Metoda de cuantificare pentru proteine Bradford

Introducere Metoda Bradford este o metoda rapid, simpl i sensibil pentru cuantificarea

proteinelor. Fiind exact i rapid nu necesit neprat diluie prelimininar pentru c probele care nu se ncadreaz n intervalul de msur pot fi retestate. Ca urmare metoda Bradford este recomandat pentru testare rapid pentru determinarea coninutului de proteine din fraciuni n urma purificrii sau pentru ncrcarea unui gel de electroforez.

Metoda descris mai jos este optimizat pentru un volum de 20 microlitri prob utiliznd 1 ml de reactiv de detecie. Domeniul de detecie este de la 5 la 100 micrograme de proteine, n funcie de calitatea colorantului. Determinarea proteinelor prin aceast metod se poate realiza prin utilizarea reactivului preparat n laborator sau se pot utiliza reactivi comerciali.

Principiu Testul se bazeaz pe legarea reactivului Coomassie Brilliant Blue G-250 la proteine. S-a

plecat de la observaia c absorbana maxim n soluie acid a colorantului se modific de la la 465 nm la 595 nm prin legarea acestuia de proteine. Interaciunile hidrofobe i ionice stabilizeaz forma non ionic a coloratului i ca urmare acesta se distinge de cel solubil, rmas n mediu acid.

Echipament Echipamentul consta n sticlrie pentru prepararea reactivilor, tuburi de test, pipete

reglabile. Pentru msurare este necesar un spectrofotometru lumina vizibil cu transmisie maxim

n regiunea de 595 nm. Lungimea de unda este la grania spectrului vizibil. Citirea se face n cuve de sticl, spalabile sau n cuve de polistiren de unic folosin.

Procedur Reactivi Reactivul Bradford: Se dizolv 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250 n 50 ml de

etanol 95%, se adaug 100 ml de 85% (g / v) de acid fosforic. Se dilueaz la 1 litru iar cnd colorantul s-a dizolvat complet, se filtreaz prin hrtie de filtru Whatman #1 sau similar.

Reactivul Bradford are o culoare maronie. Dac el vireaz n albastru nseamn ca probabil au aprut grunzi de colorant i trebuie refiltrat.

Test 1. Se nclzete spectrofotometrul inaine de utilizate pentru stabilizarea temperaturii. 2. Se dilueaz probele pentru a fi n ntre 1 i 20 micrograme de proteine n cei 20

microlitri (0,05-1 mg/ml). 3. Se prepara standarde n gama larg de 1 - 20 micrograme de proteine (albumin sau

globulin bovin ) n 20 microlitri (0,05-1 mg/ml). 4. Se adaug 1ml de reactiv colorant preparat n laborator.

n cazul reactivului comercial concentrat, volumul fiecrei probe i standard se aduce la 0,8 ml i se adaug 200 microlitri de reactiv colorant. 5. Se incubeaz 5 minute.

NOTA: 1. Dac probele nu sunt solubile acestea se pot solubiliza prin adugarea unui volum egal de NaOH 1M la fiecare, urmat de vortexare. Acelai tratament se aplic i la

standarde. 2. Dac cuvetele de citire sunt mai mari, se mresc volumele corespunztor. Acelai lucru

este valabil si pentru standarde.

Analiza datelor Se traseaz o curb standard a concentraiei de proteine n funcie de absorban i se

determin punctele pe curb. n cazul diluiilor, dac este cazul, concentraiile originale se obin prin nmulire cu factorul de diluie.

Comentarii Concentraia de protein, depinde de tipul acesteia. Legarea este hidrofob, reactivul

reacionnd cu reziduuri de tirozin, triptofan, fenilalanin i ionic implicnd reziduuri de arginin, histidin si lizin. Ca urmare Bradford este mai sensibil la albumin seric bovin, fa de alte proteine.

Referine bibliografice Bradford, MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976;72:248-54. Stoscheck, CM. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 1990;182:50-68.

Coomassie Brilliant Blue G-250