1

Controlul microbiologic al suprafeelor neanimate i tegumentului. Controlul microbiologic al materiilor prime.

Aspecte microbiologice importante n procesul de ambalare a produselor farmaceutice, a cldirilor utilizate pentru procesul producie i a echipamentelor.

1. Pielea i flora tractului respirator 1.1. Transferul microbian de la operatori Microorganismele pot fi transferate produselor farmaceutice de ctre operatori. Contaminarea preparatelor de administrare oral (comprimate i pulberi) poate duce la

degradarea soluiilor i suspensiilor. n cazul preparatelor parenterale contaminarea poate avea consecine grave.

Microorganisme prezente pe tegument Staphyilococcus aureus (pe mini i fa, n straturile profunde ale pielii, nu este

eliminat prin splare), Sarcina spp., difteroizii, ocazional bacterii Gram negative: Acinetobacter i Alcaligenes spp.

levuri lipofile n zonele grase i ceroase ale pielii: Pityrosporum ovale pe scalp, P. orbiculare pe pielea glabr; fungi dermatofii: Epidermophyton spp, Microsporon spp, Trichophyton spp;

bacterii saprofite n ceara din lumenul urechii n cazul unei igiene personale precare se pot gsi bacterii fecale sau bacterii dintr-o

eventual leziune a tegumentului. Aproximativ 20% din leziunile deschise fr manifestri clinice sunt colonizate cu Staphilococcus aureus.

Ali contaminani: micrococi, enterococi, streptococci -hemolitici i nonhemolitici, Clostridium spp., Bacillus sp.p, bacterii intestinale Gram-negative.

Leziuni ce pot fi infectate cu: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, enterococi, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa.

n fosele nazale pot exista ca saprofii: Staphylococcus aureus, Staph. epidermidis n nazofaringe se gsesc streptococi din grupul viridans, neisserii saprofite,

Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae. Microorganismele cele mai rspndite n timpul respiraiei normale i vorbirii sunt

streptococii saprofii din grupul viridans. Supravieuirea microorganismului depinde de natura obiectului i condiiile de mediu. Rezistena n mediul extern poate fi ndelungat, ani uneori pentru sporii bacterieni, fungi, levuri.

Persistena bacteriilorcu importan clinic pe suprafee (uscate) (Kramer et al. BMC Infectious Diseases 2006 6:130 doi:10.1186/1471-2334-6-130) Acinetobacter spp. 3 zile - 5 luni Bordetella pertussis 3 - 5 zile Campylobacter jejuni pn la 6 zile Clostridium difficile (spori) pn la 5 luni Corynebacterium diphtheriae 7 zile - 6 luni Escherichia coli 2 ore - 16 luni Enterococcus spp.5 zile - 4 luni Haemophilus influenzae 12 zile Klebsiella spp.pn la 30 luni Mycobacterium tuberculosis pn la 4 luni Pseudomonas aeruginosa pn la 16 luni Salmonella typhi 6 ore- 4 sptmni Serratia marcescens 3 zile - 2 luni Shigella spp.2 zile - 5 luni

2

Staphylococcus aureus 7 zile - 7 luni Streptococcus pneumoniae 1 - 20 zile Streptococcus pyogenes 3 zile- 6 luni Vibrio cholerae 1 - 7 zile Persistena fungilor cu relevan clinic medical pe suprafee uscate Candida albicans 1 120 zile Candida parapsilosis 14 zile Torulopsis glabrata 102 150 zile Persistena virusurilor cu relevan clinic medical pe suprafee uscate Adenovirus Virusul hepatitei A : 2 ore- 60 zile Virusul hepatitei B : 1 sptmn HIV: 1 sptmn Virusul Herpes simplex tip 1i 2 de la4 ore- 8 sptmni Virusul gripal 1- 2 zile Papillomavirus 16 :7 zile Poliovirus tip 1: 4 ore - 8 zile Poliovirus tip 2: 1 zi - 8 sptmni Virusul respirator sinciial pn la 6 ore Rhinovirus :2 ore - 7 zile Rotavirus: 6 - 60 zile Perioada de supravieuire depinde de natura obiectelor contaminate, de suprafaa

acestora, de gradul lor de curenie. esturile groase i pufoase rein un numr mai mare de microorganisme.

Instalaiile de producie, materiile prime, ambalajele, echipamentele de protecie

purtate de operator pot fi surse de contaminare a produselor farmaceutice. Exist pericolul transferului de microorganisme de la operatori la preparatele

farmaceutice i acesta trebuie redus prin instruirea n igiena personal dublat de controale medicale regulate pentru a preveni transferul de microorganisme patogene sau saprofite condiionat patogene.

Metodele de determinare a contaminrii suprafeelor obiectelor 1. Plcile de contact Se preseaz plcile Petri ce conin mediu de cultur pe suprafaa mediului sau pe

suprafaa obiectului analizat. Se incubeaz la 370C, 24 ore. Se numr de coloniile. 2. Prelevarea probelor cu tamponul steril Utilizm tampoane sterile dispuse n bulion steril; cu ajutorul lor se preleveaz proba,

tergnd o suprafa ptrat cu latura de 2,5 cm. Dup recoltare tampoanele se reintroduc n eprubete, se agit pentru a descrca

microorganismele. Se pune 1 ml pe fundul unei plci Petri sterile i se toarn geloz simpl (mediul lichefiat i rcit la 450C). Se las s se rceasc la temperatura camerei.

n paralel se face i o diluie de1/10 a suspensiei din eprubeta cu tampon i se va depune 1ml pe fundul unei plci Petri care se toarn deasupra mediului geloz simpl (lichefiat i rcit la 450C). Se las s se rceasc la temperatura camerei. Tamponul se reintroduce n bulion. Incubarea la termostat 48 ore la 370C pentru plcile Petri, eventual 24 ore la temperatura camerei i 24 ore la 370C pentru eprubetele cu bulion.

3

Se numr coloniile dezvoltate pe mediul solid din plcile Petri i rezultatul se exprim n numr de microorganisme /cm2 de suprafa.

Din bulion se nsmneaz 0.1 ml pe mediul cu geloz snge, mediul hiperclorurat Chapmann i pe mediu cu lactoz i se incubeaz la termostat 24 ore la 370C, coloniile suspecte se vor izola pe medii corespunztoare i se vor identifica.

Metodele pentru studierea florei microbiene cutanate: 1. Metoda amprentelor se aplic pe tegument mediile solide turnate n plci Petri se aplic degetele minii (amprentare) pe geloz timp de 15 secunde. se terge tegumentul pe o anumit suprafa cu un tampon i nsmneaz pe

geloz. Mediul se termostateaz la 370C pentru 24 ore dup care se citesc plcile. 2. Metoda peliculelor adezive Se aplic pe tegument o folie adeziv pentru a detaa microorganismele aflate pe

tegument. Folia este aplicat pe fundul unei plci Petri cu faa de contact n sus peste care turnm mediul de cultur. Se incubeaz la 300C, 2-5 zile i se numr coloniile dezvoltate pe materialul adeziv.

1.2. Igiena i hainele de protecie Zonele desemnate pentru producerea preparatelor injectabile, a colirurilor sau

soluiilor otice au faciliti igienico-sanitare la intrare: papuci sterili, spun antiseptic, usctoare de mini cu aer cald. Pentru fabricarea acestor produse este necesar ca operatorii sa poarte haine sterile incluznd halat, pantaloni, cizme, glug, masc i mnui.

2. Materiile prime Pentru controlul contaminrii produselor farmaceutice i a mediului trebuie utilizate

materii prime cu caracteristici microbiologice adecvate. Materiile prime netratate ce provin dintr-o surs natural, de obicei, prezint o microflor extins i variat.

1. Produsele din surse animale ca gelatina, pulberea de tiroid, de pancreas pot fi contaminate cu patogeni animali.

Farmacopeea are ca cerin absena speciei Escherichia coli i a genului Salmonella pentru a folosi produsul la obinerea unui preparat farmaceutic.

2. Produse vegetale precum agarul, rubarba, amidonul, pot fi contaminate cu: microflora vegetal: Erwinia spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp., streptococi mucegaiuri:Cladosporium spp., Fusarium spp., Alternaria spp. levuri

4

n cazul contaminrii fecale sunt prezente E. coli i Salmonella 3. Materialele sintetice sunt de obicei necontaminate.

Produsele naturale cu grad mare de contaminare cu bacterii nepatogene se pot utiliza doar dac se sterilizeaz n prealabil. Sterilizarea se realizeaz prin caldur, filtrare, iradiere, recristalizare dintr-un solvent bactericid ca de exemplu alcoolul. Pentru produse uscate, acolo unde este posibil, se foloseste etilen oxidul.

n ceea ce privete controlul microbiologic al materiilor prime folosite pentru prepararea medicamentelor se vor face recoltri din diferitele loturi de substane, cele solide se vor solubiliza n ser fiziologic steril i se vor nsmna pe medii de cultur corespunztoare. Incubarea se va face att n condiii aerobe ct i anaerobe pentru a detecta prezena bacteriilor aerobe, anaerobe i a fungilor.

Dac pe mediile de cultur se dezvolt fungi sau bacterii saprofite, numrul total trebuie s se ncadreze ntr-un anumit interval de valori pentru a putea accepta lotul respectiv de materii prime n cadrul procesului tehnologic al medicamentului.

Dac sunt bacterii saprofite condiionat patogene, numrul microorganismelor respective trebuie s fie inferior anumitor valori standard.

n cazul izolrii bacteriilor Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus (saprofii condiionat patogeni) sau a Salmonella spp. (patogen) lotul de materie prim corespunztor trebuie exclus din sistemul de producie.

3. Ambalarea La finalul procesului produsele farmaceutice se ambaleaz pentru protejarea

produsului i pentru a preveni ptrunderea microorganismelor sau a umezelii. Microflora de pe amblaj depinde de compoziie i de condiiile de stocare ale acestuia. n funcie de tipul de produs farmaceutic se determin dac este necesar sterilizarea

ambalajului. Containerele de sticl sunt sterile cand ies din cuptor dar se pot contamina n ncaperi

prafuite i de aceea se transport n cutii. Pot fi contaminate cu spori de Penicillium spp., Aspergillus sp. i bacterii Bacillus spp. Recipientele de sticl se spal i atunci cnd produsul este lichid sau semisolid se folosete i un dezinfectant.

Recipientele de plastic au un grad de contaminare redus i nu trebuie,n general, dezinfectate. Transportate n condiii necorespunztoare se pot contamina cu fungi.

Unele ambalaje folosite pentru materiile prime precum saci de hartie necptuii pot absorbi umezeala i pot fi deteriorate microbian i astfel contamineaz i coninutul. Din acest motiv se prefer sacii ctuii cu polietilen.

Ambalajele cu un numr sczut de microorganisme sunt acelea care au care au o suprafa neted impermeabil fr poroziti (celuloz, polietilen, polipropilen, foiele de metal i laminate).

Cartonul netratat conine: spori de mucegai de Cladosporium spp., Apergillus spp. i Penicillinum spp. bacterii precum Bacillus spp. i Micrococcus spp.

n cazul soluiilor injectabile i preparatelor oftalmice care sunt preparate n condiii de asepsie, dar nu sunt sterilizate n recipientul lor final, ambalajul trebuie sa fie sterilizat. Pentru fiole i flacoane se sterilizeaz prin cldur uscat la 1700C.

Recipientele i capacele sunt sterilizate la caldur umed sau prin sterilizare chimic sau iradiere.

Indiferent de tipul sterilizrii, procesul trebuie sa fie validat i trebuie stabilite punctele critice de control.

4. Cldirile 4.1. Perei i tavane

5

Mucegaiul este cea mai rspandita flor a pereilor i tavanelor. Speciile cele mai des ntlnite sunt : Cladosporium spp., Aspergillus spp. mai ales A.niger i A. flavus, Penicillinum spp. frecvent n cladirile slab aerisite, cu pereii vopsii.

Pentru a reduce creterea microbian pereii i tavanele trebuie sa fie netede, impermeabile i lavabile i aceste condiii se ndeplinesc prin placarea pereilor cu plastic laminat. n zonele cu umiditate ridicat se folosesc cramizile lefuite sau faian. Pentru eliminarea aburului este obligatorie ventilaia n tavan.

4.2. Podele i scurgeri (canale de scurgere) Pentru a minimaliza contaminarea microbian toate podelele trebuie sa fie uor de curat, impermeabile, cu suprafaa neted. n unele zone poate fi necesar ca podeaua s fie nclinat spre scurgere, mbinarea podea-perete trebuie sa fie acoperit. Se aplic o etaneizare rezistent n zonele n care se folosesc lichide de curat acide sau alcaline; dac acest aspect este neglijat, suprafaa se deniveleaz i devine poroas i este colonizat rapid de microorganisme.

Zonele n care se desfaoar operaiuni aseptice trebuie s aib obligatoriu un sistem de ventilare, aerisirea nu se va face pe ferestr.

5. Echipamentul Trebuie aplicate reguli pentru reducerea riscului de colonizare microbian a pieselor de echipament folosite pentru fabricarea sau pentru ambalarea produselor farmaceutice:

toate echipamentele trebuie sa fie uor de demontat toate suprafeele care vin n contact cu produsul trebuie s fie netede, fr coluri

ascuite i mbinri rotunjite sau acoperite trebuie sa existe uruburi cu filetul exterior uor accesibil pentru curare mufele de cuplare de la toate conductele i valvele trebuie s se poat scoate

separat i cura lamele de la agitator i cuva de la cuptor, de preferat, trebuie s formeze o singur

pies i s fie accesibile pentru curat; dac lamele sunt prinse de cuva, produsul fabricat poate rmne ntre lame i cuv i poate constitui suport pentru dezvoltarea microorganismelor

se prefer dispozitivele de etaneizare mecanic pentru ambalat cutii deoarece ambalajul este greu de sterilizat

5.1. Curarea Agentul ales rebuie s fie potrivit cu suprafaa de curare i s nu fie coroziv, s ndeprteze produsul fr a lsa reziduuri, s fie compatibil cu rezerva de ap. Se pot folosi simultan ageni de curare i sterilizare, caz n care agenii trebuie s fie compatibili.

5.2. Dezinfecia i sterilizarea Echipamentul poate fi sterilizat sau dezinfectat la cald, chimic, sau combinaie ntre

cele dou proceduri. Multe rezervoare, eprubete, piesele mici de echipament pot fi autoclavate( important

ca aburul s ajung pe toate suprafeele lor. Echipamentul folosit la fabricarea i ambalarea pudrelor este sterilizat prin

cldur uscat. Dezinfectanii chimici uzuali conin hipoclorit de sodiu. Ca metod de dezinfecie poate fi utilizat scufundarea total a obiectelor mici sau

pulverizarea suprafeelor interioare a echipamentelor mai mari. 5.3. Verificrile microbiene Pentru validarea controlului se testeaz o mostr de ap final de splare pe o plac

Petri cu agar nutritiv.Pentru testare se poate folosi i un tampon fabricat fie din bumbac steril sau din alginat de calciu. Alginatul de calciu este folosit cu un diluant ce conine 1%

6

hexametafosfat de sodiu care dizolv tamponul i elibereaz organismele adunate de pe echipament; aceste organisme pot fi apoi acoperite cu geloz sau pot fi folosite metode alternative de evaluare. Se pot utiliza metode de detecie rapid a microorganismelor.