâţia factori

limitativi ai creşterii, drept pentru care în mediile de cultură se adaugă în mod

curent tiamină (B1) - 0,1-10,0 mg/l, acid nicotinic (PP) - 0,1-5,0 mg/l, piridoxină

(B6) - 0,1-1,0 mg/l. Se mai utilizează biotina (H), cholina, acidul folie (M), acidul

pantotenic, riboflavina (B2) şi, frecvent, m-inositolul. Dintre cele cinci clase de

reglatori de creştere (fitohormoni sau hormoni vegetali) existenţi în plante, numai

două - auxinele şi citochininele - se folosesc în mod frecvent. Mult mai rar se

recurge la gibereline şi extrem de rar la acidul abscisic (Schrott, M., 1995).

Fitohormonii orientează procesele de dezvoltare in vitro. De exemplu, tipul

de morfogeneză dintr-o cultură depinde de concentraţiile auxinelor şi

citochininelor şi de raportul dintre aceste categorii de hormoni. Mai precis, o

valoare mare a raportului auxină/citochinină favorizează rizogeneza, embriogeneza

şi calusogeneza, iar o valoare mică - proliferarea mugurilor axilari şi

organogeneza, directă sau indirectă. Au fost semnalate însă şi cazuri în care

răspunsurile culturilor in vitro la apprtul de fitohormoni în mediu nu au fost cele

aşteptate. De exemplu, s-a constatat că, la unele specii lăstărirea axilară este

favorizată de prezenţa auxinei în cantităţi ce depăşesc nivelul citochininei,

formarea căluşului fiind indusă numai de auxine (Gegenbach, B., 1975).

Auxinele - AIA, AIB (acidul indolil butiric), ANA (acidul naftil acetic) sau

2,4-D (acidul 2,4 diclorofenoxiacetic) - sunt folosite în concentraţii de 0,01-10,0

mg/l. Citochininele - kinetina, BAP (benzii aminopurina), 2IP (2 izopentenil

adenina) şi zeatina - sunt adiţionate în mediu în cantităţi ce oscilează între 1 şi 10

mg/l. Giberelinele nu sunt esenţiale pentru cultura plantelor in vitro. In general, ele

induc alungirea intemodurilor şi creşterea meristemelor. De asemenea, se folosesc

16

frecvent pentru germinarea embrionilor, deoarece induc ieşirea din latenţă.

Tabelul 4

Compoziţia celor mai importante medii folosite pentru cultura in vitro

Compoziţia MS Nitsch Bs

Gamborg

Schenk şi

HildebranSăruri minerale

KNO3 1900 950 2500 2500NH4NO3 1650 720 - -(NH4)? - - 134 -

CaCI?.2H70 440 220 150 200NH4H2PO4 - - - 300MgS04.H20 370 185 250 400

Na - 150 - -kh,po4 170 68 - -

FeS04.7H20 27,8 27,8 27,8 15Na2EDTA 37,3 37,3 37,3 20

MnS04.4H?0 22,3 25 13,2 13,2H3BO3 6,2 10 3 5

ZnS04.7H20 8,6 10 2 1Kl 0,83 - 0,75 1

Na? 0,25 0,25 0,25 0,1CUS04.5H20 0,025 0,025 0,025 0,2CaCI2.6H20 0,025 - 0,025 0,1Vitaminem-lnositol 100 100 100 100Thiamina 0,1 0,5 100 5Piridoxina 0,5 0,5 10 0,5

Acid 0,5 5 10 5Biotina - 0,05 - -

Acid folie - 0,5 - -Glicina 2 2 - -

Zaharoză 30000 20000 30000 30000

De obicei, tipul de cultură şi implicit de explant, determină tipurile şi

concentraţiile hormonilor ce vor fi folosiţi. De exemplu, explantele care

sintetizează auxina nu mai necesită adiţionarea în mediu a acestui hormon pentru

alungirea şi/sau diviziunea celulelor (Wess, L., 2000).

Din acest punct de vedere, pot exista următoarele tipuri de culturi:

17

- culturi care nu necesită nici un hormon;

- culturi care au nevoie numai de auxine;

- culturi care au nevoie numai de citochinine;

-culturi care au nevoie atât de auxine, cât şi de citochinine.

Celulele cultivate sunt capabile să sintetizeze toţi aminoacizii necesari. Totuşi,

includerea unor aminoacizi în mediul de cultură, separat sau în amestecuri, poate

favoriza creşterea, deoarece constituie o sursă de azot mai accesibilă celulelor

decât aportul de azot anorganic. Creşterea in vitro poate fi stimulată şi prin

adăugarea în mediul de cultură a unor extracte organice, hidrolizate proteice,

endosperm lichid din nuci de cocos, extracte de drojdii, de cartof şi tomate, etc.

Marea lor variabi- litate, de la o sursă la alta, limitează însă folosirea acestor

extracte la cazurile în care nu au fost obţinute rezultate pozitive cu medii definite

chimic.

Agarul - un polizaharid extras din algele genului Gelidium - este cel mai

folosit agent de gelificare a mediilor de cultură, deoarece se dizolvă în apă la 90°C,

iar prin răcire sub 40°C formează un gel transparent, mai mult sau mai puţin solid,

în funcţie de concentraţie, puritate, marcă şi pH. Soluţia de agar poate fi turnată,

pipetată, dar odată gelifi- cată, trebuie reîncălzită (la microunde sau în bain-marie),

pentru a se li- chefia din nou. Concentraţia agarului în mediile de cultură in vitro

este de 5-10 g/l.

Prepararea mediului de cultură necesită sticlărie curată, apă de calitate

corespunzătoare, substanţe chimice pure şi o atentă dozare a tuturor

componentelor. Este o etapă esenţială, erorile de preparare a mediului de cultură

fiind printre cauzele majore ale eşecurilor.

18

Mediile de cultură se pot prepara astfel:

- din amestecuri de săruri, sub formă de pudră, preambalate (producători:

K.C. Biological Inc. şi Gibco Inc. din S.U.A., Flow Laboratory, din Scoţia);

- din soluţii stoc, de zece sau de o sută de ori mai concentrate (în funcţie de

solubilitatea substanţei şi de concentraţia finală în mediul de cultură), păstrate în

frigider, la 4-5°C;

- cântărind, una câte una şi dizolvând sărurile prevăzute în reţeta tipului de

mediu dorit.

înainte de .sterilizare, după adăugarea zaharozei şi a hormonilor

termostabili, se ajustează valoarea pH la cote cuprinse între 5,0 şi 6,5. Sterilizarea

componentelor termostabile se face prin autoclavare, iar cea a componentelor

termolabile, prin filtrare sub presiune pozitivă. Mediile şi apa distilată pot fi

autoclavate la 121°C şi un timp variabil în funcţie de volum: 20 de minute pentru

volume de 20-50 ml, 25 de minute în cazul volumelor de 250-500 ml şi 35 de

minute pentru volume de 500-5000 ml. Presiunea nu trebuie să depăşească 1

atmosferă, pentru a nu favoriza descompunerea zaharozei sau a altor componente.

Prin filtrare, se sterilizează vitaminele, aminoacizii, extractele vegetale, enzimele,

unii hormoni (AIA, GA3), antibioticele. Se pot utiliza filtre de unică folosinţă,

ataşate la o seringă ce conţine lichidul. Pentru volume mai mari, se pot folosi filtre

la care se adaugă membrane filtrante standard existente pe piaţă. în asemenea

cazuri, filtrul se ataşează la un vas colector. Unitatea filtrantă se sterilizează prin

autoclavare. Soluţia sterilizată se adaugă în mediul de cultură care a fost autoclavat

şi răcit (la 45-50°C), cu o pipetă sterilă. Volumul de lichid trebuie să conţină

cantităţile prevăzute de reţeta pentru soluţia finală.

Tabelul 5

19

Tratamente aplicate pentru sterilizare_

Orga Pretratamente Tratamente PosttratameSemin

ţe

imersia în alcool (70%)

timp de 10-20 de

secunde

Imersia în

soluţie de

Ca(CIO)2

Trei spălări

cu apă

distilată Fruct

e,

Spălarea cu vată

îmbibată în alcool

(70%)

Imersia în

soluţie de

NaClO (2%),

m ti m

Tulpi

na

Spălarea cu apă

curentă; ştergerea cu

vată îmbibată în alcool

Imersia în

soluţie de

NaClO (2%),

m jj “

Organe

de re-

zervă

Spălarea timp

îndelungat cu apă

curentă

Imersia în

soluţie de

NaClO (2%),

“ w "

Frunz

e

Ştergerea fetei

superioare cu alcool

Imersia în

soluţie de

Şase spălări

cu apă

Pregătirea materialului vegetal presupune eliminarea bacteriilor, ciupercilor

şi altor microorganisme, toate acestea necesitând o sterilizare de suprafaţă

completă, fără a afecta însă integritatea materialului vegetal. în general, materialul

vegetal provenit din câmp este extrem de greu de sterilizat. Din această cauză, se

recurge frecvent la obţinerea lui în laborator, asigurându-se un mediu aseptic încă

din faza de germinare.

Un protocol standard de sterilizare include următoarele etape:

- spălarea cu apă curentă;

- imersia într-o soluţie sterilizantă (hipoclorit de sodiu sau de calciu);

- spălarea cu apă distilată sterilă.

De obicei, contaminările devin vizibile după 7-10 zile. Există însă

contaminanţi interni care nu se manifestă timp de mai multe subcultivări. Timpul

20

de sterilizare şi concentraţia soluţiei sterilizante se aleg pentru fiecare material

experimental în parte. Sterilizarea materialului vegetal se face în hote cu flux

laminar. Tot aici, se repartizează şi mediul în spaţiile de cultură (dacă nu a fost

repartizat înainte de sterilizare).

Iniţierea unei culturi in vitro presupune: confecţionarea explantelor din

material vegetal sterilizat, folosind instrumente sterile; trecerea explantelor în

vasele de cultură prin inocularea la suprafaţa mediului şi transferarea în dulapurile

sau camerele climatizate. La intervale regulate de timp se fac subcultivări, adică se

transferă căluşurile, lăstarii, embrionii, etc. pe medii proaspete (Badea, E., 2001).

Tabelul 6

Tipuri de culturi in vitro____________

Tipul de cultură ScopulCultura de embrioni Scurtarea ciclului de ameliorare

Prevenirea avortării embrionilor

Depăşirea incompatibilităţii Cultura de

meristeme

Eliminarea patogenilor (virusuri,

bacterii, ciuperci) Clonarea plantelor

Conservarea germoplasmei Stocarea Cultura de apexuri

şi noduri

Lăstărirea axilară pentru donare

CrioprezervareaCultura explantelor

fără muguri

Clonarea prin formarea organelor

adventive Izolarea mutantelor Cultura de

calus/celule în

suspensie

Clonarea planielor prin formarea

mugurilor sau embrionilor

Cultura de antere şi

mi- crospori

Producerea haploizilor şi liniilor

homozigotice Producerea plantelor Cultura de ovule şi

flori excizate

Depăşirea incompatibilităţii pre şi

postzigotice Prevenirea absciziei Cultura de

protoplaşti

Hibridarea somatică şi crearea

cibrizilor Transferul de gene şi crearea 21

Cultura de

protoplaşti, celule,

ţesuturi şi organe

Studii de frtopatologie: pătrunderea şi

replicarea virusurilor; interacţiunea

gazdă-parazit, etc.

în funcţie de gradul de organizare, culturile in vitro pot fi:

- organizate (plante întregi, embrioni, organe), realizate mai ales în scopul

micropropagării;

- neorganizate (căluşuri, suspensii), realizate mai ales pentru selecţia

mutantelor, izolarea protoplaştilor, etc.;

- neorganizate/organizate, care permit parcurgerea etapelor:

explant -> calus/suspensie —► embrioni/muguri -> plante.

Cu alte cuvinte, acest tip de culturi fac posibile dediferenţierea şi

rediferenţierea.

Tipurile de culturi in vitro mai pot fi clasificate şi în funcţie de natura

materialului vegetal în:

- culturi de plante (obţinute prin germinarea seminţelor, embrionilor sau prin

înrădăcinarea lăstarilor);

- culturi de embrioni;

- culturi de organe (apexuri, rădăcini, antere, etc.);

- culturi de explante (porţiuni de organe, ţesuturi, etc.);

22

- culturi de calus (în care ţesuturile diferenţiate dediferenţiază şi produc o

masă de celule numită calus);

- culturi de celule în suspensie (căluşuri sau explante de diferite origini,

cultivate în mediu lichid, agitat, care generează o masă de celule izolate şi de

agregate celulare mici);

- culturi de protoplaşti (celule lipsite de peretele celular).

2.5. Regenerarea plantelor din celule cultivate in vitro

Celulele plantelor posedă două caracteristici pe care se bazează

biotehnologiile, cu toate aplicaţiile lor:

- pot fi cultivate in vitro, pe medii sintetice;

- pot regenera organisme complete, capabile să se reproducă. Această a doua

caracteristică, numită totipotenţă, este proprie numai plantelor superioare, ceea ce

demonstrează că programul de diferenţiere este flexibil, orice celulă diferenţiată

putând deveni, în anumite condiţii, totipotentă.

Cultura in vitro este un ansamblu de tehnici care presupune folosirea unor

elemente de asepsie şi realizarea unui mediu perfect controlat. Pe un mediu

nutritiv sintetic, se pot cultiva plante întregi, organe, fragmente de organe, ţesuturi

şi bineînţeles, celule izolate şi protoplaşti. Materialul vegetal folosit pentru

iniţierea culturilor in vitro poartă numele de explant. Atunci când se realizează

culturi de fragmente de organe sau culturi de celule pe medii adecvate, în condiţii

controlate de lumină, temperatură şi umiditate, prin acţiunea componentei

hormonale a mediului se induce dediferenţierea celulelor diferenţiate, care încep

apoi să se dividă. Organul îşi pierde treptat structura, în decursul a 3-4 săptămâni.

23

Bibliografie

1. www.referat.ro

2. www.agbioview.org

3. www.bioresurse.ro

4. Bonciu Elena, Iancu Paula 2011 - Noţiuni de bioinginerie şi biotehnologii. Strategii

şi aplicaţii, Editura Sitech

5. Popa,L. 1988 – Ingineria Genetică Editura. ştiinţifică şi enciclopedică, Bucureşti

24

25