CULTIVAREA BACTERIILOR

Cultivarea bacteriilor: totalitatea fenomenelor legate de creşterea şi multiplicarea bacteriilor în afara mediului lor natural (extern sau intern), prin asigurarea in vitro a unor condiţii cât mai apropiate de cele naturale, adecvate necesităţilor metabolice ale acestor microorganisme.Scop:

• identificarea agentului etiologic al unei infecţii;• determinarea farmacorezistenţei microorganismelor izolate;• preparare seruri şi vaccinuri.

Definiţii:• populaţia bacteriană: multitudinea de indivizi ai unei specii care habitează într-un

biotop;• clona bacteriană: populaţia rezultată dintr-o singură celulă prin înmulţire

vegetativă (colonie bacteriană);• tulpina bacteriană: populaţia microbiană alcătuită din descendenţii unei singure

izolări în cultură pură;• inoculare/însămânţare: punerea în contact a unei culturi bacteriene sau a unui

produs patologic cu mediile de cultură;• mediu de cultură: un complex de substanţe care permite creşterea şi multiplicarea

bacteriilor (conţine substanţe nutritive, are pH şi umiditate corespunzătoare, este steril, asigură condiţii de aero/anaerobioza) sau mediu care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice necesare creşterii şi multiplicării bacteriene;

• cultura bacteriană: totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare pe / în mediul de cultură, aglomerare de bacterii vizibilă cu ochiul liber;

• izolare: repicarea unei singure colonii pe alte medii de cultură cu scopul de a obţine cultură pură.

Clasificarea mediilor de cultură

a. după scopul utilizării:- medii uzuale - pe care se dezvoltă majoritatea germenilor patogeni aerobi şi

anaerobi;- medii speciale destinate izolării, cultivării şi cercetării însuşirilor biologice ale

anumitor specii bacteriene:- medii de izolare: cu ser, cu sânge Pasteurella pentru Corynebacterium, cu glicerină, cu cartofi, cu ou pentru Mycobacterium;- medii de îmbogăţire: conţin substanţe care stimulează dezvoltarea unor germeni patogeni: mediui hiperclorurate (tip Champan) pentru stafilococi; mediul Kauffmann-Muller pentru enterobacterii, mediul Korthoff pentru leptospire;- medii selective favorizează, prin compoziţia lor chimică, dezvoltarea anumitor germeni de interes, inhibând în acelaşi timp dezvoltarea altora, prezenţi în număr mai redus: mediul Istrati-Meiterf: E. coli, Shigella, Salmonella; mediu Lowenstein Jensen pentru micobacterii; mediul Muller Hinton pentru antibiograme;

- medii diferenţiale: permit creşterea diferenţiată a unor specii microbiene sau pun în evidenţă anumite particularităţi metabolică cu semnificaţie în diagnostic:

- fenomene proteolitice, zaharolitice, oxidoreducătoare;- diferenţierea speciilor lactozo-pozitive;- detectarea formării H2S;- producerea de indol;

- medii de transport;- medii de conservare;- medii pentru controlul sterilităţii.

b. după consistenţă:- medii lichide (repartizate în eprubete);- medii semisolide (repartizate în eprubete);

- medii solide (geloză dreaptă, înclinată, în plăci). Consistenţa mediului de cultură este dată de includerea în compoziţie a unor substanţe inerte: agar (geloză) sau gelatină.

c. după tipul respirator:- pentru germeni aerobi:- pentru germeni anaerobi.

d. după compoziţie:- naturale (care conţin substanţe nutritive în forma lor naturală fără a fi prelucrate

în prealabil: lapte, bilă, ser, cartof);- artificale [medii la care este obligatorie o prelucrare prealabilă, pornind de la

proteine animale (carne şi organe de vită, făină de peşte) sau vegetale (mazare, soia, drojdie)];

- sintetice: sunt acele medii compuse exclusiv din substanţe chimice (aminoacizi, factori de creştere, săruri);

- semisintetice: sunt acele medii care pe lângă substanţe chimice mai conţin şi proteine animale sau vegetale.

Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească mediile de cultură:- să ofere substanţele plastice şi energetice necesare fiecărui microorganism (să

conţină o sursa de N şi C, factori de creştere, săruri minerale;- să aibă un pH optim pentru specia respectivă, de obicei uşor alcalin 7,2-7,4;- să asigure, după caz, cerinţele de aerobioză sau anaerobioză;- să aibă un anumit grad de umiditate;- să fie stabil (trebuie să-şi păstreze toate calităţile iniţiale pe toată durata incubării);- să fie sterile, pentru a nu se dezvolta şi alte microorganisme, în afara celor

însămânţate;- să se păstreze ferite de contaminare, atât înainte, cât şi după folosire.

Mediile de cultură pot fi:- preparate în laborator conform unor reţete;- procurate ca medii deshidratate (rehidratate cu apă distilată, demineralizată);- procurate ca medii gata pentru utilizare, condiţionate în plăci Petri, tuburi.

Controlului de calitate:

- se efectuează pentru fiecare lot în parte:- mediile de cultură trebuie să fie sterile;- se verifică prin incubarea a 2 plăci (ex. agar-sânge) la 37°C timp de 48 de ore;- nu trebuie să apară modificări macroscopice.

Mediile de cultură sunt stocate:- pentru un timp, la adăpost de lumina solară, la +4°C, în folie de plastic închisă

ermetic;- în dulapuri, la întuneric, la temperatura camerei în cazul mediilor pentru

creştere în anaerobioză (bulion tioglicolat, alte medii).

Medii de cultură folosite în bacteriologieMediu de cultură UtilizăriMedii de bază

Geloză simplă (geloză nutritivă, conţine bulion de carne şi agar)

Mediu de cultură de uz general pentru cultivarea microorganismelor nepretenţioase: Mediul se distribuie în plăci Petri

Geloză - sânge(conţine 5% sânge defibrinat de animal)

Mediu pentru cultivarea microorganismelor pretenţioase şi nepretenţioase. Mediul se distribuie în plăci Petri

Geloză cord-creier

Pentru cultivarea germenilor pretenţioşi

Apă peptonată Mediu de cultură de uz general pentru germeni nepretenţioşi.Mediu utilizat atunci când se suspectează prezenţa Vibrio cholerae, pH 8,6-9,0. Mediul este repartizat în tuburi

Medii selectiveGeloză-chocolat Recomandat pentru cultivarea Haemophilus spp. şi Neisseria.

Mediul se toarnă în plăci PetriGeloză chocolat suplimentat cu factori de creştere

Recomandat pentru cultivarea Haemophilus spp. şi Neisseria

Geloză Thayer Martin

Mediu special pentru cultivarea neisseriilor

Geloză lactozată Pentru studierea fermentării lactozeiBaza geloză Campylobacter fără sânge (Blood free - CCDA)

Pentru realizarea unui mediu fără sânge pentru izolarea Campylobacter spp.

Baza geloză Clostridium difficile (necesită supliment)

Mediu folosit pentru realizarea unui mediu selectiv şi diferenţial în vederea izolării Clostridium difficile

Medii pentru testarea sensibilitatii antimicrobieneGeloza Mueller-Hinton II

Mediu folosit pentru testarea sensibilităţii microorganismelor la antibiotice, cu concentraţie foarte scăzută de tiamină şi timidină

(NCCLS) precum şi cu nivel corespunzător de Ca şi Mg.Geloza Mueller-Hinton cu sânge (Blood II - NCCLS)

Mediu folosit pentru testarea sensibilităţii microorganismelor la antibiotice, cu conţinut de sânge şi cu concentraţie foarte scăzută de tiamină şi timidină precum şi cu nivel corespunzător de Ca şi Mg.

Medii selective şi difernţialeMediul Chapman- Mannitol Salt Agar

Mediu selectiv pentru izolarea şi identificarea prezumptivă a speciilor de stafilococi manito-pozitive

MRSA Screen Agar

Mediu diferenţial pentru identificarea prezumptivă a stafilococului meticilino-rezistent (MRSA), este indicat pentru depistarea portajului

Mediul Levine - Eosin Methylene Blue Agar

Mediu selectiv pentru izolarea şi diferenţierea enterobacteriilor precum şi pentru identificarea E. coli

MacConkey Agar Mediu selectiv pentru izolarea şi diferenţierea enterobacteriilorMacConkey Sorbitol Agar

Mediu selectiv şi diferenţial pentru identificarea bacteriei E. coli enterohemoragică (EHEC)

Drigalski Glucose Agar

Mediu selectiv şi diferenţial pentru cultivarea şi identificarea enterobacteriilor

Drigalski Lactose Agar

Mediu selectiv şi diferenţial pentru cultivarea şi identificarea germenilor coliformi

Mediul Leifson modificat - Desoxycholate Citrate Agar

Mediu selectiv şi diferenţial pentru izolarea patogenilor enterali. Este mai selectiv decât mediul Hynes. Conţine fenilalanină care permite diferenţierea speciilor Salmonella de Proteus

Salmonella Shigella (SS) Agar

Mediu selectiv şi diferenţial pentru izolarea patogenilor enterali, în special Salmonella şi o parte din speciile Shigella. Conţine fenilalanină care permite diferenţierea speciilor Salmonella de Proteus

Brilliant Green Agar, Uman

Mediu selectiv cu verde briliant pentru izolarea speciilor de Salmonella din probele clinice

Hektoen Enteric Agar

Mediu selectiv şi diferenţial pentru izolarea patogenilor enterali, mai ales Salmonella şi o parte din speciile Shigella

XLD Agar Mediu selectiv pentru izolarea şi diferenţierea patogenilor enterali, mai ales a speciilor de Shigella

TCBS Agar Mediu selectiv pentru izolarea microorganismelor patogene din genul Vibrio

Medii pentru hemoculturăHemocultura pentru aerobiHemocultura pentru anaerobiHemocultura pentru aerobi (pediatric mini)Hemocultura pentru anaerobi (pediatric mini)Medii de transport repartizate în tuburi cu tampoane de recoltare

Amies cu cărbune(conţine agar, tioglicolat de sodiu, cărbune neutru şi o soluţie tamponată de săruri anorganice)

Mediu semisolid îmbunătăţit, recomandat pentru transportul germenilor patogeni pretenţioşi. Asigură supravieţuirea prelungită a microorganismelor între recoltare şi însămânţare, păstrează raportul dintre specii. Permite supravieţuirea microorganismelor sensibile, ex. Neisseria gonorrhoeae

Amies Mediu semisolid îmbunătăţit, recomandat pentru transportul germenilor patogeni pretenţioşi. Asigură supravieţuirea prelungită a microorganismelor între recoltare şi însămânţare, păstrează raportul dintre specii.

Cary-Blair Mediu semisolid, recomandat pentru transportul microorganismelor Gram negative şi anaerobe, păstrează raportul dintre specii

Stuart cu cărbune Mediu semisolid, recomandat pentru transportul germenilor patogeni pretenţioşi. Asigură supravieţuirea prelungită a microorganismelor, păstrează raportul dintre specii

Stuart Mediu semisolid îmbunătăţit, recomandat pentru transportul germenilor patogeni pretenţioşi. Asigură supravieţuirea prelungită a microorganismelor, păstrând raportul dintre specii

Medii de îmbogăţire repartizate în tuburiBulion selenit - cistină

Pentru realizarea mediului de îmbogăţire pentru speciile de Salmonella si unele specii de Shigella. L - cistina îmbunătăţeşte dezvoltarea salmonelelor

Trichomonas Medium

Mediu de cultură utilizat pentru cultivarea Trichomonas vaginalis

Medii pentru identificare biochimica repartizate în tuburiSIM Medium Mediu pentru diferenţierea enterobacteriilor pe baza mobilităţii

precum şi a producerii de hidrogen sulfurat şi indol (necesită reactiv Kovács)

Simmons Citrat Agar

Mediu pentru diferenţierea bacteriilor Gram negative pe baza utilizării citratului

Phenylalanine Rhamnose Agar

Mediu pentru diferenţierea enterobacteriilor pe baza dezaminării fenilalaninei şi fermentării ramnozei

Geloză uree Pentru realizarea unui mediu ce permite diferenţierea microorganismelor pe baza producerii de urează

Motility Agar Mediu pentru studiul mobilităţii enterobacteriilorIndole Motility Ornithine Agar

Mediu pentru diferenţierea enterobacteriilor pe baza producerii de indol, a mobilităţii şi a activităţii ornitin decarboxilazei

Lysine Iron Agar (LIA)

Mediu pentru diferenţierea enterobacteriilor pe baza producerii lizin-decarboxilazei şi a hidrogenului sulfurat

TSI (Triple Sugar Iron) Agar

Mediu pentru diferenţierea enterobacteriilor Gram negative pe baza fermentării zaharurilor şi a producerii de hidrogen sulfurat

Esculin Agar(ABE)BE

Mediu pentru diferenţierea bacteriilor pe baza descompunerii esculinei

Salt Bulion Mediu selectiv pentru identificarea prezumptivă a enterococilor

prin determinarea toleranţei la sareBulion uree-indol Pentru evidenţierea activităţii ureazei şi a producerii de indol

(necesită reactiv Kovács)Lowenstein-Jensen (conţine o soluţie de săruri şi amidon, soluţia de verde malachit şi omogenizat de ouă)

Mediu utilizat pentru izolarea Mycobacterium tuberculosis.Se repartizează în tuburi înclinat şi coagulat în pantă

Metode de însămânţare:Cerinţe ce trebuie respectate la însămânţare:

- să se realizeze steril; - să se evite diseminarea în mediu bacteriilor; - să s realizeze în timp scurt; - să se folosească pipete Pateur sau ansa bacteriologică;- să se folosească medii de cultură sterile solide sau lichide.

Pe medii solide:- însămânţare prin epuizare (se obţin colonii izolate);- însămânţare în sector (se obţin colonii confluente);- însămânţare prin înţepare.

Pe medii lichide- omogenizarea unei colonii în mediu lichid.

Însămânţarea prin epuizareObţinerea culturii primare:

- se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs patologic;- se descarcă ansa pe mediu de cultură:

- se însămânţează un prim sector;- se sterilizează ansa;- din primul sector însămânţat se trasează câteva striuri paralele în sensul acelor

de ceasornic;- se continuă însămânţarea prin striuri paralele, terminându-se printr-un striu în

zig-zag. În ultimul sector bacteriile sunt dispersate, astfel încât după incubare se vor forma colonii izolate.

Obţinerea culturii pure:- se replică o singură colonie din cultura primară pe un mediu de cultură proaspăt,

fie prin epuizare, fie prin însămânţare în sector.

Însămânţarea în sector:- se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs patologic;- se descarcă ansa pe mediu de cultură sub forma unui sector de cerc.

Pe o placă pot fi însămânţate mai multe specii bacteriene. Prin însămânţare în sector nu se obţin colonii izolate.

Însămânţarea pe medii în coloană înclinată:- se încarcă ansa de platină sterilizată cu produs;- se descarcă ansa pe partea înclinată a mediului de cultură sub forma unui striu. Nu

se obţin colonii izolate, bacteriile cresc sub diferite modele.

Însămânţarea prin înţepare:- se practică pentru însămânţarea mediilor solide turnate în coloană dreaptă; - se încarcă acul de inoculare cu produs;- se înţeapă mediul în direcţie verticală pe o distanţă de ¾ din înălţimea

coloanei;- se poate utiliza şi pentru conservarea culturilor pure ale unor tulpini

considerate importante, a tulpinilor de colecţie, a tulpinilor de referinţă, pentru însămânţarea unor medii multitest (TSI, MIU);

- se preferă utilizarea unei anse-fir sau a unei anse cu o buclă foarte mică;- se utilizează tuburi (eprubete) de dimensiuni diferite şi o cantitate diferită de mediu.

Pentru cultivare pe mediul TSI:- se utilizează tuburi de dimensiuni mici (3 ml mediu pentru un tubuşor);- se însămânţează „partea dreaptă" prin înţepare, fără a se atinge baza tubului;- se însămânţează apoi „partea înclinată" prin realizarea unor striuri în zig-zag,

atingând suprafaţa mediului.

Însămânţarea în medii lichideTehnica însămânţării cu ansa bacteriologică:

- se introduce ansa cu firul înroşit în flacără în recipientul ce conţine produsul patologic;

- se răceşte alipind ansa de peretele recipientului;- se recoltează o porţiune din produs; - se scoate dopul recipientului cu mediu;- se flambează gura acestuia;- se descarcă materialul luat pe bucla ansei din prelevat în mediul din recipientul

deschis sub protecţia flăcării pe peretele recipientului;- se agită uşor lichidul;- se flambează din nou gura recipientului şi dopul cu care apoi se astupă recipientul;după însămânţare, ansa se sterilizează din nou prin încălzire la roşu.

Tehnica însămânţării cu pipeta:- se scoate pipeta gradată din ambalajul steril;- se introduce rapid în flacără atât capătul cât şi toată lungimea ei;- se controlează apoi răcirea ei prin flambare;

- dacă se lucrează cu pipeta Pasteur, se rupe vârful efilat al pipetei, după care se flambează capătul;

- pipeta flambată şi răcită se introduce în recipientul cu produsul prelevat;- se aspiră de la câteva picături până la 1 sau mai mulţi ml, în raport cu materialul de

însămânţat şi cantitatea de mediu de cultura;- pipeta se manipulează cu grijă pentru a nu uda dopul de vată;- se însămânţează materialul aspirat în pipetă în recipientul cu mediu nutritiv;- după însămânţare se flambează gâtul recipientului şi dopul;- pipeta folosită se pune într-un pahar cu amestec sulfo-cromic, aspirându-se din

amestec până la aproximativ 1 cm sub dop;- tampoanele care au servit la recoltarea produselor patologice vor fi descărcate direct

în mediu, după care vor fi introduse în tub şi puse în găleata de infecte.În funcţie de specie, bacteriile cresc difuz în tot volumul mediului la suprafaţă sau la fundul eprubetei.

Identificarea bacteriilor pe baza caracterelor de cultură, biochimice şi de metabolism

Pe baza caracterelor de culturăÎn acest caz se studiază aspectul macroscopic al coloniilor bacteriene izolate:a. colonii de tip S (smooth - netede):

- rotunde;- bombate cu margini circulare, regulate;- translucide cu suprafaţa netedă;- uşor detaşabile de pe mediu;- suspensionate în ser fiziologic produc suspensii omogene;- produc tulburare în mediu lichid; - germenii capsulaţi păstrează capsula;- virulenţa este conservată.

Tipul de colonie S reprezintă forma normală pentru majoritatea bacteriilor patogene (S. aureus, S. pyogenes, E. coli), fiind dotată cu calităţi optime de structură antigenică şi de patogenitate;b. colonii de tip R (rough - rugos, aspru, grunjos):

- colonii cu margini neregulate;- plate, uscate;- cu suprafaţa zbârcită;- aderente la mediu;

- aglutinează spontan în ser fiziologic;- structura antigenică nu este caracteristică;- nu păstrează capsula;- în mediu lichid produce depozit cu supernatant clar. Tipul R de colonie este

caracteristic, în general, bacteriilor nepatogene, cu 3 excepţii: Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphtheriae;c. forme intermediare: S-R, R-S;d. colonii de tip M:

- cu aspect mucos;- foarte mari;- foarte bombate;- foarte lucioase;- cu tendinţă de curgere şi de confluare.

Tipul M de colonii este caracteristic bacteriilor care posedă capsulă (Klebsiella);e. fenomen de căţărare (invazie, migrare, roire):Pe medii simple, creşterea se exprimă într-un strat continuu, sub forma unor valuri succesive, fenomen caracteristic pentru Proteus spp.Bacillus anthracis produce colonii în "cap de meduză"/"coamă de leu" (mari, alb-cenuşii, de tip "R", la periferia coloniei, se pot observa prelungiri ondulate).Exemple de creştere pe medii de cultură lichide:

- mediul este tulburat omogen (Staphylococcus spp.)- mediul este clar, cu depozit grunjos pe pereţi şi la baza tubului (S. pyogenes)- mediul este clar, cu văl la suprafaţă (V. cholerae în apă peptonată alcalină)- dezvoltarea culturii se realizează ca un "inel" aderent de pereţii tubului, la

suprafaţa mediului (E. coli)- mediul este clar cu dezvoltarea unei membrane uscate, la suprafaţă (Bacillus

subtilis)- mediul este clar cu apariţia unui depozit floconos aderent la baza tubului (B.

anthracis)- mediul este clar, iar la suprafaţă se dezvoltă o membrană groasă, plisată (M.

tuberculosis).

Pe baza caracterelor biochimice şi de metabolism În acest caz se studiază metabolismul bacterian şi prezenţa diferitelor enzime specifice.Studierea caracterelor biochimice şi de metabolism permit încadrarea bacteriilor în specie.

a. Metabolismul glucidic- se studiază pe medii de cultură diferenţiale sau selectiv-diferenţiale;- urmăreşte descompunerea diferitelor zaharuri de către bacterii (glucoză, lactoză,

zaharoză, manitol);- prin descompunerea zahărului de către bacterii mediul se acidifică, iar indicatorulschimbă culoarea mediului de cultură.

b. Metabolismul proteic:- se studiază pe medii de cultură diferenţiale;- prin descompunerea proteinelor de către bacterii se eliberează metaboliţi precum

indol, H2S sau amoniac;- indolul şi H2S se evidenţiază cu ajutorul unor hârtii de filtru îmbibate în reactivspecific (reactiv Kovacs pentru indol şi săruri de Pb pentru H2S);- prezenţa amoniacului se evidenţiază cu ajutorul unui indicator de culoare.

c. Enzimele bacteriene hemolizinele:

- enzime care lizează hematiile (alterează hemoglobina);- prezenţa acestei enzime se evidenţiază pe mediu geloză - sânge;- principalele tipuri de hemoliză:

- alfa (α) - apare ca o zonă verzuie în jurul coloniei;- beta (β) - sângele este descompus total, în jurul coloniei este o zonă clară,

transparentă. α-Hemolizina sintetizată de Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae) produce liza incompletă a hematiilor, culoare verzuie; ß-hemolizina sintetizată de Streptococcus pyogenes, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes produce liza completă a hematiilor, zona de hemoliza este clară; y-hemolizina produsă de

Staphylococcus spp. lizează hematiile, dar nu produce zone de hemoliza pe agar-sânge (la streptococi, "y-hemoliza" indică absenţa hemolizei). catalaza (Staphylococcus spp):

- descompune apa oxigenată în apă şi oxigen;- oxigenul eliberat se evidenţiază prin formarea bulelor de gaz;

coagulaza:- determină coagularea plasmei recoltate pe anticoagulant;

oxidaza (N. meningitidis, N. gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, V. cholerae):- enzime oxidative;- acţionează asupra unor substanţe producând compuşi coloraţi.

gelatinaza (Clostridium perfringens):- lichefiază gelatina;

lecitinaza (Bacillus anthracis, Clostridium spp.); nitrat-reductaza (Mycobacterium spp.); Alte caractere metabolic:

- toleranţa la un anumit pH (V. cholerae se multiplică la pH alcalin);- toleranţa la o anumită concentraţie de NaCl (Staphylococcus aureus);

sensibilitatea la optochin (S. pneumoniae) sau la bacitracină (S. Pyogenes).d. Alte testeMobilitatea:

- bacteriile flagelate sunt mobile şi migrează într-un mediu de cultură semisolid, deviază de la locul de inoculare (traiectul de înţepătură).Mirosul:

- la multe specii, coloniile au miros caracteristic:Producerea de pigment:

- pigmenţi nedifuzibili - nu difuzează în mediu, vor colora doar colonia (Staphylococcus aureus - pigment auriu);

- pigmenţi difuzibili - difuzează în mediu, colorează şi mediul (Pseudomonas - pigment verde).

Teste de identificare

Testul sensibilităţii la bacitracină Principiu: Bacitracina (antibiotic sintetizat de Bacillus licheniformis) inhibă

multiplicarea streptococilor de grup A. Mai puţin de 1% din tulpinile de Streptococcus pyogenes rezistă la acţiunea bacitracinei.

Materiale necesare:

- colonii P-hemolitice izolate pe geloză - sânge;microcomprimate de bacitracină cu 0,04 U şi cu 0,1 U.

Tehnica de lucru: - se prelevează 3-4 colonii P-hemolitice;- se însămânţează omogen pe 1/2 de placă Petri cu geloză-sânge.;- se plasează în centrul ariei însămânţate un microcomprimat cu bacitracină;se incubează pentru 18-24 ore la 35-37°C.

Interpretare: Test pozitiv: - când se constată inhibarea creşterii bacteriene în jurul

microcomprimatului cu 0,04 U bacitracină (indiferent de diametru);- când se constată o inhibare a creşterii bacteriene în jurul microcomprimatului cu 0,1 U bacitracină cu diametrul>11 mm.

Control de calitatea:

Martor pozitiv: Streptococcus pyogenesMartor negativ: Streptococcus agalactiae.

Testul bilolizei (Neufeld)Principiu: Pneumococii (Streptococcus pneumoniae) capsulaţi sunt lizaţi în

prezenţa bilei sau a sărurilor biliare prin activarea unei enzime autolitice.

Materiale necesare:

- colonii ct-hemolitice izolate;- soluţie de dezoxicolat de sodiu 10%;- soluţie izotonică;- apă distilată.

Tehnica de lucru: - se prepară în soluţie salină fiziologică o suspensie de colonii ct-hemolitice izolate;- se repartizează în 2 eprubete de sticlă câte o,5 ml suspensie;- se adaugă în prima eprubetă 0,5 ml dezoxicolat de sodiu;- se adaugă în a doua eprubetă 0,5 ml apă distilată- se incubează probele 2 ore la 35-37oC.

Interpretare: Testul este pozitiv (bacterii lizate - pneumococi): - dacă suspensia din eprubeta în care s-a adăugat dezoxicolat s-a clarificat şi nu s-a clarificat în cealaltă eprubetă;Testul este negativ: dacă ambele tuburi au rămas opace.

Controlul calităţii:

Martor pozitiv - Streptococcus pneumoniaeMartor negativ - Streptococcus viridans.

Testul producerii de catalazăPrincipii: Se testează capacitatea bacteriilor de a elibera oxigen din peroxidul

de hidrogen (H2O2) prin acţiunea catalazei.Materiale necesare:

- colonii dezvoltate şi izolate pe medii fără sânge;- soluţie de peroxid de hidrogen 3%;- apă distilată.

Tehnica de lucru: - se realizează o suspensie bacteriană densă în 1-2 ml apă distilată;- se adaugă 1-2 picături de peroxid de hidrogen 3%;- se observă imediat şi după 5 minute apariţia bulelor de oxigen.

Interpretare: Test pozitiv: apariţia bulelor de gaz, bacteria sintetizează catalază;Test negativ: absenţa bulelor de gaz, bacteria nu sintetizează catalază.

Control de calitate:

Martor pozitiv - Staphylococcus aureus;Martor negativ - Streptococcus pyogenes.

Testul coagulazeiPrincipiu: Stafilococii coagulazo-pozitivi (Staphylococcus aureus) produc o

enzimă care activează coagularea plasmei. Există 2 tipuri de coagulază: coagulaza liberă şi coagulaza legată de peretele celular (“dumping factor“). Coagulaza liberă şi legată convertesc fibrinogenul din plasmă la fibrină cu formarea unui coagul.

Materiale - colonii izolate pe mediu neselectiv ale tulpinii care urmează să fie

necesare testată;- plasmă de iepure;- lame;- tuburi.

Tehnica de lucru:Testul coagulazei pe lamă - coagulaza legată

- se depune pe lamă o picătură de apă distilată; - se suspensionează şi omogenizează 1-2 colonii în picătura de apă

distilată (tulbure omogen);- se aşteaptă 10 secunde;- se urmăreşte apariţia eventualelor autoaglutinări;- dacă apare fenomenul de autoaglutinare se trece la efectuarea

testului coagulării în tub; - dacă picătura se menţine tulbure omogen se adaugă 1 picătură de

plasmă; se urmăreşte apariţia “coagulilor” timp de 10-15 secundeInterpretare: Test pozitiv: apariţia “coagulilor“ în 10-15 secunde;

Test negativ: absenţa “coagulilor“ (5% din Staphylococcus aureus dau reacţii fals negative).

Testul coagulazei în tub - coagulaza liberă

- se pipetează 0,5 ml de plasmă într-un tub steril;- se prelevează o colonie care se descarcă în plasma din tub;- se incubează tubul timp de 4 ore la 35-37°C;- se recomandă examinarea, prin înclinarea tubului, din 30 în 30 de minute, în primele 4 ore;- dacă reacţia este negativă la 4 ore, se reincubează tubul până la 24 ore.

Interpretare: Test pozitiv: formarea unui coagulului;Test negativ: absenţa coagulului.

Control de calitate:

Martor pozitiv - Staphylococcus aureusMartor negativ - Staphylococcus epidermidis

Medial multitest MIU (mobilitate indol uree)Principiu: MIU conţine uree, triptofan, roşu fenol (indicator de pH) şi este

condiţionat în tuburi de dimensiuni mici. Geloza moale permite mobilitatea microorganismului însămânţat; hidroliza ureei va duce la alcalinizare mediului (culoarea virează de la galben la roşu); producerea de indol din triptofan va fi indicată de înroşirea reactivului Ehrlich.

Materiale necesare:

- tuburi cu mediul MIU;- hârtiuţe indicator cu reactiv Ehrlich;- colonii izolate de identificat;- ansă fir.

Tehnica de lucru: - se prelevează probă pentru însămânţare din colonia, izolată pe mediu neselectiv, cu ajutorul ansei fir;- se însămânţează mediul prin înţepare astfel încât să se realizeze o însămânţare în “linie dreaptă“ - se fixează de dop hârtiuţa indicator în aşa fel încât să ajungă deasupra coloanei de mediu, fără ca acesta să fie atins;- se incubează la 35-37°C, timp de 24 ore;- se reincubează tubul până la 48 de ore dacă nu s-a constatat

virarea culorii mediului.Interpretare: Mobilitatea:

- bacterie imobilă - dacă opacifierea apare numai pe traiectul de însămânţare;- bacterie imobilă - dacă opacifierea este uniformă în coloana de

mediu.Urează:- bacterie urează negativă - dacă culoarea coloanei rămâne

galbenă;- bacteria urează pozitivă - dacă culoarea devine roşie;- apariţia unui inel de culoare roşie la suprafaţa mediului nu semnifică un test pozitiv.Indol:

- bacterie indol pozitivă - dacă apare schimbarea culorii hârtiei la roşu-violet;- bacterie indol negativă, dacă hârtia rămâne albă.

Control de calitate:

Martor pozitiv - Proteus mirabilis: M+, U+, 1+;Martor negativ - Shigella spp.: M-, U-, I-.

Mediul multitest TSI (triple sugar iron - trei glucide şi fier )Principiu: Examinarea concomitentă a mai multe teste de identificare a

bacteriilor pe un singur mediu de cultură.Materiale necesare:

- tuburi de dimensiuni mici cu mediul TSI de culoare roşu deschis [mediul TSI conţine glucoză (1/10 din cantitatea celorlalte zaharuri), lactoză şi zaharoză, citrat feric şi un indicator de pH (roşu neutru)]. Mediul se solidifică în poziţie înclinată astfel încât să rămână în partea inferioară a tubului o porţiune de mediu neînclinată de 1-2 cm. Partea dreaptă (coloana) nu vine în contact cu aerul şi oferă condiţii relative de anaerobioză; partea înclinată (panta) oferă condiţii de multiplicare în aerobioză;- colonii izolate de identificat;- ansa fir.

Tehnica de lucru: - se prelevează probă din colonia izolată pe mediu neselectiv cu ajutorul ansei fir; - se însămânţează coloana prin înţepare;- se retrage ansa şi se însămânţează partea înclinată prin striuri paralele (sau în zig-zag); - se incubează tubul la 35-37oC, timp de 24 ore.

Interpretare: - fermentarea glucozei este pozitivă dacă în porţiunea dreaptă culoarea virează la galben;- dacă culoarea coloanei rămâne roşie, glucoza nu este fermentată (şi nu este o enterobacterie);- dacă fermentarea a avut loc cu producere de gaze, bulele sunt vizibile;- fermentarea lactozei/zaharozei este considerată pozitivă dacă în porţiunea înclinată culoarea virează la galben; - producerea de hidrogen sulfurat este pozitivă dacă între porţiunea

dreaptă şi cea înclinată se înnegreşte zona. Control de

calitate:Martor pentru pH acid la nivelul coloanei şi pantei, fără producere de fbS - E. coli;Martor pentru pH acid la nivelul coloanei, pH neutru la nivelul pantei şi producere de H2S - Salmonella typhimurium

Testul producerii de citocrom oxidazaPrincipiu: Unele bacterii produc citocrom oxidază, enzimă care lipseşte la

bacteriile strict anaerobe. Aceasta acţionează asupra tetra-metil p-fenilendiaminei cu formarea unui compus de culoare purpurie. Sunt oxidazo-pozitive bacteriile: Vibrio spp., majoritatea speciilor de Pseudomonas, Alcaligenes spp, Neisseria spp. (dintre germenii Gram negativi) şi Micrococcus spp. (dintre germenii Gram pozitivi).

Materiale necesare:

- soluţie apoasă de tetra-metil p-fenilendiamină 1% conservată în sticlă de culoare brună la frigider sau fâşii de hârtie indicator impregnate în reactiv; - hârtie de filtru;- ansă cu fir de platină sau pipetă Pasteur (cudată);- colonii izolate dezvoltate pe agar-sânge, agar-chocolat sau agar Mueller Hinton.

Tehnica de lucru: - se prelevează cu un tampon steril 2-3 colonii;- se realizează o însămânţare pe jumătatea unei plăci cu agar-sânge, în aşa fel încât să rezulte o cultură confluentă,- se plasează un disc cu optochin în centrul zonei însămânţate; - se presează uşor pentru ca discul să adere uniform;- se incubează timp de 18-24 ore la 35-37°C în atmosferă de 5% CO2.

Interpretare: Test pozitiv: apariţia unei zone de culoare purpurie în 10 secunde;Test negativ: absenţa culorii purpurie.Apariţia zonei colorate mai târziu nu permite interpretarea testului (posibile rezultatul este negativ).

Control de calitate:

Martor pozitiv - Pseudomonas aeruginosa;Martor negativ - Escherichia coli.

Testul sensibilităţii la optochin (ethyl hydrocuprein hydrocloride)Principiu: Testul optochin ajută la diagnostic prin diferenţierea pneumococilor

de Streptococcus viridans. Optochin este inhibitor pentru dezvoltarea pneumococilor (Streptococcus pneumoniae) chiar la concentraţii < 5 μg/ml de optochin, pe când alţi streptococi se dezvoltă bine sau prezintă o zonă mai slabă de inhibare.

Materiale necesare:

- discuri cu optochin (5 μg/disc), cu diametrul de 6 milimetri; - plăci cu agar-sânge; - tampoane sterile; - colonii α-hemolitice izolate, care urmează a fi testate.

Tehnica de lucru: - se Prelevează cu un tampon steril 2-3 colonii;- se realizează o însămânţare pe jumătatea unei plăci cu agar-sânge, în aşa fel încât să rezulte o cultură confluentă;

- se plasează un disc cu optochin în centrul zonei însămânţate;- se presează uşor pentru ca discul să adere uniform,- se Incubează timp de 18-24 ore la 35-37°C în atmosferă de 5% CO2.

Interpretare: Test pozitiv: apariţia unei zone de inhibiţie cu diametrul mai mare de 14 mm,Test negativ: absenţa inhibiţiei în jurul discului semnifică un test negativ.

Control de calitate:

Martor pozitiv - Streptococcus pneumoniae;Martor negativ - Streptococcus viridans.

Testarea sensibilităţii/rezistenţei la antibiotice şi chimioterapice

Testarea sensibilităţii la medicamentele antimicrobiene este strict necesară datorită apariţiei şi extinderii rezistenţei microorganismelor la aceste medicamente. Se aplică:

a. metode de testare a sensibilităţii in vitro;b.metode de testare a sensibilităţii in vivo, care ţin cont de relaţia agent terapeutic-

infecţie.•

Metode de testare a sensibilităţii in vitroAntibiograma reprezintă metoda de laborator prin care se apreciază, sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltaţi de la bolnavii cu infecţii bacteriene, după cultivare pe medii speciale (agar Mueller-Hinton). Pentru testare trebuie să folosim culturi pure.Principiul metodei: O cantitate de substanţă antimicrobiană este depusă pe suprafaţă unui mediu de cultura agarizat, preînsămânţat cu bacteria testată. Concomitent se produc doua fenomene: difuzarea substanţei antimicrobiene şi creşterea bacteriei. În zonele în care substanţa antimicrobiană realizează concentraţii mai mari decât concentraţia minimă inhibitoare, bacteria nu creşte.Antibiograma este utilă în:

- instituirea unui tratament ţintit de către medicul clinician;- evidenţierea acelor tulpini ce posedă enzime capabile să inactiveze acţiunea

antibioticului in vivo;- supravegherea epidemiologică a rezistenţei bacteriene;- compararea fenotipurilor de rezistenţă a tulpinilor responsabile de infecţii

nosocomiale.Se pot folosi:• Tehnici calitative:

- antibiograma difuzimetrică comună;- antibiograma difuzimetrică comparativă;- antibiograma difuzimetrică standardizată;

• Tehnici cantitative:- metoda diluţiilor în mediu lichid;- metoda diluţiilor în agar, metoda microdiluţiilor în agar;- metoda „punctelor de ruptură”- testul „E”;- metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare.

Antibiograma difuzimetrică comună:- germenul de testat se însămânţează pe mediul solid (agar Mueller-Hinton) turnat

în plăci Petri prin „inundarea” plăcii, urmată de aspirarea (aseptic) excesului de inocul;- se aplică după circa 20 minut microcomprimatele în care sunt încorporate

antibiotice cu ajutorul unei pensete sau a unui aplicator „automat” la distanţe de minim 30 mm între ele şi la 15 mm de marginea plăcii. Se aplică 5 antibiotice diferite pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm. Microcomprimatele trebuie să vină în contact perfect cu mediul, de aceea trebuie presate uşor;

- după încă 20 minute, plăcile se incubează peste noapte în termostat, la 35-37°C pentru majoritatea bacteriilor. Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în mediu şi realizează zone de inhibiţie în care coloniile microbiene nu se dezvoltă (dacă populaţia bacteriană este sensibilă). Cu cât diametrul zonei de inhibiţie este mai mare, cu atât germenul va fi considerat mai sensibil. Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (indiferent de valoarea diametrului) se dezvoltă colonii („mutanţi rezistenţi”), germenul va fi considerat rezistent.Antibiograma difuzimetrică comună este o tehnică nestandardizată care permite de fapt numai eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor foarte active.

Antibiograma difuzimetrică comparativă (Stokes, Balş):- se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de

referinţă, din aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). Pentru cocii gram pozitivi se alege pentru comparaţie o tulpină de Staphylococcus spp. care are o sensibilitate cunoscută la antibioticele utilizate (CMI cunoscut; CMI reprezintă cea mai mică concentraţie de agent antimicrobian, în mg/ml, cu acţiune bacteriostatică asupra germenului testat);

- pe o placă de formă pătrată („împărţită” în 3 zone egale) se inoculează în treimea medie microorganismul de referinţă iar în treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru a fi testate. Inoculul trebuie să fie astfel realizat încât să conducă la apariţia după incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care să nu fie confluente;

- se plasează microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaţie dintre culturi;

- se incubează peste noapte la 35-37°C.Rezultatele se exprimă cu termenii: sensibil, intermediar, rezistent, în funcţie de

diametrul zonelor de inhibiţie a multiplicării celor doi germeni, faţă de acelaşi antibiotic (jumătăţile de cerc se examinează comparativ). Poate fi apreciat şi CMI.

Antibiograma difuzimetrică standardizată (Kirby-Bauer):- se procedează ca în cazul Antibiogramei difuzimetrică comună;- metoda este standardizată şi recunoscută pe plan internaţional;- rezultatele între laboratoare sunt reproductibile şi corelabile.

Elementele necesare standardizării sunt:• mediul de cultură (agar Mueller-Hinton), cu elemente minerale „specifice”

testării unor anumite microorganisme (Mg2+ şi Ca2+, Pseudomonas aeruginosa, pentru sensibilitatea la aminoglicozide); pH-ul mediului (frecvent între 7,2-7,4); cu suplimente

nutritive procurate comercial; grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm;• inoculul trebuie să aibă o turbiditate corespunzătoare standardului 0,5

McFarland (circa 10 unităţi formatoare de colonii/ml) în multe dintre cazuri;• timpul de incubare, atmosfera de incubare;• concentraţia substanţelor din microcomprimate şi dimensiunea acestora (6 mm

diametru);• alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;• utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate;• interpretarea rezultatelor (rezultatul obţinut se compară cu rezultatele din tabele.

Nu permite aprecierea CMI sau CMB (concentraţia minimă bactericidă).

Metoda diluţiilor în mediu lichid:- oferă informaţii cu privire la CMI pentru fiecare antibiotic studiat;- pentru fiecare antibiotic testat se utilizează mai multe tuburi cu bulion Mueller-

Hinton în concentraţii descrescătoare (diluţii binare) de la 64 μg/ml până la 0,125 μg/ml, în total 9 tuburi, plus 2 tuburi martor;

- în final, se adaugă în fiecare tub câte 1 ml de antibiotic;- se prepară inoculul standardizat turbidimetric; - se inoculează toate cele 11 tuburi, cu câte 1 ml de inocul;- se agită pentru omogenizare;- se incubează cele 9 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-

37°C, al doilea tub martor se păstrează la frigider;- pentru controlul de calitate se utiliză şi un şir de tuburi care sunt inoculate cu o

tulpină de referinţă corespunzătoare;- rezultatul se citeşte în ziua următoare şi se interpretează. Concentraţia finală de

antibiotic se va înjumătăţi (în tubul în care diluţia iniţială a fost de 64pg/ml, diluţia finală va fi 32 pg/ml). În tubul martor menţinut la +4°C nu trebuie să existe creştere, în timp ce în tubul martor la 35-37°C creşterea trebuie să fie evidentă. În tuburile inoculate cu tulpina de referinţă trebuie să avem rezultatele corespunzătoare datelor oferite de producător. În tuburile test, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea microorganismului este CMI. Se consideră (cu diferenţe între specii diferite) că microorganismele în cazul cărora CMI este < 2 pg/ml pot fi eficient inhibate de către antibioticul respectiv şi in vivo.

Determinarea CMB (concentraţia minimă bactericidă):- se cunoaşte rezultatul CMI;- se foloseşte ca sursă de inocul tuburile în care dezvoltarea microbiană a fost

inhibată; - se împarte o placă Petri (agar Mueller-Hinton) în sectoare (4 sectoare dacă

inhibiţia a avut loc în ultimele 4 tuburi);- se însămânţează (aseptic) din fiecare tub fără creştere microbiană, în sectorul de

placă corespunzător;- se incubează 16-18 ore la 35-37°C;- CMB corespunde ultimei concentraţii de antibiotic care a distrus

microorganismele însămânţate (sectoare de placă fără apariţia culturii);

- se consideră că antibioticul va fi eficient in vivo dacă în serul pacientului se pot atinge concentraţii de antibiotic care să depăşească de 4-8 ori CMB;

Determinarea CMI şi CMB se face:- pentru aprecierea eficacităţii antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini

bacteriene;- în tratamentul infecţiilor severe (endocardite, meningite, septicemii);- pentru imunodeprimaţi, la care efectuarea acestei metode este indispensabilă.

Determinarea CMI prin testul E (Etest)Testul E reprezintă o metodă cantitativă de testare in vitro care permite

determinarea valorii CMI. Principiu:Tehnica de lucru: - se scot plăcile cu mediu de cultură şi benzile Etest din

congelator; - se menţin la temperatura camerei pentru echilibrare termică, timp de 20 minute;- se scot benzile din folie cu ajutorul unei pensete şi se pun în plăci Petri sterile;- benzile nefolosite se conservă în tuburi, împreună cu o substanţă desicantă;- tuburile se păstrează la -20°C;- după obţinerea inoculului standard şi după ce se verifică dacă mediul de cultură nu mai prezintă condens, se transferă inoculul pe mediu (cu un tampon) având grijă să fie acoperită complet suprafaţa mediului;- se lăsă placa timp de circa 10 minute, înainte de a aplica benzile Etest;- se ia cu grijă o bandă şi se aplică pe suprafaţa mediului de cultură, cu capătul ce conţine concentraţia cea mai mare aproape de marginea plăcii (pot fi aplicate 2 benzi Etest într-o placă de 90 mm şi maxim 6 benzi dacă se lucrează cu plăci cu diametrul de 150 mm);- banda trebuie să fie în contact perfect cu suprafaţa mediului. Dacă banda a fost aplicată greşit, aceasta nu trebuie deplasată în altă poziţie, deoarece eliberarea medicamentului are loc imediat, la fel ca şi în cazul microcomprimatelor de la antibiogramă; - se incubează la 35-37°C, timp de 16-18 ore.

Interpretarea rezultatelor:

- rezultatul se citeşte atunci când cultura este confluentă sau aproape confluentă; - valoarea CMI corespunde liniuţei în care creşterea bacteriană intersectează banda Etest; - pe geloză - sânge se citeşte zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie a hemolizei;- dacă nu apare nici o zonă de inhibiţie se raportează valoarea CMI ca fiind mai mare decât cea mai mare

concentraţie notată pe bandă; - dacă zona de inhibiţie nu intersectează banda, valoarea CMI este mai mică decât concentraţia cea mai scăzută menţionată pe bandă;- se raportează rezultatul obţinut pentru tulpina studiată după ce se verifică rezultatul obţinut pentru tulpina de referinţă (control de calitate).

Metode de testare a sensibilităţii in vivo şi aprecierea eficientei terapeutice- determinarea NEI (nivel de eficienţă inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte umori;- determinarea NEB (nivel de eficienţă bactericidă) pentru ser, LCR sau alte umori

(capacitatea diluţiilor din serul unui bolnav tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul conţinând germenul infectant);

- determinarea nivelul de antibiotic realizat în sânge, LCR sau în alte umori.

Metode serologice

Reacţia dintre antigen (Ag) şi anticorp (Ac) necesită interacţiunea epitopului (de pe Ag) cu paratopul Ac. Factorii care condiţionează interacţiunea Ag-Ac sunt:

- complementaritatea structurală (reacţia este specifică);- complementaritatea electrochimică, consecinţă a complementarităţii structurale

(intră în acţiune forţe intermoleculare, necovalente, precum legăturile de hidrogen, forţele electrostatice, legăturile van der Waals şi legăturile hidrofobe). Cu cât energia de legare a reactanţilor este mai mare, cu atât complexele Ag-Ac sunt mai stabile.

Interacţiunea dintre epitop şi paratop este definită de 2 parametri:• Afinitatea (măsoară forţa de legare dintre epitop şi paratop): o interacţiune cu afinitate înaltă presupune structuri complementare perfecte, în timp ce complementaritatea imperfectă a grupărilor reactante determină o afinitate scăzută, deoarece forţele de atracţie sunt active numai pe distanţe foarte mici şi sunt diminuate de forţele de respingere;• Aviditatea (rezultă din multivalenţa Ag): cele mai multe Ag posedă mai mult decât un epitop, energia totală de legare a epitopilor multipli ai unui Ag, cu paratopii specifici este mult superioară în comparaţie cu energia separată a fiecărei interacţiuni dintre epitop şi paratop; complexele Ag-Ac formate de antigenele multivalente sunt stabile, disocierea lor fiind dificilă, deoarece este necesară ruperea tuturor legăturilor existente.Există, totuşi, şi reacţii încrucişate datorită faptului că anumite Ag posedă anumiţi epitopi comuni (serul imun anti-Escherichia coli aglutinează eritrocitele umane de grup B).Etape reacţiilor antigen-anticor sunt:

• interacţiunea primară dependentă de cantitatea şi afinitatea Ac; poate fi pusă în evidenţă doar prin nefelometrie (nu în diagnosticul obişnuit) deoarece complexele Ag-Ac sunt de dimensiuni mici, solubile şi se pot desface uşor;

• interacţiunile secundare apar după 30 de minute. Ag poate avea mai mulţi epitopi iar Ac are minim 2 paratopi; complexele primare se reunesc, formează complexe

secundare şi respectiv un complex Ag-Ac ca o reţea tridimensională, insolubil, care devine vizibil.

Reacţia de precipitarePrincipiu: prin punerea în contact a unei antigene (sub formă solubilă, macromoleculară) cu anticorpul corespunzător, se formează complexe imune antigen - anticorp, care precipită în momentul în care componentele se află într-o anumită proporţie.În reacţiile de precipitare, antigenele sau anticorpii se pot utiliza ca atare sau marcaţi (fluorocromi, enzime, izotopi). Reacţiile de precipitare pot avea loc în mediu lichid sau în mediu solid (reacţii de difuzie).Formarea precipitatului imun depinde de o serie de variabile:

- masa moleculară, numărul determinanţilor antigenici şi concentraţia antigenului;- tipul, heterogenitatea, aviditatea şi concentratia anticorpului;- temperatura, pH, volumul de reacţie.

Compoziţia precipitatului imun şi proporţia de combinare a antigenului cu anticorpii variază în funcţie de zona în care a avut loc precipitarea: exces de antigen, echivalenţă sau exces de anticorp.Reacţia de precipitare este foarte sensibilă şi specifică, în ceea ce priveste decelarea antigenului (reacţia evidenţiază cantităţi foarte mici de antigen, acesta participând la formarea agregatelor, în cantităţi mult mai mici decât anticorpii).

Reacţii de precipitare:1. Mediu lichid:

precipitare în amestec (floculare): metoda Ramon; precipitare în inel: reacţia Uhlenhuth şi reacţia Ascoli; precipitarea în tub capilar: decelarea proteinei C reactive; pe lama: test Ferreira:

2. Mediu solid: difuzie simplă: unidimensională (metoda Oudin) şi bidimensională (metoda

Mancini- Carbonara- Heremans); difuzie dublă: unidimensională (Oakley - Fulthorpe) şi bidimensională:

radială (Ouchterloni) şi lineară: în unghi de 90º (Elek); difuzie combinată cu migrare în câmp electric:

- imunelectroforeza;- contraimunelectroforeza,- electroimunodifuzia.

Aplicabilitate în domeniul imunologiei:- studierea unor antigene de provenienţă bacteriană (toxine, componente proteice

sau polizaharidice bacteriene);- antigene virale (antigen HBs);- evidenţierea unor antigene (proteine patologice) în serul bolnavilor, cu afecţiuni

inflamatorii (proteina C reactivă), neoplazice (alfa feto proteina).

Reacţia de precipitare în mediu lichid:1. Reactia de precipitare în amestec (R. de floculare): Metoda Ramon:

- se pun în contact, în amestec, cantităţi fixe de antigen cu cantităţi variabile de anticorp;

- metoda se aplică în scopul stabilirii puterii antigenice a unei toxine (titrul), utilizând cantităţi variabile de anticorp cu titrul cunoscut;

- din serul antidifteric (anticorpi), cu titrul cunoscut (100 UA/mL), se fac diluţii succesive în ser fiziologic steril, în volum de 1 mL;

- peste aceste diluţii se adauga toxina difterică, în cantitate fixă: 1 mL;Exemplu: Stabilirea titrului toxinei difterice, pentru obţinerea de seruri imune/antidifterice, în tratamentul difteriei.Metoda de lucru: titrarea toxinei difterice:

Tub 1 Tub 2 Tub 3 Tub 4 Tub 5 Tub 6Ser antidifteric100 UA/mL

0,1 mL 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

NaCl 8,5% 0,9 mL 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4Toxina difterică de titrat 1 mL 1 1 1 1 1- se folosesc pipete diferite pentru fiecare reactant;- se agită eprubetele şi se introduc în baie de apă la 52°C;- se urmăreşte reacţia la fiecare 3 min pentru a prinde momentul pozitivării ei: prima

eprubetă unde a aparut reacţia de floculare: unirea unor cantităţi echivalente de antigen şi anticorp;

- dacă flocularea a apărut în tubul nr. 4, amestecul de reacţie conţine 0,4 mL ser antidifteric, adică 40 UA (unităţi antitoxice). În acest tub, 1 ml de toxină conţine o cantitate echivalentă de 40 U (unităţi floculante Limes). Deci titrul toxinei difterice este de 40 unităţi floculante Limes.

2. Reacţia de precipitare în inel:Principiu: antigenul şi anticorpul se pun în contact astfel încât să nu se amestece; la interfaţa între cele 2 lichide, unde se creează o proporţie optimă între concentraţia de antigen şi anticorp, apare un inel de precipitare.

Reacţia Uhlenhut:- reacţia se foloseşte pentru identificarea naturii, provenienţei unor proteine (rol de

antigen), în medicina legală;- se poate preciza dacă o pată de sânge este de provenienţa umană sau nu;- în industria alimentară, pentru stabilirea provenienţei cărnii;- antigenul se extrage din sângele recoltat (de pe rufe, haine etc), prin spălare în ser

fiziologic, centrifugare;- într-o serie de eprubete se repartizează antigenul în diluţii diferite şi se adaugă ser

antiproteină umană, astfel încât cele două componente să nu se amestece;- se folosesc tuburi martor: martor sigur (+)/ser uman şi martor sigur (-)/ser de cal:

Tub nr 1 2 3 4 M(-) 5M(+)Antigen nediluat 0,7 - - - -Antigen diluat 1/100 - 0,7 - - -Antigen diluat 1/5000 - - 0,7 - -Ser normal de cal diluat 1/1000 - - - 0,7 -

Ser normal de om diluat 1/1000 - - - - 0,7Ser precipitant anti- proteină umană

0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

Reacţia Ascoli:- reacţia se utilizează pentru diagnosticul retrospectiv al antraxului;- din organele animalului suspectat a fi decedat de antrax se extrage antigenul;- antigenul este format dintr-o fracţiune proteică termostabilă, din compoziţia

bacilului cărbunos (Bacillus anthracis).Extragerea antigenului:

- fragmentul de organ se mojarează în soluţie de ser fiziologic steril, în proporţie de 1/5;

- se adaugă câteva picături de acid acetic şi se fierbe timp de 5- 10 min;- se decantează şi se neutralizează supernatantul cu câteva picături de NaOH;- se filtrează prin hârtie de filtru,- filtratul conţine toxina termostabilă, care se foloseşte drept antigen:

Nr. tub 1 2 M(-) 3 M(-)Ser anticarbunos 0,5 0,5 -Antigen preparat 0,5 - 0,5Ser fiziologic - 0,5 -Ser normal de cal - - 0,5

- se menţin eprubetele 5 - 10 min la temperatura camerei, după care se face citirea reacţiei:

- reactie (+): apariţia unui inel de precipitare în tubul nr. 1;- în eprubetele 2 şi 3, ca martori negativi, inelul lipseşte.

Determinarea grupului streptococic:Izolarea din exsudat faringian (sau alte produse patologice) a altor streptococi beta hemolitici (test bacitracină negativ) decât streptococul beta hemolitic de grup A (test bacitracină pozitiv, Streptococcus pyogenes), necesită o reacţie de determinare a apartenenţei de grup, a acestora.Metoda Lancefield implică:

- extracţia acidă a antigenului streptococic de grup (fracţiunea polizaharidică specifică de grup) prin tratarea cu HCl a sedimentului culturii în bulion a tulpinii de testat;

- punerea în contact a antigenului preparat (fără să se amestece) cu antiseruri specifice de grup (A, B, C, F, G, preparate pe iepuri), în tuburi cu lumen foarte îngust.

- menţinerea tuburilor la temperatura camerei, timp de 10 min, până când va apărea un inel de precipitare la interfaţa dintre antigen şi anticorpul corespunzator. Tubul în care va apărea inelul de precipitare va indica apartenenţa de grup a streptococului, cunoscând antiserul respectiv.

3. Reacţia de precipitare în tuburi capilarePrincipiu: reacţia se execută punând în contact antigenul cu anticorpul în tuburi capilare (vârfuri de pipete Pasteur).Determinarea tipului M streptococic:

- anumite tipuri M de streptococ beta hemolitic grup A, determină complicaţii renale şi cardiace, secundare unei infecţii acute streptococice;

- antigenul proteic M din peretele bacterian se obţine prin tehnica extracţiei acide (HCl) la cald, din sedimentul culturii în bulion glucozat 2%o;

- extractul proteic se pune în contact (prin absorbţie) cu cantităţi egale de seruri antistreptococice de tip M (preparate pe iepuri), în tuburi capilare;

- capetele se etanşeizează cu plastilină;- se termostatează 2 ore la 37°C, apoi se lasă peste noapte la frigider;- apariţia unui precipitat abundent la baza unuia din tuburi, indică apartenenţa de tip

(antiserul respectiv, cunoscut).

Determinarea unor proteine patologice în serul bolnavilor (proteina C reactivă):- în faza acută a unui proces inflamator;- într- un proces necrotic sau proces neoplazic.

În serul bolnavilor apare o proteină cu caracter patologic, numită proteina C reactivă. Aceasta este pusă în evidenţă prin reacţia de precipitare: se pun în contact, în tuburi capilare, cantităţi egale de ser de bolnav şi ser antiproteina C reactivă. Prezenţa unui precipitat indică o reacţie pozitivă, cantitatea de precipitat fiind proporţională cu intensitatea reacţiei.

Reacţii de precipitare în mediu gelifiat (metode cantitative)Principiu: reacţia are loc într- un mediu gelifiat (0,8 - 1,25% agar), în care moleculele de antigen şi anticorp pot migra prin porii gelului, cu conţinut mare de apă. La locul de întâlnire a unor anumite cantităţi de antigen şi anticorp corespunzător, apare o linie vizibilă de precipitare.

a. Difuzia simplă (metoda Mancini)Aplicaţii:

- imunograma (determinarea cantitativă în serul bolnavilor a unor fracţiuni proteinice, cum ar fi IgA, IgM, IgG);

- determinarea fracţiunilor complementului în serul uman.Tehnica de lucru:

- în plăci de polistiren cu diametrul de 5 cm, se toarnă gel de agar în care a fost înglobat, într-o cantitate optimă, antiserul (Ac) corespunzator tipului de componentă proteică (Ag) care se doreşte a fi identificată (ser anti- IgA, anti- IgM, anti- IgG, anti- complement);

- în agar se efectuează godeuri de 2 mm (cu un tub metalic) în formă de rozetă, respectând distanţa optimă între ele;

- în godeuri se introduc câte 5 µl din preparatul proteic de identificat (seruri de bolnav, ce conţin cantităţi necunoscute de Ag corespunzător Ac înglobat în gel), cu ajutorul unei micropipete;

- în godeul central se introduc 5 µl de ser uman de referinţă (cantitate cunoscută dintr-un Ag cunoscut, al carui Ac corespunzător este înglobat în gel);

- placuţele se termostatează la 37°C timp de 24 ore pentru IgG, complement şi 48 ore pentru celelalte componente (Ig A, IgM);

- din godeuri va migra antigenul (cantitate căruia se doreşte a fi calculată), care va întâlni anti-serul corespunzător, înglobat în gel;

- dupa termostatare, în jurul godeurilor apar cercuri concentrice, de diametre variabile, formate din linii de precipitare;

- se masoară diametrul zonelor de precipitare şi se compară cu diametrul dat de serul standard, cu concentraţie cunoscută, din centrul plăcii;

- astfel se poate stabili cantitatea de Ag (IgA, IgG, IgM sau complement), utilizând tabele întocmite pe baza unor experimentări pe numeroase seruri, care stabilesc raportul dintre diametrul zonelor de precipitare şi cantitatea de Ig sau complemnt corespunzătoare.

b. Difuzia dublăb.1. Difuzia dublă radială (metoda Ouchterlony)Principiu: antigenul şi anticorpul se introduc în godeuri faţă în faţă, vor migra în gel şi la locul de întâlnire se formează linii de precipitare vizibile (metodă calitativă nu şi cantitativă)Tehnica de lucru:

- gelul de agaroză se aplică pe lame de sticla, bine degresate;- în godeul central se pune Ac cunoscut, corespunzător Ag cunoscut din godeurile

martor, dispuse faţă în faţă;- în godeurile marginale, dispuse în rozetă, se introduce antigenul (2 martori cu Ag

cunoscut, corespunzător Ac din godeul central şi 6 seruri de bolnav, de verificat dacă conţin sau nu, acelaşi Ag, ca şi martorii);

- la locul de întâlnire (Ag - Ac corespunzător) se formează o linie de precipitare;- este dublă difuzia, deoarece migrează şi Ac (godeu central) şi Ag (godeuri

marginale);- godeul care conţine serul de bolnav, prezintă sau nu linie de precipitare la mijlocul

distanţei faţă de godeul central (Ac), dacă conţine sau nu Ag similar godeului martor (Ag cunoscut şi corespunzător Ac din godeul central).Aplicatii:

- determinarea tipului M streptococic;- proteina C reactivă,- α - feto- proteina.

b.2. Difuzia dublă (metoda Elek)Metoda se aplică în bacteriologie pentru determinarea toxinogenezei bacililor difterici, izolaţi din exsudate nazo - faringiene.Tehnica delucru:

- în placă Petri cu geloză se practică un sanţ de 6/1,5 cm în centrul acesteia;- se scoate geloza, se toarnă un strat subţire de geloză caldă, se răceşte;- se toarnă în sanţ ser anti - toxină difterică;-se acoperă sanţul cu geloză călduţă, fară a inactiva termic serul antidifteric, se

răceşte geloza;- se însămânţează tulpini de bacil difteric (Corynebacterium diphteriae) perpendicular

pe direcţia sanţului, oprindu-se la 0,5 cm de marginea acestuia;

- se însămânţează şi un martor sigur (+): tulpina de bacil difteric sigur producătoare de toxină difterică (tulpina toxigenă);

- se termostatează la 37°C, 24 ore;- tulpinile de bacil difteric toxigene, vor sintetiza toxina, la cald, aceasta va difuza în

gel;- din sanţul practicat în geloza, vor difuza anticorpii specifici anti - toxină difterică;- la locul de întâlnire a antigenului cu anticorpul, se formează linii de precipitare, sub

forma de “mustăţi”/specifice;- apariţia în unghiul format între tulpina de testat şi sanţul cu ser antitoxină difterică a

liniilor de precipitare, arată că tulpina este toxigenă, la fel cu tulpina martor, sigur producătoare de toxină difterică.

Imunelectroforeza (IEF)Principiu: asocierea electroforezei în gel (separarea antigenelor în funcţie de încărcătura lor electrică) cu difuzia dublă (precipitarea specifică a antigenelor de către anticorpi) are ca rezultat formarea unor arcuri de precipitare specifice, corespunzătoare antigenelor din proba migrată.IEF permite:

- separarea şi determinarea numărului de constituenţi dintr-un amestec de antigene;- definirea antigenelor pe baza mobilităţii electroforetice; - izolarea din gel a antigenului urmărit pentru a realiza o analiză imunochimică mai

amanunţită.

Contraimunelectroforeza (CIE)Principiu: proteinele cu migrare anodică sunt precipitate într-un câmp electric de către anticorpii specifici.CIE reprezintă o dublă difuzie la care deplasarea antigenului şi anticorpului este accelerată de un câmp electric. La pH 8,2 - 8,6 în gelul de agar, anticorpii încărcaţi slab negativ se deplasează spre catod, iar antigenele cu sarcină electrică mai mare spre anod. Aceste deplasări se fac în “sens contrar”, iar difuzia în alte direcţii decât cea a câmpului electric este impiedicată.Indicaţii:

- decelarea sau identificarea unor proteine serice patologice (alfa - feto - proteina, produşii D şi E de degradare ai fibrinogenului);

- antigene bacteriene

Electroimunodifuzia (EID)Se realizează prin electroforeza Ag în strat de gel ce conţine Ac monospecifici. Precipitatul Ag - Ac apare sub formă de rachetă (con) a cărui înălţime este direct proporţională cu concentraţia de Ag şi invers proporţională cu cea de Ac.

Reacţii de aglutinare Aglutinarea reprezintă agregarea de particule prin Ac. Ac reacţionează cu Ag (natural sau fixat artificial) de la suprafaţa unor particule (bacterii, hematii, latex) şi determină aglutinarea acestora. Aglutinarea depinde de o serie de factori: valenţa Ac (Ac din clasa IgM sunt mult mai aglutinanţi decât cei care aparţin clasei IgG), densitatea

determinanţilor antigenici de la suprafaţa particulei, forţa ionică a mediului în care are loc reacţia. Aglutinarea se datorează scăderii forţelor de respingere electrostatice dintre particule şi creieri unor punţi de legătură prin intermediul Ac. Reacţia de aglutinare are sensibilitatea mai mare decât reacţia de precipitare (Ag este o particulă şi nu o moleculă solubilă), excesul de Ag nu inhibă reacţia, concentraţiile mari de Ac pot inhiba reacţia şi produce fenomenul de prozonă, raportul între Ag - Ac este tot în favoarea Ac (ca şi la precipitare). Ac reacţionează numai cu determinantul Ag specific. Alături de Ac aglutinanţi există Ac neaglutinanţi (blocanţi sau incompleţi) şi Ac care aglutinează numai la rece (+4oC).

Reacţia de aglutinare directăAglutinarea directă (aglutinarea simplă, clasică) este aglutinarea Ag naturale ale unor particule de către Ac specifici (determinarea grupelor sanguine, aglutinarea bacteriană). Sensibilitatea acestui tip de aglutinare poate fi crescută prin tratarea celulelor cu enzime sau prin executarea reacţiei în mediul cu vâscozitate crescută.

Reacţia de aglutinare indirectăAglutinarea indirectă (pasivă) este o reacţie ce presupune particule naturale sau artificiale (hematii formolizate, stafilococ, proteină A, latex, cristale de colesterol) încărcate in vitro cu Ag sau Ac. Particulele sunt aglutinate de către Ac, respectiv Ag omolog din probă. Hemagluinarea pasivă este o metodă deosebit de sensibilă de cercetare a Ac serici, imaginată de Gzegibes şi Sehon. Ac care nu pot produce reacţii vizibile cu Ag, deoarece se găsesc în ser în cantităţi reduse, pot fi evidenţiaţi prin metode de aglutinare pasivă, crescând cantitatea de Ag prin absorbţia acestora pe un substrat inert. În acest fel, cantităţi mici de Ac produc aglutinări vizibile.

Reacţia de inhibare a aglutinăriiReacţia de aglutinare a particulelor încărcate cu Ag solubil este inhibată în cazul în care Ac reacţionează în prealabil cu Ag omolog (diagnosticul imunologic de sarcină prin inhibarea aglutinării hematiilor sau prin inhibarea aglutinării latexului). Diferenţa principală între hemaglutinarea pasivă şi tehnica de inhibare a hemaglutinării este aceea că în prima metodă (hemaglutinarea) se investighează prezenţa Ac, în timp ce în a doua (inhibarea) se investighează prezenţa Ag.

Reacţia de aglutinare mediată de anticorpi anti-imunoglobulineAc anti-imunoglobuline aglutinează particule încărcate (natural sau artificial) cu Ac (decelarea FR prin reacţia Waaler-rose sau Latex-FR, decelarea Ac incompleţi fixaţi la suprafaţa hematiilor prin reacţia coombs). Reacţia de aglutinare poate fi calitativă de screening (latex-FR, reacţia coombs) sau cantitativă (reacţia Waaler-Rose, reacţia Coombs). Reacţia Latex-FR este mai sensibilă, iar reacţia Waaler-Rose este mai specifică.

Reacţiile de aglutinare utilizate în microbiologicAglutinarea reprezintă agregarea de particule prin Ac. Ac reacţionează cu Ag (natural sau fixat artificial) de la suprafaţa unor particule (bacterii, hematii, latex) şi determină

aglutinarea acestora. Aglutinarea depinde de o serie de factori: valenţa Ac (Ac din clasa IgM sunt mult mai aglutinanţi decât cei care aparţin clasei IgG), densitatea determinanţilor antigenici de la suprafaţa particulei, forţa ionică a mediului în care are loc reacţia. Aglutinarea se datorează scăderii forţelor de respingere electrostatice dintre particule şi creieri unor punţi de legătură prin intermediul Ac. Reacţia de aglutinare are sensibilitatea mai mare decât reacţia de precipitare (Ag este o particulă şi nu o moleculă solubilă), excesul de Ag nu inhibă reacţia, concentraţiile mari de Ac pot inhiba reacţia şi produce fenomenul de prozonă, raportul între Ag - Ac este tot în favoarea Ac (ca şi la precipitare). Ac reacţionează numai cu determinantul Ag specific. Alături de Ac aglutinanţi există Ac neaglutinanţi (blocanţi sau incompleţi) şi Ac care aglutinează numai la rece (+4oC). Există mai multe tipuri de aglutinare.

Reacţia de aglutinare directăAglutinarea directă (aglutinarea simplă, clasică) este aglutinarea Ag naturale ale unor particule de către Ac specifici (determinarea grupelor sanguine, aglutinarea bacteriană). Sensibilitatea acestui tip de aglutinare poate fi crescută prin tratarea celulelor cu enzime sau prin executarea reacţiei în mediul cu vâscozitate crescută.

Reacţia de aglutinare indirectăAglutinarea indirectă (pasivă) este o reacţie ce presupune particule naturale sau artificiale (hematii formolizate, stafilococ, proteină A, latex, cristale de colesterol) încărcate in vitro cu Ag sau Ac. Particulele sunt aglutinate de către Ac, respectiv Ag omolog din probă. Hemagluinarea pasivă este o metodă deosebit de sensibilă de cercetarea Ac serici, imaginată de Gzegibes şi Sehon. Ac care nu pot produce reacţii vizibile cu Ag deoarece se găsesc în ser în cantităţi reduse, pot fi evidenţiaţi prin metode de aglutinare pasivă, crescând cantitatea de Ag prin absorbţia acestora pe un substrat inert. În acest fel, cantităţi mici de Ac produc aglutinări vizibile.

Reacţia de inhibare a aglutinăriiReacţia de aglutinare a particulelor încărcate cu Ag solubil este inhibată în cazul în care Ac reacţionează în prealabil cu Ag omolog (diagnosticul imunologic de sarcină prin inhibarea aglutinării hematiilor sau prin inhibarea aglutinării latexului). Diferenţa principală între hemaglutinarea pasivă şi tehnica de inhibare a hemaglutinării este aceea că în prima metodă (hemaglutinarea) se investighează prezenţa Ac, în timp ce în a doua (inhibarea) se investighează prezenţa Ag.

Reacţia de aglutinare mediată de anticorpi anti-imunoglobulineAc anti-imunoglobuline aglutinează particule încărcate (natural sau artificial) cu Ac (decelarea FR prin reacţia Waaler-rose sau Latex-FR, decelarea Ac incompleţi fixaţi la suprafaţa hematiilor prin reacţia coombs). Reacţia de aglutinare poate fi calitativă de screening (latex-FR, reacţia coombs) sau cantitativă (reacţia Waaler-Rose, reacţia Coombs). Reacţia Latex-FR este mai sensibilă, iar reacţia Waaler-Rose este mai specifică.

Reacţii de aglutinare utilizate în diagnosticul microbiologic direct

Aglutinarea pe lamă sau în tuburi pentru confirmare se face:- pentru identificarea tulpinii bacteriene implicate etiologic în respectiva boală

infecţioasă îndeosebi pentru identificarea unei tulpini de enterobacteriaceae (Shigella spp., E. coli etc.) sau Vibrio spp, după cultivarea p.p. pe diferite medii.Materiale necesare:

- colonii izolate (colonii de tip S);- soluţie salină fiziologică;- Ac cunoscuţi faţă de Ag pe care dorim să le identificăm (Ac polivalenţi, Ac

monovalenţi de grup, Ac monovalenţi de tip, după caz);- lame de microscop;- amestec dezinfectant etc.

Tehnica de lucru: - pe o lamă se pune o picătură de soluţie salină fiziologică; - se descărcă în aceasta un fragment din colonia de identificat;- se amestecă până se obţine o suspensie tulbure;- dacă picătura devine limpede, cu grunji, înseamnă că apare „autoaglutinare" şi nu

mai poate să fie identificată tulpina prin reacţie Ag - Ac (ar putea fi, de ex. o tulpină din colonie de tip R, care şi-a modificat structura);

- dacă suspensia rămâne tulbure, pe aceeaşi lamă, la cealaltă extremitate, se pune o picătură de ser cu Ac cunoscuţi (polivalenţi);

- se descărcă un fragment din colonia de identificat în picătura de ser cu Ac şi se amestecă până se obţine o suspensie tulbure;

- prin înclinare, în mai multe direcţii, se favorizează contactul dintre Ag - Ac mici şi apar complexe mici, apoi reţele de complexe Ag – Ac, apar grunji de aglutinare;

- se citeşte reacţia pe un fond negru;- lamele pe care a fost executată reacţia de aglutinare conţin microorganisme vii, de

aceea trebuie să fie introduse în amestec dezinfectant, după examinarea rezultatelor reacţiei.Pentru identificarea grupului streptococic putem face reacţii de aglutinare indirectă, la fel ca şi pentru detectarea unor virusuri. Tot prin tehnica de aglutinare indirectă se pot identifică şi exotoxinele.

Reacţii de aglutinare utilizate în diagnosticul serologicÎn diagnosticul serologic, în mod obişnuit, reacţiile de aglutinare utilizate permit detectarea prezenţei Ac în serul de cercetat dar şi stabilirea titrului. Totuşi, există şi câteva exemple de reacţii de aglutinare calitative.Aglutinarea pe lamăReacţia de aglutinare pe lamă (Huddleson; diagnosticul brucelozei) a intrat în istoria medicinii. Materiale necesare:

- lame de microscop;- Ag brucelos inactivat (colorat în violet);- ser de cercetat.

Tehnica de lucru:

- pe lamă de microscop se depune o picătură din soluţia de Ag brucelos şi o picătură de ser de cercetat;

- se amestecă şi se omogeniză cei 2 reactanţi.Reacţia este pozitivă în cazul în care se remarcă prezenţa aglutinatelor. Reacţia pozitivă pe lamă trebuie confirmată prin aglutinare în tuburi.

Aglutinarea în tuburiTehnica poate fi folosită în diagnosticul serologic al brucelozei (Wright), diagnosticul serologic al infecţiilor produse de Cryptococcus neoformans, diagnosticul serologic al febrei tifoide (reacţie Widal).Pentru diagnosticul serologic al febrelor enterice sunt necesare:

- seruri de la pacienţi (recoltate în dinamică, la 7-10 zile „distanţă");- baie de apă;- Ag cunoscute (Ag O şi Ag H);- 4 şiruri de eprubete (2 şiruri pentru anti-O, pentru serul recoltat de la pacient

„astăzi" şi două şiruri pentru titrarea Ac anti-H, câte două variante, în dinamică, pentru fiecare Ag, respectiv pentru fiecare tip de Ac);

- se diluează serul de cercetat (diluţii binare: 1/40; 1/80, 1/180);- se pregăteşte pentru fiecare şir un tub martor (tampon pentru diluţie + Ag, fără

ser);- se incubează cele 2 şiruri de tuburi cu Ag - O timp de 20 ore la 52°C iar cele 2

şiruri de tuburi cu Ag - H 2 ore la 52°C plus 10 minute la temperatura camerei;- evaluarea se face pentru fiecare tub în parte, începând de la diluţiile mari, prin

examinare şi uşoară agitare, pentru a surprinde aglutinatele. Ultimul tub care prezintă aglutinare vizibilă stabileşte titrul reacţiei (pentru fiecare şir de tuburi, în parte). Un titru care creşte de 4 ori „în dinamică" stabileşte diagnosticul.

- în cazul unor pacienţi care se află în convalescenţă sau în cazul persoanelor care ar putea fi purtători se încercă să se stabilească titrul Ac anti-Vi (prin aglutinare sau prin hemaglutinare pasivă).

Reacţii antigen-anticorp care nu sunt vizibile, directIn Reacţiile Ag-Ac care nu pot fi evaluate direct, implică fără utilizarea unui „artificiu tehnic" (utilizare de sistem hemolitic, alt sistem indicator, marcare cu enzime).

Reacţia de neutralizareAntigenul este reprezentat de un imunogen cu proprietăţi biologice (toxină, enzimă, virus). Ac specifici determină (in vivo sau in vitro) blocarea acestor proprietăţi. Reacţia de neutralizare depinde de aviditatea Ac, adică de viteza cu care Ac se poate combina cu Ag şi de gradul de stabilitate a legăturii Ag - Ac. Neutralizarea efectelor biologice ale Ag se constată numai în cazul în care situsul (toxic sau enzimatic) responsabil de activitatea biologică a Ag este identic cu situsul Ag. În laborator, acest tip de reacţie se utilizează pentru determinarea Ac anti-streptolizină O prin reacţia ASLO (etapa finală de vizualizare este hemoliza) şi pentru identificarea unor virusuri. Testul ASLO este o reacţie de neutralizare (inhibare a hemolizei). Se bazează pe proprietatea streptolizinei de a produce liza hematiilor de diverse specii.

Reacţii ce utilizează complementÎn laboratorul clinic se execută patru reacţii de acest tip:

Reacţia de fixare a complementuluiReacţia de fixare a complementului (RFC), hemoliză directă. J. Bordet a imaginat o metodă de vizualizare indirectă a unei reacţii Ag - Ac, folosind complement (C) şi un sistem indicator (hemolitic).Complexul Ag - Ac fixează C, iar hematiile sensibilizate adăugate ulterior rămân intacte (absenţa hemolizei înseamnă reacţie pozitivă), în lipsa complexului Ag - Ac specific (iniţial), C se fixează pe hematiile sensibilizate (sistemul indicator) producând hemoliza (hemoliza înseamnă reacţie negativă). Fixarea C pe complexul Ag - Ac este evidenţiată indirect prin absenţa hemolizei sistemului indicator din a doua etapă a reacţiei (ser anti - hematii berbec-hematii berbec). Activitatea anticomplement se datorează prezenţei complexelor Ag - Ac preformate, agregatelor de Ig şi a altor substanţe care pot activa calea clasică sau calea alternativă de activare a C.

Testul de inhibare a hemolizei imune pasive în prezenţa complementuluiTestul este analog testului de inhibare a hemaglutinării, deosebirea esenţială constă în desfăşurarea reacţiei în prezenţa C. În cazul în care în prima etapă a reacţiei se formează complexul Ag - Ac nu mai rămân disponibili Ac care să reacţioneze cu hematiile sensibilizate, astfel încât în ultima etapă, C nu este cuplat cu hematiile sensibilizate şi acestea nu sunt lizate. În acest caz rezultatul testului este considerat pozitiv. În situaţia în care nu se formează complexul Ag - Ac, Ac liberi reacţionează cu hematiile sensibilizate şi are loc liza acestora, rezultatul testului este considerat negativ. În testul de imunohemoliză pasivă, interpretarea rezultatului se face în funcţie de gradul hemolizei obţinute, luându-se în considerare dimensiunile sedimentului de hematii şi intensitatea culorii supernatantului. Testul de inhibare a hemolizei imune pasive în prezenţa C investighează prezenţa Ag în ser, în timp ce testul clasic investighează prezenţa Ac în ser.

Testul de imunohemoliză pasivă în prezenţa complementuluiCa şi în cazul testului de hemaglutinare pasivă, Ag este fixat pe hematie şi reacţionează cu Ac specific, formându-se în acest fel complexe Ag - Ac. Realizarea acestui complex în prezenţa C determină liza hematiilor sensibilizate cu Ag.

Determinarea imunohemolitică a complementuluiSe referă la reacţia Ag - Ac numai în măsura în care se foloseşte ca indicator sistemul hemolitic (hematii de berbec sensibilizate cu ser anti-hematii berbec). Reacţia măsoară activitatea hemolitică totală a sistemului complement. Metoda are ca punct final hemoliza 50%. Citirea se face la spectrofotometru.

Reacţii cu reactivi marcaţiDetectarea, localizarea şi identificarea antigenelor se poate realiza utilizând anticorpi care recunosc şi se leagă specific de antigenele respective. Vizualizarea complexului Ag - Ac format poate fi realizată prin marcarea Ac. Marcarea Ac trebuie să îndeplinească două condiţii: să permită detectarea unor cantităţi infime de substanţă; să nu altereze capacitatea de legare a Ac la Ag corespunzătoare. În aceste reacţii se

utilizează Ag sau Ac marcaţi: izotiocianatul de fluoresceină (produce strălucire caracteristică la examenul microscopic în lumina ultravioletă), izotopi radioactivi şi enzime (au activitate asupra unui substrat-cromogen specific.

Reacţia de imunofluorescenţăÎn reacţia de imunofluorescenţă (IF) unul dintre reactanţi (Ag sau Ac de cercetat) trebuie să constituie o parte dintr-o structură biologică (celulă sau ţesut), reactivul marcat cu fluorocrom relevând reacţia Ag - Ac. Vizualizarea complexului Ag - Ac format poate fi realizată prin marcarea Ac. Substanţele fluorescente (fluorocromii) absorb lumina incidentă de diferite lungimi de undă şi emit o lumină vizibilă care este în funcţie de fluorocromul utilizat: albastră, verde, galbenă, roşie sau albă. Reacţia se poate realiza direct, indirect, cu fixarea complementului

Reacţia de imunofluorescenţă directăMetoda directă (Coons) permite identificarea Ag specifice în preparate cu ajutorul conjugatului fluorescent anti-Ac. Se folosesc secţiuni de ţesuturi, seruri fluorescente anti-Ig şi anti-C.Principiu: identificarea antigenelor necunoscute montate pe lamă cu ajutorul anticorpilor cunoscuţi marcaţi fluorocromFluorocromii:

- emit fluorescenţă dacă se expun la raze UV;- izotiocianatul de fluoresceină (galben-verzui), rodamina (portocalie);- preparatul se examinează la microscopul cu fluorescenţă;- puncte fluorescente pe fond întunecat: în preparatul examinat au fost prezente

antigenele căutate (rezultat pozitiv);- absenţa punctelor fluorescente: în preparat nu au fost prezente antigenele căutate

(rezultat negativ).Dezavantaje:

- preparatele sunt instabile;- nu pot fi păstrate în timp;- este necesar microscop special.

Metoda imunoperoxidazică (IPO)- marcare enzimatică - peroxidază (descompune peroxidul de hidrogen);- vizualizarea se realizează prin adăugarea substratului cromogen - rezultă un

precipitat maroniu, insolubil, vizibil la microscopul optic;- se realizează la fel ca si RIF.

Avantaje:- preparatele pot fi păstrate în timp;- nu este necesar microscop special.

Reacţia de imunofluorescenţă indirectăReacţia de imunofluorescenţă indirectă (IFI) vizualizează reacţia Ag - Ac prin aplicarea unui conjugat fluorescent anti-Ac. Se foloseşte pentru detectarea Ac fixaţi pe Ag. Serul de bolnav se pune în contact cu un substrat celular (tisular). Urmează incubarea preparatului cu un ser antiglobulină umană marcat cu izotiocianat de fluoresceină care vizualizează în lumină ultravioletă reacţia Ag - Ac. Testul poate fi folosit atât pentru

determinarea Ag necunoscut cu ser imun cunoscut cât şi pentru detectarea Ac necunoscuţi cu Ag cunoscut.

Reacţia de imunofluorescenţă cu fixarea complementuluiComplexul Ag - Ac fixează C. Metoda fixării C pe secţiuni de ţesut este derivată din metoda indirectă prin adăugarea C, apoi a serului marcat care va vizualiza complexul Ag - Ac - C.

Analiza radioimunologicăAnaliza radioimunologică (RIA) este o tehnică de determinare cantitativă a unui număr mare de substanţe prezente în lichidele biologice în cantitate foarte mică. RIA este o tehnică obiectivă, cu mare sensibilitate, parţial automatizată, aparatură costisitoare (echipament nuclear), reactivi scumpi, cu durată de utilizare scurtă, personal cu calificare specială, supusă unei legislaţii speciale (radioizotopi).

Analiza imunoenzimaticăÎn 1966, Avrameas şi Uriel introduc în histochimie marcarea enzimatică cu peroxidază, iar în 1971, Van Weemen şi independent Engwall şi Perlmann utilizează enzimele ca marker pentru reacţiile Ag - Ac. Analiza imunoenzimatică (EIA) se poate realiza în sistem omogen sau eterogen.Reacţia imunoenzimatică în sistem omogen constă în competiţia pentru Ac între Ag marcat enzimatic şi Ac de determinat (din probă). Activitatea enzimatică este invers proporţională cu concentraţia Ag din probă;Reacţia imunoenzimatică în sistem eterogen poate fi utilizată atât pentru determinarea Ac cât şi a Ag. Activitatea enzimatică a conjugatului nu este influenţată de reacţia Ag - Ac şi necesită o etapă de separare. Avantajele EIA: obiectivă, poate fi automatizată, foloseşte reactivi cu valabilitate convenabilă, aparatura este simplă, are sensibilitate crescută, nu este supusă unei legislaţii restrictive ca RIA.

Tehnica ELISAÎn cazul utilizării sistemelor de fază solidă pentru separarea moleculelor libere şi acelor marcate, tehnica este denumită ELISA (enzime linked immunosorbent asssay). Tehnica imunoenzimatică ELISA este bazată pe reacţia Ag - Ac. Sistemul de analiză constă din mai multe reacţii:

- Ag sau Ac este imobilizat pe suport solid (plăci de plastic cu godeuri); - Ag sau Ac din proba de testat se leagă specific de reactantul imobilizat; - reactantul marcat enzimatic reacţionează cu complexul reactant imobilizat; - Ag (sau Ac) din probă.

Reactantul marcat enzimatic format din Ag (sau Ac) conjugat cu o enzimă este activ atât imunologic cât şi enzimatic şi reacţionează atât cu Ag (sau Ac) din probă imobilizat pe suportul solid cât şi cu substratul corespunzător enzimei.Vizualizarea reacţiei dintre reactantul enzimatic şi complexul Ag - Ac iniţial se realizează prin adăugarea unui substrat corespunzător enzimei utilizate. Formarea complexului este identificată prin reacţia de culoare care apare la adăugarea substratului specific (p-nitrofenil fosfat disodic pentru fosfataza alcalină şi tetrametilbenzidină

pentru peroxidază). Intensitatea culorii indică prezenţa sau absenţa Ag, respectiv Ac din probă (se citeşte spectrofotometric folosind un cititor de plăci ELISA:Tehnica ELISA se poate folosi pentru evidenţierea Ac (boli infecţioase, autoimune) sau a Ag (boli infecţioase, neoplazice, endocrinologice, farmacologie).

Tehnica Western BlotTehnica cuprinde trei etape: separarea Ag prin electroforeză, transferul Ag, testarea probei de ser utilizând tehnica RIA sau ELISA. Numai partea a treia este efectuată în laboratoarele clinice. Tehnica WB este disponibilă sub formă de truse comerciale.

Reacţia ASLO

Se poate utiliza:- în diagnosticul retrospectiv al unei infecţii streptococice;- pentru confirmarea etiologiei bolilor poststreptococice;- pentru determinarea titrului Ac anti streptolizină O (SLO).Principiu: SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de berbec. Dacă în serul pacientului există Ac anti-SLO, acţiunea hemolitică a SLO este neutralizată. Prin diluţii efectuate în mai multe tuburi, se determină titrul ASLO.Materiale necesare:

- seruri de "cercetat (recoltate la interval de 7-10 zile);- SLO liofilizată,- sânge defibrinat de iepure;- soluţie salină izotonă;- soluţie de rivanol 0,3%;- eprubete;- pipete gradate foarte curate;- baie de apă;- centrifugă

Tehnica de lucru: - se omogenizăm- se omogenizează suspensia de hematii;- se diluează serul 1/10;- se menţine 30 minute la 56°C;- se fac diluţiile necesare şi se repartizează serul diluat în tuburi.;- se adăugă o cantitate constantă de SLO;- rezultatul reacţiei nu se vizualizează reacţiei în această etapă,- în etapa a doua se agită tuburile (pentru omogenizare);- se ţin 15 minute la 37°C;- se adăugă suspensia de hematii (0,5 ml în fiecare tub);- se agită pentru omogenizare;- se incubează 45 minute, la 37°C; - se centrifugă şi se menţin tuburile la frigider, până a doua zi.

Interpretare: Prin respectarea protocolului, titrul potenţial al Ac anti-SLO va fi 12, 50, 100, 125, 166, 250, 333 etc. Titrul reacţiei ASLO este dat de cea mai mare diluţie de ser la care lipseşte complet hemoliza. În ţara noastră se acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250) unităţi ASLO. Există şi alte teste serologice care pot fi utilizate.

Testarea imunităţii de tip celular

Investigarea pacientului RIC include:• discuţia cu pacientul şi anamneză (medicaţie primită, momentul debutului

suferinţei, vaccinări efectuate, infecţii în antecedente);• examenul clinic;• examenul de laborator (numărul elementelor figurate, formula leucocitară,

frotiul din sângele periferic, VSH, alţi reactanţi de fază acută etc., studiul subpopulaţiilor limfocitare din punct de vedere numeric şi funcţional, determinarea numărului de celule formatoare de Ac faţă de Ag timo-dependente, studiul funcţiei celulelor fagocitare, evaluarea activităţii citotoxice a celulelor NK şi K, studiul secreţiei de citokine etc.),

• teste imunobiologice (IDR), folosind Ag care stimulează RIC; este recomandată o „baterie" de Ag, patru-cinci din Ag prezentate în paranteză (extras din virusul urlian, fitohemaglutinină, lizat din cultură de Staphylococcus aureus, toxoid tetanic, toxoid difteric, tricofitină, tuberculin).

IDR la PPD (IDR Mantoux)Testu IDR este destinat depistării tuberculozei.Principiu: Tuberculina reprezintă un amestec de Ag proteice micobacteriene, utilizată pentru identificarea gazdelor infectate. Un alt scop este reprezentat de utilizarea IDR la PPD (derivat proteic purificat de tuberculină), împreună cu alte IDR (cu alte Ag, provenind de la alte microorganisme cu care presupunem că respectiva gazdă s-a „întâlnit", deja), pentru evaluarea reactivităţii în cadrul RIC. Dacă o persoană este infectată cu germeni din grupul Mycobacierium tuberculosis, urmează sensibilizarea şi proliferarea LT. IDR la PPD stimulează LT şi RIC (inclusiv hipersensibilitatea de tip IV). Rezultă vasodilataţie, edem şi infiltrat cu LT, bazofile, monocite, neutrofile. Se cunoaşte că reacţia maximă este la circa 48 ore. Aria induraţiei reflectă HS de tip IV. Eritemul nu este interpretat ca reacţie pozitivă.Materiale şi reactivi necesari:

- seringi cu gradaţii la 0,1 ml;- PPD în fiole cu 2 UI/doză (echivalentul a 5 UI PPD-S) sau 10 UI/ doză;- antiseptic.

Tehnica de lucru (IDR Mantoux):- se controlează fiola;- se agită energic pentru omogenizarea PPD;- se pregăteşte seringa şi se aspiră o cantitate suficientă de produs pentru a putea

elimina bule de aer şi a fi siguri că vom injecta i.d. 0,1 ml, fix;- se antiseptizează cu alcool medicinal (3 minute) o zonă situată pe faţa anterioară a

antebraţului stâng, în treimea medie;- se pătrunde acul aproape tangent la suprafaţa antebraţului, cu bizoul în sus, pentru a

ne situa în dermă;- se injectează strict 0,1 ml;- dacă injectarea a fost corectă, apare o bulă uşor denivelată cu diametru de circa 5

mm.Citirea rezultatului:

La persoanele infectate, la locul injectării poate apărea o reacţie (eritem-edem-induraţie) după circa 6 ore, fiind maximă la 48-72 ore. Totuşi, cel mai frecvent, citirea rezultatului se face la 72 ore, la lumina naturală. Se recomandă o primă citire la cel târziu 24 ore (pentru a surprinde HS de tip umoral faţă de Ag inoculat, structură proteică), o a doua citire la 48 ore şi citirea finală la 72 de ore.Se Măsoară „diametrul maxim" al zonei de infiltraţie (induraţie). Citirea reacţiei este subiectivă, cu posibile variaţii individuale, totuşi rămâne un element important, care nu trebuie neglijat.Pentru investigarea RIC pentru un subiect (am utilizat o „baterie" de Ag), dacă de ex. rezultatul este „negativ" (nu apare induraţie) pentru oricare dintre cele 4-5 Ag folosite, presupunem faptul că subiectul respectiv este anergic în ceea ce priveşte RIC.Pentru investigarea infecţiei cu M. tuberculosis, în ţara noastră se consideră drept pozitive reacţiile cu diametru mai mic sau egal cu 9 mm (analiza statistică a distribuţiei valorilor pe eşantioane reprezentative de subiecţi a arătat că plasarea limitei între valorile de 9-10 mm separă cel mai bine pe cei neinfectaţi de cei infectaţi). O valoare mai mare de 10 mm recomandă analize suplimentare şi investigaţii care să elimine riscul tuberculozei-boală, care necesită tratament. Interpretarea corectă, în context clinic şi epidemiologie revine membrilor reţelei de pneumoftiziologie, conform algoritmului stabilit în Programul Naţional de prevenire şi control al TB.O induraţie de 5 mm sau mai mult este considerată pozitivă la:

- persoane infectate cu HIV;- un contact recent cu o persoană bolnavă de TBC;- persoane cu modificări radiologice pulmonare de tip fibros ca rezultat al unei TBC

anterioare;- pacienţii transplantaţi;- persoane care sunt imunosupresate din alte cauze (cei care primesc echivalentul a 15

mg prednison/zi timp de 1 lună sau mai mult, cei care primesc tratament cu antagonişti de TNF-alfa.