cultivos_cel

8/8/2019 cultivos_cel

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Gloria L. CamargoLaboratorio de Virologa

Universidad de Boyaca


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Que son los cultivos celulares?...Quesonlos cultivos celulares?...Conjunto de tcnicas Mantenimiento o

crecimientoCell, tejidos u

rganos (animalo vegetal)

Cto, x.x, metabolismos Ambiente artificial

in vitro

Fisiolgicas,bioqumicas,

genticas

propiedades


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APLICACINAPLICACIN......

AislamientoAmplificacin

Descubrimiento

Vacunas Rta inmunitaria

Hospedero

Biologa molecularBioqumica


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HISTORIA...HISTORIA... Von Recklinghansen. Logro mantener vivos por mas de un mes hematies de anfibios

Roux. Demostr la factibilidad de mantener cell vivas en medios artificiales

Harrison.

Estudio sistemtico de los cultivos en cell in vitro

Steinhadt. Virus de la viruela sobreviva varias semanas en cultivos de tejidos de cornea de conejos y caballos

Topacio y Hyde Los virus al multiplicarse producen cambios en los cultivos cell ECP

Earle y col. Demostraron que para que una cell se divida necesita ser alimentada con los nutrientes correctos Enders y col. El virus de la poliomielitis puede propagarse en cultivos cell de origen diferente al tejido nerviosos


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ry y col. Establecen la primera lnea cell continua (HeLa). Medios con plasma de pollo, extracto SFB

Se investiga los requerimientos nutritivos de las cell en cultivo. Suero, a.a, azucares.

Hayflick y Moorhead Usaron por primera vez a/b para prevenir la contaminacin de los cultivos de fibroblastos. Pudieron realizar 12 pases de los cultivos.

Austi Tocco y Sato.

Se empiezan a establecer las primeras lneas celulares diferenciadas Sato y col demuestran que las diferentes lneas celulares requieren mezclas distintas de hormonas y factores de crecimiento.

Se realiza la vacuna para la Influenza A H1N1 en Cultivos Cell


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Consiste en transferir clulasde un cultivo crecido a unnuevo recipiente, para que segenere otro cultivo. (PASE)

Extraer el rgano otejido del organismode origen

Tienen diferentesclases de cultivo,que se caracteriza

Capacidad dereplicacion

Capacidad deser sub-cultivado

CLASES DECULTIVOSCELULARES...CLASES DECULTIVOSCELULARES...


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CULTIVOS EN MONOCAPA...CULTIVOS EN MONOCAPA...

Clulas adherentes ocultivos fijos

Requieren unirse SUPERFICIE

Dependientes de

anclajeMULTIPLICARSE2 TIPOS

AGITACINESTACIONARIO


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CULTIVOS EN SUSPENSIN ...CULTIVOS EN SUSPENSIN ...

Clulas se multiplican Suspendidas

Medio liquido

Subcultivo por dilucin No adhesin

Cultivo inicialadquiri mximo

de saturacin


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CULTIVOPRIMARIO...CULTIVOPRIMARIO...

MXIMO 10 SUBCULTIVOS.

Clulas provenientesdel tejido original

Trasplantados aCondiciones artificiales

Porcin celular variada

POBLACIN CELULAR PASES SUCESIVOSPROLIFERAR

LENTAMENTERPIDAMENTE

DESAPARECEPREDOMINA


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LINEASCELULARES...LINEASCELULARES...

Derivadas deun cultivo

primario, se puedencultivar in vitrorepetidamentey se dividen en :

DIPLOIDE HETEROPLOIDES

+ 75%

Mismo cariotipode las clulasSe originannormales ysiguennormales

- 75%

Mismo cariotipode las clulasSe originantejido normal oanormalCell sufrentransformaciones


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LINEA CELULARES TEJIDO DE ORIGEN VIRUS QUE PUEDEN SERAISLADOS EN CADA TIPO

CELULAR

HEp-2 Carcinoma epidermoide delaringe humana

Herpes simplex, Enterovirus,Poliovirus, Adenovirus.

MDBK Rin bovino Herpes y Adenovirus bovino,estomatitis vesicular.

MDCK Rin canino Influenza, Adenovirus

MRC-5 Pulmn embrionario humano Citomegalovirus

Vero Rin de mono Herpes y Poliovirus

BHK-21 Rin de hamster Estomatitis vesicular y feibreaftosa

HeLa Carcinoma de cervixhumano Poliovis, Adenovurus

RD Rhabdomiosarcoma humano Poliovirus, Herpes simplex

PK 15 rin porcino Estomatitis vesicular,Parvovirus porcino.

A. albopictus Larva de Aedes albopictus Arbovirus.


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MEDIOS DECULTIVO...MEDIOS DECULTIVO...

MEMMedio de

crecimientoMedio de

mantenimientoMedios

selectivosMedios de

congelacin

RequerimientoMnimo

MEM MEMTipo declulas

MEM

SSB, a.a.

vitaminas

10-15% 2% SFBPropsito del

cultivo

50% SFB

Base para losdems medios

SFBIntervalo desubcultivos

Crecimientoutilizacin

8% dimetilsulfoxido


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Factores basicos paralaFactores basicos paralasupervivenciacelular...supervivenciacelular...

Presin

osmtica

pH

CO2 Oxigeno

Agua

SSBVitaminas

A.A. Suero


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Ami ci s it mi s l s tr s c mpuest s* r te s

requeri sen l s

medi sdefinidos

li resdesuero

Ar inina istena lutamina istidina Isoleucina eucina isina etionina enilalanina Treonina Triptofano Tirosina alina

iotina olina olato icotinamid

a

antotenato iridoxal Tiamina i oflavina

aCl Cl aH

2PO

4 aHCO3 CaCl2 Cl2

lucosa

Penicilina

streptomicina

Anfotericina

ojofenol

uero fetal

ovino

Insulina Transferrina actoresde

crecimiento

especficos

Tabla1. equerimientosmolecularesdeunmediodecultivoparavirus.


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Obtencin de las clulas..Obtencin de las clulas..


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Unin acolorantes

acoplados acolorantes

fluorescentes


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MICRODISEPCIN POR CAPTURA DE

LASER


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Contenedores para cultivo celularContenedores para cultivo celular

A: Fraso T. B: Frasco triple.C: Botellas rodantes. D: Biorreactor.E: Frasco con pipetas.

F: Frascos con agitacin.


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Contaminacin delosContaminacin delos

cultivoscell...cultivoscell...La contaminacin puede tener varios origenes:Tejidos originales

Productos biolgicos (suero mycoplasma R apenicilina)El personal del laboratorio con su propia floraDel medio ambiente (laboratorio- material)


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Cuando esta presente encultivos celulares, no

siempre resulta en

alteracionesmicroscpicas de lasclulas o del medio;

muchas infecciones crecenlentamente y pueden tener

los siguientes efectos:


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Nivelesy normasdeseguridadNivelesy normasdeseguridad

Nivel1. Nopresentanpeligrosreconocidos.

Nivel2. SeempleanmaterialesdeorigenprimarioquenoseconoceelriesgodeinfeccinoquetienenlaposibilidaddequeenlasmuestrascontenganVIH, TBC,hepatitisB uotrospatgenos.

Nivel3. Sumanejopresentaunriesgopotencial.

Nivel4. Extremadamentepeligrosos.


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Contajecelular...Contajecelular...

Porcentaje de viabilidad (%) = Nmero de clulas vivas/Nmero declulas totales * 00 (>85-90% se siembra).

Nmero de clulas vivas/ml = Clulas contadas vivas x factor dedilucin x 04

Nmero de clulas necesarias = Nmero de placas x la mitad delvolumen de cada placa x clulas viables ( .350.000 para neuronas).


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Ventajas...Ventajas...


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CULTIVO DE CELULAS INFECTADA CON SARAMPION 7 DIASPOST INOCULACIN SE OBSERVAN CLULAS GIGANTES Y

MULTINUCLEADAS (40X)


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SE OBSERVAN INCITOS (AGRUPACIONESDE CLULAS) EN00X


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CLULASVERO SIN INFECTAR 48 HORAS POS INFECCION.


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CLULASVERO SIN INFECTAR, SE OBSERVA BIEN DEFINIDOEL CITOPLASMA, LOS NUCLEOS CON SUSU RESPECTIVOSNUCLEOLOS.


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CLULASVERO 24 HORAS POS INFECCION


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CELULAS DE HIGADO DE CONEJO TEIDAS CON GIMSA , 48HORAS POS INFECCION ( 00X) NORMALES.


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CLULASDE HIGADO DE CONEJO SIN INFECTAR, SEOBSERVAN LOS NUCLEOLOS Y CITOPLASMA SINAFECTAR.


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CLULAS GIGANTES POR EFECTO CITOPATICO (CULTIVO DE CELULAS DE CONEJO) CAUSADO PORVIRUS DE Herpes zoster.


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CLULASDE HIGADO DE CONEJO INFECTADAS con virusHerpes Zoster.


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INFECTADA Vs NO INFECTADA


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