contaminanti listeria.docx

Facultatea de inginerie alimentaraProiect la contaminanti ai produselor alimentare

2 BIBLIOGRAFIE SELECTIVA

IMPLICAŢIILE BACTERIILOR DIN GENUl LISTERIA ÎN PRODUCEREA TOXIINFECŢIILOR ALIMENTARE

1. Listeria monocytogenes

1.1. Caractere generale Listeriile sunt bacterii Gram pozitive nesporogene şi neacidorezistente.În trecut erau clasificate în genul „Listerella”. Numele generic a fost schimbatîn 1940 în Listeria. În multe privinţe sunt similare cu genul Brochothrix.Ambele genuri sunt pozitive la testul catalazei şi au tendinţa să se asociezeîn natură cu bacteriile din genul Lactobacillus. Toate cele 3 genuri producacid lactic din glucoză şi alte zaharuri fermentescibile,dar spre deosebire deListeria şi Brochotrix, lactabacilii nu produc catalază. O perioadă de timp listeriile au fost considerate înrudite cubacteriile corineforme şi din acest motiv au fost clasificate în familiaCorynebacteriaceae, însă acum este clar că sunt mai apropiate de bacteriiledin genurile Bacillus, Lactobacillus şi Streptococcus. Din punct de vedereal RNA-ului ribozomal 16S, Listeria se apropie de Brochothrix, iar acestegenuri împreună cu Staphylococcus şi Kurthia ocupă poziţia dintre grupulBacillus şi Lactobacillus/Streptococcus în cadrul încrengăturii Clostridium-Lactobacillus-Bacillus. Transferurile genetice au loc între Listeria, Bacillus, Stafilococcus,iar reacţiile imunologice încrucişate apar între Listeria, Streptococcus,Staphylococcus şi Lactobacillus. Cu toate că Erysipelothrix intră în cadrulmicoplasmelor are în comun cu Listeria şi Brochothrix 338 de baze puriniceşi pirimidinice. Listeria spp. conţine acizi teichoici şi lipoteichonici, precum şi bacilii,stafilococ, streptococii şi lactobacilii, însă spre deosebire de acestia coloniile

1. Ryser, E.T., E.H. Marth, and M.P. Doyle. 1985. Survival of Listeria monocytogenes during manufacture and storage of cottage cheese. J. Food Protect. 48:746-750.2. Schmidt. U., H.P.R. Seeliger, E. Glenn, B. Langer, and L. Leistner. 1988. Listerienfunde in rohen Fleischcrzeugmsscn Fleischwirtsch. 68:1313-1316.3. Seeliger, H.P.R., and K Holme. 1979. Serotyping of Listeria monocytogenes ami related species. Meth. Microbiol. 13:31^19.4. Shelef, L.A. 1989. Survival of Listeria monocytogenes in ground beef or liver during storage at 4” and 25 C. J. Food Protect. 52:379-383.5. Simona Ivana, 2002 – Bacteriologie veterinară specială (Ed. Ceres, Bucureşti; 460 pagini), ISBN: 973-40-0568-56. Simona Ivana, 2005 – Bacteriologie generală (Ed. Ştiinţelor medicale, Bucureşti; 250 pagini), ISBN: 973-86485-7-27. Simona Ivana, 2006 – Tratat de bacteriologie medical-veterinară şi introducere în micologie (Ed. Ştiinţelor medicale, Bucureşti;768 pagini), ISBN (10) 973- 86571-5-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-18. Simona Ivana, 2007 – Manual de microbiologia alimentelor (Ed. Ştiinţelor medicale, Bucureşti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-79. Simona Ivana, 2007 – Microbiologie medicală – veterinară, Vol. I (Ed. Ştiinţelor medicale, Bucureşti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-610. Simona Ivana, 2007 – Microbiologie medicală – veterinară, Vol. II (Ed. Ştiinţelor medicale, Bucureşti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3.11. Simona Ivana, 2008, Microbiologia alimentelor, Ed. Orizonturi, ISBN: 978- 973-736-090-812. Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. Orizonturi, ISBN: 978-973-736-089-213. Singh, S.P., B.L. Moore, and l.H. Siddique. 1981. Purification and further characterization of phenol extract from Listeria monocytogenes. Am. J. Vet. Res. 42:1266-1268.14. Sizmur, K., and C.W. Walker. 1988. Listeria in prepackaged salads. Lancet 1:1167.


produse de listerii produc o irizaţie albastră verzuie în lumina oblică. În prezent genul Listeria cuprinde 7 specii. Fostul Listeria murray afost combinat cu Listeria grayi. Se poate observa din că cele 2 specii ocupăo poziţie depărtată de celelalte 5. Listeria ivanovii conţine 2 subspecii:ivanovii si londoniensis. Prima se diferenţiază de cea de-a doua prinabilitatea sa de a fermenta riboza şi incapacitatea de a fermenta N-acetilbeta D manozamina. Folosind reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) bazată pe tehnicilede identificare a DNA-ului, s-a dovedit că Listeria innocua şi Listeriawelshimeri sunt înrudite, iar Listeria grayi este omogenă şi se înrudeşte înmod clar cu celelalte 5 specii. Acizii teichoici tip Poly (ribitolfosfat), suntprincipalii polimeri din peretele celular la Listeria spp. Acidul lipoteichoicde la Listeria grayi se separă tot mai mult de celelalte specii prin faptul căprezintă acid lipoteichoic modificat. Se pare că acizii teichoici sunt recunoscuţi de bacteriofagi ca liganziai peretelui celular. Testul CAMP (Christie-Atkins-Munch-Petersen) este considerat demulţi cercetători drept test definitiv pentru Listeria monocytogenes. Un izolat care este CAMP pozitiv cu Stapylococcus aureus sau Rco.equi trebuie considerat ca izolat prezumtiv de Lis. monocytogenes, dar nuneapărat virulent. Stimularea hemolizei în prezenţa lui Staphylococcus aureus se pare căse datorează unei fosfolipaze C, fosfofatidilinozitol specific sau fosfatidil-colin-specific de la Lis. monocytogenes şi a unei sfingomielinizare de laStaphylococcus aureus.

1.2. Istoric Listeria monocytogenes a fost identificată pentru prima dată datorităunui focar infecţios spontan la iepurii şi cobaii de laborator, de Murrayşi colab. săi în 1924, la Cambridge (Anglia). Numele de monocytogenesatribuit speciei s-a datorat leucocitozei marcate cu mononucleare prezentăla aceste animale. În Africa de Sud, în 1927, Pirie a izolat aceeaşi bacteriede la gerbili infectaţi şi a denumit-o Listerella, după chirurgul şi pionierulantisepsiei, lordul Lister. Din motive taxonomice, denumirea generică a fostschimbată în 1940 în Listeria. În Noua Zeelandă, Gill este creditat cu primaizolare a Lis. monocytogenes de la un animal domestic infectat, el descriindşi o encefalită ovină „cu mişcări în menaj”. În 1929, în Danemarca, Nyfeldt a izolat Lis. monocytogenes de la om,din hemoculturile unor persoane cu o infecţie asemănătoare mononucleozei



(o formă rară de manifestare a bolii), iar Burn, în 1936, în Statele Uniteal Americii, a stabilit listerioza ca fiind o cauză de infecţie în perioadaperinatală şi, de asemenea, de meningită la adulţi. Înainte de 1926 au existatdescrieri ale unor boli care probabil au fost listerioza; într-adevăr, un izolat„difteroid” din lichidul cefalorahidian al unui soldat, în 1919, la Paris, a fostulterior identificat ca fiind Lis. monocytogenes. În cursul anilor 1980, creşterea numărului de cazuri de listeriozaumană şi animală în mai multe ţări (inclusiv Marea Britanie), împreunăcu o serie de toxiinfecţii alimentare in America de Nord şi Europa (tabelul5.1) au dus la reînnoirea interesului profesional faţă de boală şi la alarmareapublicului.

Tabelul 1.1 Episoade de listerioza umană cu transmitere alimentară AnNumăr de cazuriAliment implicatŢară SUA197620? Salată crudă Noua Zeelandă198022? Scoici sau peşte crud Canada198141Salată de varză crudă SUA198349? Lapte SUA1985142Brânză proaspătă Elveţia1983-7122Brânză proaspătă UK1987-9>350Pateu SUA19892? Creveţi Australia19909Pateu Australia19814Midii afumate Noua Zeelandă19924Midii afumate Franţa1992279Limbă de porc în aspic Franţa199339Tocătură de porc conservată Franţa199533Brânză topită ? Indică asocierea epidemiologică fără izolarea tulpinii implicate dinalimentul specificat.

1.3. Taxonomie

Familia listeriaceae

Cuprinde două genuri, şi anume: Listeria şi Brachothrix (J.P. Euzéby,2006).



genulListeria

Erysipelothrix

Grupa bacililor Gram pozitivi,nesporogeni, aerobi sau facultativ anaerobi Corynebacterium

Arcanobacterium

Actinomyces

Actinobaculum

Tabelul 1.2 SpeciaLis. monocytogenesErs. rhusiopathiaeErs. tonsillarumErs. inopinataCor. pseudotuberculosisCor. bovisCor. diphteriaeAbc. pyogenesAct. bovisAct. israeliiAbl. suis

Genul Listeria cuprinde şapte specii: Lis. denitrificans (Jonesiadenitrificans), Lis. grayi (Lis. murrayi), Lis. innocua, Lis. ivanovii, cu subsp.ivanovii şi londoniensis, Lis. monocytogenes, Lis. seeligeri, Lis. welshimeri(după Bergey’s Manual of systematic Bacteriology, 2nd Edition, 2004). Speciile de listerii au fost definite pe baza studiilor de hibridare, deelectroforeză enzimatică multiloculară şi de secvenţiere a RNAr 16S. Între tulpinile de Lis. monocytogenes electroforeza enzimaticămultiloculară şi secvenţierea genelor specifice conturează două subliniigenetice, care se suprapun serovarurilor 1/2b, 3b şi 4b şi, respectiv, 1/2a,1/2c, 3a şi 3c. Majoritatea speciilor sunt comensale sau saprofite, în afară de Lis.monocytogenes care este patogenă atât pentru animale cât şi pentru om.

1.4. Morfologie

Bacterie polimorfă, predominant bacilară (bacili scurţi, drepţi sauîncurbaţi), dar şi cu forme cocobacilare, cocoide sau filamentoase (lavariantele R) cu dimensiuni de 0,5/0,5-2µ. Este necapsulogenă, nesporogenă, imobilă. În culturile incubate latemperaturi sub 35°C sunt mobili, având 4-5 flageli dispuşi peritrich, iarprin cultivare la 37-46°C devin imobili sau monoflagelaţi. În prelevatele patologice, listeriile apar fie extracelular, fie fagocitate,ceea ce constituie o probă certă în diagnosticul listeriozei. În frotiurile efectuate direct din lichidul cefalorahidian se pot observacocobacili, Gram pozitivi, izolaţi în perechi sau în lanţuri scurte. În culturile tinere, incubate la 35-37°C, domină formele scurte,cocobacilare, iar în culturile vechi formele polimorfe, apărând deseori şi


6 BIBLIOGRAFIE SELECTIVAforme filamentoase lungi de 6-20µ asemănătoare lactobacililor. Sunt Gram pozitivi, dar pot deveni Gram negativi în culturile vechi,sau printr-o decolorare prelungită de 3-5 minute, putând fi consideraţi Gramlabili. În culturile efectuate din produse patologice cu floră mixtă, Lis.monocytogenes se aseamănă foarte mult din punct de vedere morfologic şicultural cu bacilul rujetului. Conţinutul în G+C al DNA-ului este de 36-42mol%. Dimensiunea cromozomului Lis. monocytogenes a fost estimată laaproximativ 3150 kb, fiind stabilită harta fizică şi genetică (prin utilizareaelectroforezei în gel), pe care au fost localizate mai multe gene. Geneleimplicate în patogeenză sunt aproape toate grupate pe un singur locus. La Lis. monocytogenes au fost introduşi şi exprimaţi transpozonii Tn1545, Tn916 şi Tn917 (şi derivaţii lor), care s-au dovedit instrumente extremde utile pentru înţelegerea virulenţei acestei bacterii. Un transpozon foarteasemănător cu Tn917 (denumit Tn5422) a fost recunoscut în plasmidelerecoltate de la Lis. monocytogenes, care codifică de asemenea rezistenţa lacadmiu. La unele tulpini de Lis. monocytogenes şi la alte specii de Listeriaa fost detectat DNA-ul plasmidic, care a fost asociat cu rezistenţa la cadmiu.Genele plasmidice ale rezistenţei la cadmiu prezintă un grad înalt desimilaritate cu rezistenţa la cadmiu a Staphylococcus aureus. Deşi rareori, afost observată rezistenţa, codificată de plasmide, numai faţă de tetraciclină,ca şi multirezistenţa la cloramfenicol, eritromicină, streptomicină şitetraciclină. S-a demonstrat transferul plasmidelor listerice native, nu numaiîntre speciile de Listeria, ci şi către alte specii bacteriene, incluzând Bacillussubtilis, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae şi Staphylococcusaureus. Fagii lizogeni sunt frecvent purtaţi de Listeria şi sunt în general similarimorfologic, cu capete izometrice şi cozi lungi, necontractile, corespunzândfamiliilor Myoviridae sau Styloviridae. Genomul fagic este reprezentat deun DNA dublu catenar linear de 35-42 kb. Proprietăţile litice ale seturilor defagi au fost utilizate pentru subtiparea Lis. monocytogenes. Ca şi utilizarea mutagenezei cu transpozoni, experimentele decomplementare a plasmidelor, împreună cu studiul comportamentului Lis.monocytogenes în culturi de ţesuturi de mamifere şi în modele pe şoareciinfectaţi experimental, au dus la o mai bună înţelegere a genelor implicateîn virulenţa acestui microorganism. De asemenea, în analiza acestor bacteriiau fost aplicate, cu mult succes, tehnici de generare a mutaţiilor punctiformeprin schimb alelic, de introducere de material genetic prin electroporozăşi de exprimare a genelor Lis. monocytogenes la Lis. innocua şi Bacillus



subtilis.

1.5. Condiţii de cultivare şi caractere culturale

Listeriile sunt bacterii facultativ anaerobe şi se cultivă bine pe mediiuzuale între 0 şi 45°C, optim la 20-37°C. Uneori necesită suplimentareamediilor cu sânge, lichid de ascită sau glucoză. Izolarea listeriilor din materialele patologice, se realizează deseoridificil, necesitând medii selective sau de îmbogăţire cum ar fi: agarul cutripaflavină, acid nalidixic şi ser; agar cu acridină şi acid nalidixic. Uneori,pentru izolare este necesară „îmbogăţirea la rece”, care se realizeazăprin păstrarea produsului patologic în bulion triptază, la 4°C, timp de 4săptămâni, cu subcultivare din 4 în 4 zile pe geloză sânge şi incubare la37°C în atmosferă cu 10% dioxid de carbon. În bulion peptonat produce un aspect uniform, iar în bulion glucozatun aspect floconos. După o incubare prelungită formează un depozit densşi aderent caracteristic, care se ridică în mediu, după agitare, sub formă de„tirbuşon”. Pe agarul glucozat sau triptozat formează colonii de mărimi diferite,de formă rotundă, de tip S, uşor bombate, transparente, cu aspect caracteris-tic de „picături de rouă”. Centrul lor poate avea un aspect cristalin sticlos.Prezintă o consistenţă apoasă, iar dacă sunt examinate în lumină oblică, la45 de grade, apar cu irizaţii bleu-verzui. Coloniile variantelor L sunt mai mari, turtite, cu centrul opac şi cumarginile neregulate, friabile, greu emulsionabile. Pe agar cu 5% sânge de berbec, iepure, cal, bou sau om, coloniile deLis. monocytogenes apar înconjurate de o zonă îngustă de beta hemolizădifuză. Culturile de pe medii solide degajă un miros caracteristic de „lapteacidulat”. În mediile semisolide (agar 3‰), după însămânţarea bacteriei prinînţeparea mediului în profunzime şi incubarea la 37°C, aceasta creşte subforma unei „umbrele” la 3-5 milimetri de suprafaţa agarului, dovedind astfelo mobilitate marcantă. Cerinţele nutriţionale ale listeriei sunt tipice bacteriilor Gram pozitive.Ele se dezvoltă bine pe medii cum ar fi infuzia de cord-creier, soia cutripticază şi cu triptoză. Au nevoie pentru creştere de cel puţin 4 vitamineB: biotina, riboflavina, tiamina şi acidul tioctic (acid alfa lipoic; factorde creştere pentru unele bacterii şi protozoare) şi de aminoacizi: cisteina,glutamina, izoleucina, leucina, valina.



Glucoza favorizează creşterea tuturor speciilor prin producerea deacid lactic. Toate speciile folosesc glucoză pe calea Embden-Meyerhof ca şimajoritatea enterococilor. Listeria este capabilă să hidrolizeze esculina şi să crească în prezentăde bilă10 sau 40% şi 10% NaCl,0,025% acetat şi 0,04% telurit de potasiu;nu creşte în prezenţa azidurii de sodiu 0,02%. Listeriile posedă o hidroliază pentru sărurile biliare fiind astfel capabilăsă colonizeze vezica biliară. Se dezvoltă pe agarul Mac Conkey. Cu toate căfierul este important pentru creşterea în vivo Lis. monocytogenes nu posedăcomponenţi de legare a fierului. Îşi face rost de acesta prin mobilizareareductivă a fierului liber care se leagă de receptorii de suprafaţă.1.6. Proprietăţi biochimice

Produce catalază, nu produce oxidază, hidrogen sulfurat şi niciindol. Pe agar sânge produce beta-hemoliză, ceea ce o diferenţiază de Lis.innocua. Testul CAMP poate evidenţia clar caracterele hemolitice, prinînsămânţarea lui Staphylococcus aureus sau Rhodococcus equi sub formă destriuri într-o singură direcţie pe placa cu agar sânge, iar tulpinile de Listeriaperpendicular faţă de acestea, fără a le atinge. Hemoliza va deveni maiexacerbată în apropierea striului de Stp. aureus pentru Lis. monocytogenes,iar în apropierea striului de Rco. equi, hemoliza va fi mai accentuată pentruLis. ivanovii. Testul CAMP clasic poate fi modificat, prin utilizarea unuidisc impregnat cu beta lizină stafilococică. Lis. monocytogenes produce, de regulă, acid din L-ramnoză şi alfa-metil-D-monozid. Efectul pH-ului: Cu toate că listeriile cresc cel mai bine la un pH între 6 şi 8,existăunele specii/tipuri care supravieţuiesc la un pH cuprins între 4,1 si 9,6 latemperaturi de 1-45°C. În general minimul de pH necesar pentru dezvoltarea unei bacteriidepinde de temperatura de incubaţie, compoziţia nutritivă a substratului,activitatea apei şi de prezenţa şi cantitatea de NaCl şi alte săruri şiinhibitori. Creşterea lui Lis. monocytogenes în mediile de cultură a fost obser-vată la un pH de 4,4 în mai puţin de 7 zile la 30°C; la pH=4,5 în triptoză la19°C şi la un pH 4,66 în 60 de zile la 30°C. În primul studiu creşterea la pH



4,5 a apărut la 20°C în 14 zile şi la pH 5,23 la 4°C. Dezvoltarea la pH 4,5a fost crescută de restricţia de oxigen. În cel de al treilea studiu creşterea afost observată la un pH de 4,66 în 60 de zile la 30°C. Bacteria s-a dezvoltatpană la temperatura de 10°C la un pH 4,83. La 5°C şi un pH de 5,13 nu s-aînregistrat nici o creştere. Într-un alt studiu, 4 tulpini de Lis. monocytogenes au crescut la unpH de 4,5 după 30 de zile într-un mediu de cultură incubat la 30°C nefiindobservată nici o creştere la pH 4 sau mai mic. Valorile de pH de 3,8-4 s-adovedit a fi mai distructive decât cele de 4,2-5 în serum de portocale la30°C, 5 zile.

Efectul temperaturii: Temperatura minimă necesară pentru creşterea a 78 de tipuri de Lis.monocytogenes pe agar triptic de soia a fost de 1,1 ± 0,3°C cu o marja de0,5-3°C. Două tulpini au crescut la 0,5°C şi 8 au crescut la sub 0,8°C în 10zile la un incubator cu gradient continuu de temperatură. Într-un alt studiu pe 22 de tulpini temperatura minimă de creştere afost de 1,7-3°C. Faptul că tulpinile de Listeria monocytogenes au avut otemperatură minimă de creştere cu 0,6°C mai mică decât celelalte specii, ausugerat cercetătorilor că hemoliza poate favoriza creşterea şi supravieţuirealui Listeria monocytogenes în mediile reci. Serovarurile 1/2a,1/2b si 4b aucrescut mai lent la 3°C decât cele cu antigenele 01.Temperatura maximă decreştere a listeriilor este de 45°C.

1.7. Sensibilitatea faţă de factorii de mediu

Rezistenţa listeriilor în mediile naturale este remarcabilă, supravieţuindmai mult de 2 ani în siloz sau în sol. Deşi sunt bacterii nesporogene,supravieţuiesc timp de 201-295 zile în sol, 346-750 de zile în apelestătătoare, 977 de zile în fecale. La temperatura de 65°C rezistă 10 minute.În mediile de cultură optime, listeriile au putut fi reizolate după 21 de ani.Larga răspândire a genului, ca şi capacitatea sa de a supravieţui pe suprafeţeuscate şi umede favorizează contaminarea după procesarea alimentelor, princontactul cu produsele crude sau cu mediul din fabrică. Antibioticele cele mai active faţă de listerii sunt ampicilina, tetracicli-nele, fiind rezistente la streptomicină şi polimixina B. Factorii de mediu: Listeriile sunt foarte răspândite în natură putând fi şi găsite în vegetaţiaîn descompunere, în sol, fecale animale, deşeuri şi apă. În general este de



aşteptat să se găsească împreună cu speciile din genul Brochothrix (bacteriede acid lactic) şi unele specii de bacterii corineforme. Într-un studiu efectuat în Scoţia pe probe de fecale de pescăruş, ciorişi silozuri, numărul cel mai mare de listerii a fost găsit la pescăruşii hrăniţicu deşeuri de canalizare, iar numărul cel mai mic a fost găsit în fecalele deciori. Cel mai frecvent întâlnite sunt speciile Listeria monocytogenes şiListeria innocua, iar cel mai rar Listeria seeligeri. Primele două bacteriiau fost găsite în proporţie de 44% în silozurile mucegăite şi de 22% însilozurile formate din baloţi mari. Microorganismul a fost găsit în silozul cu pH mai mare sau mai micde 4,5. Listeria monocytogenes a fost izolată din 8,4 pană la 44% din probeleluate din lanurile de cereale, păşuni, nămol, fecale animale, locurile dehrănire a faunei sălbatice şi din sursele apropiate. Lis. monocytogenes supravieţuieşte în sol peste 295 de zile. Dinapele de coastă ale Californiei, 62% din 37 de probe de apă dulce sau apăpuţin sărată şi 17,4% din 46 de probe de sediment au fost pozitive pentruLis. monocytogenes, dar nu a fost izolată nici o tulpină din 35 de probe destridii. Listeriile se pot asocia cu anumite produse din lapte precum si cu altebacterii producătoare de acid lactic.

Produse lactate: Protocolul de pasteurizare, temperatură scăzută, timp îndelungat(LTLT=low temperature, long-time) (62,8°C pentru 30 de minute) este şimai distructiv. Folosind tulpina Scott A (serovarul 4b din epidemia din Massachusetts)valorile D au variat de la 0,9 la 2,0 secunde cu valorile Z de 6,0-6,5°C. Tulpina F5069 pare a fi puţin mai rezistentă la temperatură decâtScott A,cu toate că Scott A a fost mai rezistentă din alte 3 tulpini evaluate,neincluzând F5069.

Produsele nonlactate: Pentru ouăle şi produsele din carne,valorile D sunt în general mai maridecât pentru lapte, fapt de altfel nesurprinzător, considerând efectul proteinelorşi lipidelor asupra rezistenţei termale asupra microorganismelor, Pentru o tulpină de Lis. monocytogenes izolată din carnea de puivalorile D la 70°C au fost de 6,6-8,4 secunde; cam aceleaşi valori s-auîntâlnit şi la carnea de vită.



Într-un studiu asupra cărnii de crab albastru tulpina Scott A la niveluride 107,a avut o valoare D de 2,68 minute şi o valoare Z de 8,4 °C, indicândastfel că protocolul de pasteurizare de 30 de min la 85°C este adecvat pentrudeclararea produsului ca fiind bun pentru consum. Dintre speciile de Listeria, Lis. monocytogenes este patogenă pentruom. Cu toate că şi Listeria ivanovii poate reproduce infecţia experimentală laşoarece este necesar un numar mult mai mare de germeni pentru a reproduceinfecţia (până la 106 celule nu au reprodus infecţia la şoarece). Listeriainnocua, Listeria welshimeri şi Listeria seeligeri sunt nepatogene,cu toatecă ultima produce o hemolizină numită listeriolizina O. Listeriolizina O(LLO) reprezintă cel mai important factor de virulenţă fiind asociat cu Lis.monocytogenes. Listeria monocytogenes este larg răspândită în mediu şi a fost izolatădin numeroase sedii, incluzând solul, apa, canalizarea şi materiile vegetaleîn descompunere (în special, nutreţul însilozat insuficient fermentat):viabilitatea sa este remarcabilă, supravieţuind mai mult de 2 ani în sol sausiloz. Se găseşte în excreţiile animalelor aparent sănătoase (şi, de asemenea,ale oamenilor), deşi starea de purtător intestinal este tranzitorie. Chiar cândeste prezentă în concentraţii ridicate în alimente, nu produce în generalalterarea sau contaminarea acestora. Larga răspândire a Lis. monocytogenesşi capacitatea sa de a supravieţui pe suprafeţe uscate şi umede favorizeazăcontaminarea după procesarea alimentelor, prin contactul cu produselecrude sau cu mediul din fabrică. Multe tipuri de alimente crude, prelucrate, gătite şi pregătite pentruconsum conţin Lis. monocytogenes, deşi la niveluri scăzute (10 germeni/g).Proprietăţile microorganismului favorizează transmiterea listeriozei pe calealimentară. Listeria monocytogenes creşte într-o gamă largă de alimentecu umiditate relativ ridicată (A > 0,95) şi la temperaturi foarte variabile(0-45°C). Creşterea se produce şi la temperaturi de refrigerare, deşi esterelativ lentă, cu un timp de dublare maxim de aproximativ 1 - 2 zile la 4°C.Multiplicarea în alimente este întrucâtva limitată la intervalul de pH de 5- 9, şi Lis. monocytogenes nu este suficient de rezistentă la căldură pentrua supravieţui pasteurizării laptelui. Toleranţa neobişnuită a bacteriei faţăde clorura de sodiu şi nitritul de sodiu, ca şi capacitatea de a se multiplica,deşi lent, în alimentele refrigerate, fac din Lis. monocytogenes o problemăspecială a contaminării post-procesare a alimentelor refrigerate.



1.8. Structura antigenică

Pe baza antigenelor somatice (I-XIV) si a celor flagelare (AE),Sealinger şi Danker au stabilit o schemă de clasificare antigenică împărţindgenul în 17 serotipuri (serovaruri). Lis. monocytogenes conţine 13 serovaruri din care câteva sunt comunecu Listeria innocua şi Listeria seeligeri. Lis. innocua este reprezentată de 2serovaruri fiind nepatogenă. Heterogenicitatea sporită a antigenelor din invelişul extern al listeriilorpoate fi corelată cu numărul mare de specii gazdă. Cel mai frecvent suntizolate tipurile ½ si 4. Inainte de 1960 în Europa şi Africa predomina tipul1, iar în America de Nord tipul 4, dar acest tipar pare să se fi schimbat.Astfel s-a demonstrat că serotipurile de listeria nu sunt legate de procesulpatologic al gazdei sau de originea geografică, iar acest lucru este confirmatde bacteriile izolate din hrană cu toate că serovarurile 1/2a şi 4b prezintăunele diferenţe geografice. În SUA şi Canada serovarul 4b reprezintă 65-80% din toate tulpinile. Epidemia din SUA din 1998-1999 s-a datorat consumului de cremwurştice conţineau o tulpină nouă de serovar 4b. Între 1 ianuarie şi 30 iunie 1996,60% din 2232 de izolate din cazuri umane în Anglia, au fost 4b şi 11, 17 şi4% fiind cauzate de 11/2a, 1/ab şi 1/2c. În general tulpinile 4b se asociază cuepidemiile, in timp ce tulpinile 1/2 se asociază cu produsele alimentare. Serovarul 1/2a a fost cel mai frecvent raportat în Europa de Est, Africade Vest, Germania centrală, Finlanda şi Suedia, pe când serovarurile 1/2a şi4b au fost raportate în Franţa şi Olanda în proporţii egale.

1.9. Patogenitatea Se datorează virulenţei precum şi producerii unei toxine cu efectletal pentru animalele de laborator şi acţiune citopatogenă asupra culturilorcelulare. Listeriile au un caracter neinvaziv, putându-se multiplica în enterocite(H. Răducănescu), de unde trec în sânge, iar bacteriemia primară este urmatăde localizări secundare (meninge, endocard, uterul gestant, glanda mamară,etc.). O modificare caracteristică o reprezintă mononucleoza, determinatăde o monogliceridă din membrana citoplasmatică a bacteriei. Apariţia infecţiei este favorizată de vârsta tânără, starea de gestaţie (laovine), furajarea necorespunzătoare, factorii zooigenici etc.



Listeriolizina O şi ivanolizina O: În general tulpinile patogene/virulente de Lis. monocytogenes producbeta hemolizină pe agarul cu sânge şi acid din ramnoză, dar nu din xiloză. Tulpinile a căror hemoliză poate fi amplificată cu exosubstanţaprepurificată sau direct prin folosirea culturii sunt potenţial patogene. Toate tulpinile virulente de Lis. monocytogenes produc o substanţăspecifică care este responsabilă de beta hemoliză asupra eritrocitelor şi dedistrugere a celulelor fagocitare care le înglobează şi anume listeriolizina O(LLO). Substanţa respectivă şi perfingolizina O (PFO) sunt omoloage custreptolizina O (SLO) şi pneumolizina (PLO). Listeriolizina O (LLO) are o greutate moleculara de 60000Da, fiindconstituită din 504 aminoacizi. Este produsă în faza de creştere exponenţială(cu niveluri maxime după 8-10 ore). LLO este sintetizată la 37°C în medii cu glucoză 0,2%. Sorbitolul înproporţie de 2% inhibă sinteza LLO la 35°C în condiţii aerobe sau anaerobede incubare. LLO a fost detectată la toate tulpinile de Lis. monocytogenes chiar şila unele tulpini nehemolitice. Nu a fost identificată la Lis. welshimeri şi Lis.grayi. Gena care codifică producerea ei este denumită hly şi este de originecromozomală. Lis. ivanovii şi Lis. seeligeri produc exotoxine tiol dependente caresunt similare, dar nu identice cu LLO. Lis. ivanovii produce cantităţi maride astfel de exotoxine. Ivanolizina O(ILO) este o citolizină tiol activată produsă de Lis.ivanovi. Antiserul obţinut de la Lis. ivanovi produce reacţii încrucişatecu cel de la Lis. monocytogenes şi SLO. Mutantele deficiente în ILO s-audovedit a fi avirulente pentru şoarece şi embrionii de găină. LLO purificată prezintă în comun cu SLO si PLO următoareleproprietaţi: 1) sunt activate de compuşii SH cum ar fi cisteina; 2) suntinhibate de cantităţi mici de colesterol şi prezintă situsuri antigenice comuneevidenţiate prin reacţii – cross-imunologice. Spre deosebire de SLO si PLO, LLO este activată la un pH de 5,5 darnu la un pH 7,0 ceea ce sugerează posibilitatea activitaţii sale în fagolizozomi(fagozomii macrofagelor). DL50 pentru şoarece este de aproximativ 0,8μg şi induce unrăspuns inflamator când este injectat intradermic. Se pare ca LLO şi altetoxine poreforming (formatoare de pori) au evoluat de la o singură genă



progenitoare. Când infecţia cu Lis. monocytogenes se produce pe cale orală, în modaparent colonizează tractul intestinal prin mecanisme neelucidate până înprezent. De la acest nivel invadează ţesuturile, inclusiv placenta la femeilegravide şi intră în torentul sangvin de unde ajunge la alte celule susceptibile.Ca patogen intracelular trebuie să patrundă şi să se replice în aceste celule.Invazia fagocitelor se produce în două faze prin pătrunderea listeriilor directîn fagozomi şi apoi de la aceştia în citoplasma fagocitului. Intrarea Lis. monocytogenes în celulele gazdă care nu au fost fagocitateeste facilitată de către proteinele de suprafaţă ale bacteriei, denumite în 1Aşi 1B. Prima are o greutate moleculară de 88 KDa, iar cea de-a doua de65KDa. Proteina 1A (internalina are ca receptor de suprafata F-cadherina),invadează culturile celulare, epiteliale, iar proteina în 1B invadează culturilede hepatocite de şoarece. Alte proteine intalnite la listerii sunt: 1) p60, oproteina de 60 kDa codificată de gena iap. Este secretată de toate speciilede listeria fiind implicate în producerea listeriilor în celulele gazdă; 2) Act A(90kDa) care este necesară pentru polimerizarea actinei şi permite mişcareaintracitoplasmatică a listeriilor în celulele gazdă; 3) Ami (90kDa) este obacterie lizină care se află pe suprafaţa lui Lis. monocytogenes. Dintr-un studiu de 150 de probe de hrană, Ami a fost prezentă in 149,în timp ce 283 din 300 de probe umane au conţinut această proteină. Toateproteinele pozitive au prezentat LLO, în 1B şi Act A. Lis. monocytogenes supravieţuieşte în interiorul macrofagelor trecândprin membranele fagolizozomale în citoplasmă (citosol) proces facilitat înparte de LLO. O dată ajunsă în citosol proteina de suprafaţă Act A (facilitează formareacozilor de actină) care propulsează microorganismul către membranacitoplasmatică. La nivelul membranei formează vacuole membranareduble. Cu ajutorul LLO şi a celor 2 fosfolipaze bacteriene, fosfolipaza Cfosfotidilinozitol-specific (codificată de plcA) şi fosfolipaza C (broad-rougephospholipase) (codificată de plcB) bacteriile sunt eliberate, iar procesulse repetă cu intrarea acestora în celulele gazdă adiacente. Ultimul procesapare dupa forţarea membranei în afară şi formarea unui filopodiu careeste absorbit de o celulă adiacentă, după care procesul se repetă. Astfelrăspândirea lui Lis. monocytogenes de la o celulă la alta are loc fară cabacteria să părăsească componentele interioare ale celulei. O parte interesantă, dar incomplet studiată a celulei de Lis.monocytogenes este acidul lipoteichoic (LTA) al membranei celulare carese aseamănă cu lipopolizaharidul (LPS) din membrana externă a bacteriilor



Gram negative. Datorită acestui factor de producere a monocitozei (monocytosis-producing-activity, MPA) s-a dat şi numele speciei: monocytogenes. Acidul lipoteichoic (LTA-lipoteichoic acid) reprezintă 6% dingreutatea uscată a celulei şi este asociat cu membrana plasmatică. Are ogreutate moleculară de 1000 Da, nu conţine aminoacizi sau carbohidraţi şistimulează numai celulele mononucleare. Prezintă toxicitate mică pentruţesuturi şi este inactivă serologic dar omoară macrofagele in vitro. S-ademonstrat că are următoarele proprietăţi comune cu LPS: este pirogenicăşi letală pentru iepure; produce o reacţie Schwartzman locală; conţine acizigraşi hidroxi acilaţi; produce o reacţie pozitivă cu reactivul LAL (Limulusameobocyte lysatereagent); conţine KDO (2-keto-3 deoxyoctonic acid);conţine heptoză. Reactivul LAL în cantitate de 1mg produce reacţie pozitivă,în timp ce LPS poate fi activat într-o cantitate de picograme. Lis. ivanovii este patogenă pentru oi la care produce avort, fiind unproducator prolific de hemoliză pe eritrocitele de oaie. Posedă o hemolizinălike-LLO (ILO), sfingomielinază şi lecitinază. Sfingomielinaza are ogreutate moleculară de 27000Da. În timp ce hemolizina like-LLO esteresponsabilă pentru producerea beta hemolizei pe eritrocitele de oaie, alfahemoliza produsă de Rco. equi se pare că este cauzată de două enzime.

1.10. Izolarea şi identificarea

Înainte de jumătatea anilor 1980, „îmbogăţirea la rece”, bazată pecapacitatea Listeriei de a depăşi prin creştere la temperaturi scăzute germeniicompetitivi, a fost utilizată în principal pentru izolarea selectivă. Totuşi,datorită lipsei de specificitate a acestei metode şi a faptului că este lentă(unii cercetători au incubat bulion până la 6 luni), procedurile au fost multîmbunătăţite. Au fost dezvoltate medii care utilizează diverşi agenţi selectivi,incluzând acriflavină, clorură de litiu, colistin, acid nalidixic, cicloheximidăşi polimixină. Aceste metode au lărgit capacitatea laboratoarelor demicrobiologie (în special, a celor implicate în controlul alimentelor) de aizola selectiv Listeria. Pentru detectarea listeriilor în alimente sunt din ce în ce mai multutilizate hibridizarea acizilor nucleici şi testele imunoenzimatice.

1.11. Listerioza umană

Listerioza este o infecţie oportunistă care afectează cel mai frecventpersoanele cu afecţiuni intercurente severe, bătrânii, femeile gravide,



fetuşii şi nou-născuţii. Cu toate acestea, pacienţii în afara acestor factoride risc pot fi de asemenea infectaţi. Indivizii cu cel mai mare risc de acontracta listerioza sunt bătrânii, cei imunocompromişi prin afecţiunilimfoproliferative (leucemii şi limfoame), persoanele cu alte neoplaziisau care primesc tratament imunosupresiv (corticosteroizi, ciclosporină,azatioprină, iradiere). Alte condiţii predispozante includ sindromulimunodeficitar dobândit (SIDA), alcoolismul, ficatul alcoolic, diabetul şipurtătorii de proteze cardiace valvulare sau proteze articulare. Femeile gravide au un risc crescut de a contracta listerioza, posibildatorită scăderii fiziologice a imunităţii, dar vor prezenta invariabil o formărelativ uşoară a bolii. Infecţia maternă poate disemina la făt, ducând fiela moarte intrauterină, fie la naşterea unui copil sever afectat în primelezile după naştere (infecţie neonatală cu debut precoce). De asemenea, nou-născuţii pot dezvolta septicemie cu debut tardiv, tipic la 10-12 zile dupănaştere. Listerioza afectează cel mai frecvent conţinutul uterului gravid,sistemul nervos central şi circulaţia. La persoanele negravide, listeriozase prezintă cel mai frecvent ca meningită (cu sau fără septicemie) sau casepticemie fără afectarea sistemului nervos central. Ultima formă a boliieste în general limitată la indivizii imunocompromişi şi are rareori focarede infecţie identificabile. Meningoencefalita şi encefalita listerică apar mairar. La femeia gravidă, listerioza este de cele mai multe ori recunoscută subforma unuia sau mai multor episoade pseudogripale autolimitate, în cursulsau în a doua jumătate a celui de-al doilea trimestru, deşi infecţia poateapărea pe toată durata sarcinii. Listerioza maternă se prezintă, de obicei, cufebră şi alte simptome nespecifice, deşi unele persoane pot fi asimptomatice.Meningita listeriană maternă şi infecţiile recurente la aceeaşi femeie încursul unor sarcini diferite sunt foarte rare.

1.12. Epidemiologie

Larga răspândire a Lis. monocytogenes asigură numeroase căi detransmitere a bolii atât la animale, cât şi la oameni. Deşi actualmente s-aacordat un mare interes transmiterii pe cale orală, acesta nu este singurulmod de transmitere. Vârful incidenţei listeriozei umane are loc cel mai adesea la sfârşitulverii şi începutul toamnei, din motive încă neînţelese. Listerioza animalăapare cel mai des primăvara, probabil nu numai din cauza fiziologiei şicondiţiei animalelor, ci şi datorită furajării deficitare. Incidenţa raportată a listeriozei umane variază în funcţie de ţară, de



la mai puţin de 1 la peste 7 cazuri la un milion de locuitori. Deşi acestecifre pot reflecta în parte diferenţe ale sistemelor de surpaveghere, elereprezintă probabil diferenţe reale ale incidenţei. Există diferenţe similareale incidenţei listeriozei animale între diferite regiuni: de exemplu, în MareaBritanie, listerioza ovinelor reprezintă o problemă deosebită în Scoţia şinordul Angliei. Aceste diferenţe pot fi datorate parţial capacităţii de a furajacorespunzător animalele. În 2006 au fost raportate 1628 cazuri în 27 de state, Malta şi Islandanu au raportat cazuri (Portugalia, Romania şi Liechtenstein nu au raportat).Danemarca (1,0 la 100.000), urmată de Finlanda (0,88 la 100.000) şiLuxemburg (0,85 la 100.000) au avut cea mai mare rată a notificărilor. Ratamedie a notificărilor a fost de 0,35 la 100.000 locuitori. Distribuţia pe grupe de vârstă şi sex Din 1612 cazuri raportate la care au fost disponibile informaţiile legatede vârstă, 55,8% au avut peste 65 ani şi această grupă de vârstă a avut ceamai mare rată a notificărilor de 1,2 la 100.000 locuitori. Cazurile de listeriozăla copii sub 4 ani au reprezentat 7%, constiduind a doua rată a incidenţei pegrupe de vârstă, cu 0,47 la 100.000. Cazuistica a fost relativ egal distribuităla cele 1617 cazuri la care sexul a fost raportat (0,3 la 100.000 la femei şi0,4 la 100.000 la bărbaţi).

Distribuţia pe grupe de vârstă a cazurilor de listerioză umană în EU şi EEA/EFTA în 2006 (n=1612 cazuri) (Centrul European Pentru Prevenirea şi Controlul Bolilor, 2008)

Sezonalitatea Cazurile de listerioză au fost mai rar raportate în primul trimestrual anului 2008 decât în restul anului. Cu toate acestea nu se poate discutadespre o evoluţie sezonieră a acestei boli.



Distribuţia sezonieră a cazurilor de listerioză umană în EU şi EEA/EFTA în 2006 (Centrul European Pentru Prevenirea şi Controlul Bolilor, 2008)

Analiza ratei notificărilor listeriozei în statele Uniunii Europene înperioada 2003-2006 scoate în evidenţă o creştere semnificativă a cazuisticii.Totuşi, aceste date trebuie analizate cu prudenţă întrucât interpretareadefiniţiei de caz şi sistemele de supraveghere specifică diferă în cadrulUniunii Europene de la un stat la altul. Majoritatea statelor raporteazăcă majoritatea cazurilor au origine domestică (59,7%) sau necunoscută(36,6%). În 2006, Republica Cehă raportează un focar grav în care au fostimplicate 78 de cazuri cu 13 morţi. Sursa acestui focar a fost brânza.

1.13. Transmiterea prin alimente

În prezent este general acceptat faptul că alimentele contaminatereprezintă principala cale de transmitere a acestei toxiinfecţii. Deşi diferitedin punct de vedere al constituenţilor şi al proceselor de preparare, alimenteleasociate cu transmiterea au următoarele aspecte comune: capacitatea de asusţine multiplicarea Lis. monocytogenes (conţinut relativ mare în apă şi pHaproape neutru); contaminare relativ mare (> 105/g) cu tulpina implicată;procesare cu perioadă de păstrare relativ extinsă; consum fără prepararesuplimentară. Datorită faptului că tabletele de lucernă sunt produse uscate, Lis.monocytogenes nu este capabilă să se dezvolte. Cu toate acestea, unul diningrediente (lucerna) avea proprietăţi similare celor descrise mai sus, în sensulcă înainte de uscare şi încapsulare era depozitată în condiţii de umiditate, încare apăreau deteriorarea şi posibil creşterea Lis. monocytogenes.



Perioada de incubaţie a infecţiei transmise alimentar variază largîntre indivizi, de la 1 la 90 zile, cu o medie de aproximativ 30 zile pentruinfecţia intrauterină. Nu se ştie dacă aceste diferenţe după ingestia orală suntdependente de doză sau de tulpină, sau dacă reflectă diferenţe necunoscuteîn susceptibilitatea gazdelor. Pe baza datelor de la un număr foarte micde cazuri, în alimentele consumate de pacienţi înainte de infecţie au fostgăsite nivele înalte de Lis. monocytogenes (103->107), sugerând că dozainfectantă a fost mare. Totuşi, este necesară multă precauţie, întrucât dozainfectantă variază probabil foarte mult de la individ la individ. În plus,alimentele suspecte sunt, în general, disponibile pentru examinare numaiperioade scurte de timp şi de aceea este mai probabil să fie examinate celede la pacienţi cu perioadă de incubaţie scurtă. Aceste observaţii, împreunăcu capacitatea Lis. monocytogenes de a se multiplica în alimente (chiar încondiţii ideale de depozitare) dovedesc că există dificultăţi considerabile înstabilirea unui nivel „sigur” de Lis. monocytogenes în alimente, în scopulelaborării unor reglementări. După cum s-a afirmat deja, Lis. monocytogenes este larg răspândităîn mediu, inclusiv în alimente, deşi în general este prezentă în număr mic.Acest aspect, împreună cu proprietăţile şi tipurile de alimente asociateinfecţiei susţin probabilitatea unei doze infectante mari în cazul infecţieialimentare. Au fost descrise episoade de listerioza umană implicând peste 100indivizi. Unele din acestea au continuat pe perioade lungi de timp, între6 luni şi 5 ani, ceea ce se explică probabil prin colonizarea pe termenlung a unui singur loc din mediul de prelucrare al alimentului, precum şiprin perioada de incubaţie lungă a unor pacienţi. Facilităţile din mediulde prelucrare a alimentelor contaminate cu Lis. monocytogenes au inclusechipamentul de prelucrare din lemn, rafturile metalice şi din lemn, curelelede transmisie poroase şi canalele de scurgere din pardoseală. S-a demonstratcă Listeria monocytogenes supravieţuieşte bine într-o varietate de medii încare se prelucrează alimente, în special în cele umede şi cu materii organiceşi că din aceste locuri se produce contaminarea în timpul prelucrării.

Tabelul 1.3.Cazuri sporadice de listerioza umană transmisă pe cale alimentară

Ţară

SUAAnglia

An19851986

Aliment implicatCârnăciori de curcanBrânză topită



Ţară

AngliaAngliaCanadaSUAFinlandaItaliaItaliaDanemarcaCanadaBelgiaItalia

An19881988198919891989198919891989198919891994

Aliment implicatBrânză topităPui prăjitTablete cu lucernaSalamCiuperci sărateSalamPeşteIcre de cod afumateBrânză topităFrişca proaspătă şi îngheţatăMăsline murate

O comparaţie între numărul de alimente ce conţin Lis. monocytogenesşi numărul cazurilor de listerioza a indicat că majoritatea alimentelorcontaminate (chiar cele asociate cu izbucniri epidemice) au o rată de atacfoarte mică. Unele tulpini de Lis. monocytogenes pot avea o patogenitatemai mare, dar bazele acesteia sunt puţin înţelese. Date fiind proprietăţile şi distribuţia Lis. monocytogenes, cazurilelegate de o sursă comună de infecţie pot avea o distribuţie foarte largă, atâttemporal, cât şi geografic. Unele episoade de listerioza de origine alimentarăau fost recunoscute în situaţii foarte neobişnuite şi este posibil ca, în pofidasistemelor de supraveghere naţionale şi internaţionale, sursa comună sărămână necunoscută.

1.14. Transmiterea listeriozei la animale Avortul şi septicemia animalelor nou-născute sunt în mod clar rezultatulinfecţiei intrauterine dobândite de la mamă şi există un paralelism întreacestea, avortul şi infecţia neonatală cu debut precoce la om. Septicemiamieilor (însoţită de meningită la unele animale) în primele câteva săptămânide viaţă a fost atribuită infecţiei ombilicale dobândite în cursul naşterii,posibil din solul sau alimentele contaminate: aceasta corespunde infecţieineonatale cu debut tardiv la om. Irita şi keratoconjunctivita apar de obicei în timpul iernii, la oile şibovinele hrănite cu siloz. Ele se pot produce prin introducerea directă în ochia hranei contaminate şi au fost asociate cu distribuţia furajului în jgheaburisau iesle situate la nivelul ochilor.



Ca şi în infecţia umană, se presupune că majoritatea cazurilor delisterioză animală sunt dobândite pe cale orală. La oi şi bovine există oasociere strânsă între alimentaţia cu siloz şi toate manifestările listeriozei,deşi unele cazuri apar şi când nu se foloseşte acest furaj. Cu toate acestea,mecanismul exact prin care alimentaţia cu siloz duce sau predispune lalisterioză este neclar. În condiţii normale, este imposibilă producereaacestui siloz lipsit de Listeria: germenul a fost izolat din siloz cu un pHmai mic de 4, deşi în număr foarte mic. Când se produce siloz de proastăcalitate, fără a se realiza condiţiile de pH scăzut şi anaerobioză, Listeriaproliferează şi se găseşte în număr mare. Calitatea slabă este adesea datoratăcalităţii proaste a plantelor sau contaminării cu sol şi fecale. Tehnologiaactuală de producere a silozului folosind prelate de polietilenă a dus la ocreştere corespunzătoare a listeriozei ovine în Marea Britanie. Deşi aceastămetodă este mai economică decât cele utilizate tradiţional, plantele sunt maipredispuse la alterare şi la creşterea listeriilor: un număr mare de germeni segăsesc în locurile unde s-au produs deteriorări ale prelatei sau la margineaacesteia. Incidenţa maximă a listeriozei animale în cursul primăverii poatereflecta o scădere a calităţii furajelor utilizate pentru hrană. Observaţia călisterioza este adesea asociată cu slaba calitate a furajelor, în care se găsesccantităţi mari de Lis. monocytogenes, sugerează că doza infectantă estemare. S-a sugerat că silozul ar putea avea un efect imunosupresor, darmecanismul nu a fost încă elucidat. Atât la oameni, cât şi la animale, majoritatea infecţiilor sunt probabilrezultatul ingestiei unor alimente sau furaje în care s-a produs proliferareaexcesivă a Lis. monocytogenes. Este neclar ce proporţie din toate tulpinile de Lis. monocytogenes şiLis. ivanovii prezente în mediu produc boala şi de ce Lis. ivanovii este atâtde rar patogenă pentru om. Deşi au fost identificate unele culturi nepatogenede Lis. monocytogenes, infecţia experimentală a animalelor (deşi în modelemai degrabă „nenaturale”) nu a indicat o variaţie foarte mare a virulenţei.Cu toate acestea, distribuţia „tipurilor” de Lis. monocytogenes printretulpinile izolate din mediu şi cele care produc boala este variabilă. Atât laoameni, cât şi la animale, proporţia tipurilor de Lis. monocytogenes diferăsemnificativ în funcţie de sindroamele produse. In plus, majoritatea tulpinilorresponsabile de episoadele aparent necorelate de listerioză umană transmisăpe cale alimentară au fost neaşteptat de asemănătoare. Semnificaţia acestortrei observaţii nu este clară; totuşi, ele pot reflecta adaptări ale tulpinilor(sau speciilor) la diferite nişe ecologice care afectează virulenţa. În afară de infecţia umană dobândită ca rezultat direct al îngrijirii



animalelor infectate sau prin hrana direct contaminată de la un animalinfectat (cum ar putea fi cazul laptelui de la un animal cu mastită listerică),conexiunile dintre listerioză umană şi animală, dacă există, sunt neclare.Analiza tulpinilor ce produc listerioză umană şi animală „sporadică” indicăo largă varietate de „tipuri” în ambele grupuri, care în general nu par să fieînrudite. Vârfurile sezoniere ale listeriozei umane şi animale nu coincid,sugerând, de asemenea, că între aceste două grupuri nu există relaţii cauzale.Acest fapt nu ar trebui poate să fie neaşteptat în cazul unui grup de patogenimarginali, care nu sunt probabil bine adaptaţi şi care sunt distribuiţi larg înmediu, cu multe tipuri diferite. Listeria monocytogenes şi Lis. ivanovii sunt membrii unui grup debacterii adaptate la medii saprofite din sol şi apă şi au adaptări suplimentarepentru supravieţuirea în mediul intracelular al eucariotelor. Modul deevoluţie a acestor factori suplimentari este neclar. Aceştia ar fi putut evoluapentru a permite supravieţuirea la mamifere sau la un grup foarte diferit deeucariote, cum ar fi protozoarele. La Centrul Naţional de Referinţă pentru Zoonoze din INCDMI„Cantacuzino” - Bucureşti au fost trimise, în perioada 2002-2006, pentruconfirmare/identificare, 30 tulpini ca suspiciuni Listeria spp. izolate dinproduse alimentare de origine animală. În studiul nostru s-au utilizat: - agar cu 5% sânge (defibrinat) de berbec; - trusă coloraţie Gram (violet de genţiană, Lügol, amestec alcool-acetonă, fuxină 1/10 preparată extemporaneu); - geloză moale 3‰ repartizată în tuburi 16/160 mm; - geloză 2% mediu înclinat, repartizat în tuburi 16/160mm; - medii lichide zaharate 1%, cu indicator albastru de bromtimol,conţinând glucoză, lactoză, maltoză, zaharoză, salicină, adonită, trehaloză,D-manită, D-manoză, L-ramnoză, D-xiloză; - tulpini test CAMP: Staphylococcus aureus şi Rhodococcus equi, - seruri hiperimune de iepure adsorbite Lis. monocytogenes la si 4b. S-au efectuat următoarele teste recomandate pe plan internaţional: 1. Însămânţarea tulpinilor pe mediul agar 5% sânge (defibrinat) deberbec, pentru obţinerea de colonii izolate; după termostatare peste noaptela 35-37°C s-a examinat aspectul morfocultural al coloniilor. 2. Însămânţarea agarului 2% mediu înclinat şi incubarea 48 ore la35-37°C, pentru examinarea culturii în lumină oblică şi observarea apariţieiirizaţiei bleu-verzuie. 3. Efectuarea de frotiuri din cultură pură, colorate după metoda



Gram şi examinate microscopic cu obiectiv 90 imersie. 4. Efectuarea testului mobilităţii, prin înţeparea în dublu a mediuluigeloză moale 3‰, incubare 24 ore la 35-37°C şi, în paralel, la temperaturacamerei, cu examinarea modului de creştere a culturii. 5. Efectuarea testului CAMP cu striu de Staphylococcus aureus şiRhodococcus equi, pentru a urmări apariţia beta-hemolizei. 6. Insămânţarea în medii lichide zaharate 1% - cu indicator albastrude bromtimol - pentru a urmări fermentarea carbohidraţilor, prin producereade acid după incubare 24 ore la 35-37°C 7. Serotiparea tulpinilor de Lis. monocytogenes prin reacţia deaglutinare cu seruri de iepure adsorbite 1a şi 4b.

Tabelul 1.4Tulpini de Listeria spp. Izolate din produse alimentare (nr./%)

Produs

An 2002 2003 2004 2005 2006Total tulpini

Produse din carne

NR. 7 - 111 726

%23,33 - 3,3336,6623,3386,66

Produse lactate

NR. 2 - - - 2 4

%6,66 - - -6,6613,33

Total tulpini

NR. 9 - 111 930

%30,0 - 3,3336,66 30,0 100

Tabelul 1.5 Apartenenţa la speciile listeria conform investigaţiilor efectuate (Nr. rezultate pozitive/%) Lis. monocytogenesLis.SpecieLis. innocua L. gray welshimeriserovar 1 a serovar 4b Test%%%% Nr.%Nr.Nr.Nr.Nr.

Beta-hemoliza

Testul S. aureusCAMP R. equi Mobilitatea Testul oxidazei Testul catalazei

7

7-7-7

23,33

23,33 -23,33 -23,33

-

-----

-

3,33 -3,33 -3,33

-

- - - -19

-

- - - -63,33

-

----1

-

- - - -3,33

-

----2

-

- - - -6,66



Tabelul 1.6 Apartenenţa la speciile listeria conform investigaţiilor efectuate (Nr. Rezultate pozitive / %) -------Lactoză2 6,66 - ------Zaharoză2 6,66 -Maltoză7 23,33 1 3,33 19 63,33 1 3,33 2 6,66 ---Trehaloză2 6,66 1 3,33 2 6,66 -Salicină7 23,33 1 3,33 19 63,33 1 3,33 2 6,66 -------D-Manită1 3,33 - -D-Manoză7 23,33 1 3,33 19 63,33 -2 6,66 -L-Ramnoză7 23,33 1 3,33 1 3,33 -1 3,33 -------D-Xiloză2 6,66 - -------L.m. 1a 7 23.33 - Identificare serologică -----1 3,33 -L.m. 4b - Total tulpini7 23,33 1 3,33 19 63,33 1 3,33 2 6,66

Tabelul 1.7Specii listeria izolate din produse alimentare (nr./%)

Specie

Produs Carne tocată Pastă mici Cârnati cal porcŢesutmuscular bovina

Slănină lucruCostiţă afumată

Spată porc

Carcasă pasăre

Caşcaval

Lapte praf

Lapte crud

Total tulpini

L.monocytogenes L.innocua L.grayserovar la serovar 4b %% Nr.%Nr.Nr.Nr. % 13,33-8 26,66 - 13,33--- 310,0-3 10,0- --1 3,33- --3 10,0- ii ii --1 3,33- 13,33---

-

-

-

-

-

7 23,33

-

1

-

-

-

1 3,33

3,33

1

-

1

-

1 3,33

3,33

3,33 -

-

-

-

-

1 3,33

L.welshimeri

Nr. - - - - -

--

-

-

-

2

-

2 6,66

6,66

%

19 63,33



În urma studiului efectuat în INCDMI Cantacuzino şi Facultatea deMedicină Veterinară, Bucureşti s-au desprins următoarele concluzii: 1. Confirmarea bacteriologică a genului Listeria s-a obţinut la toatecele 30 tulpini investigate. 2. Testele preliminare, cu caracter diferenţial în cadrul genului,au relevat caracteristicile morfoculturale, microscopice şi biochimice(producerea de acid din D-manoză şi L-ramnoză, fără a ataca D-manita şiD-xiloza ) ale Lis. monocytogenes la 8 tulpini. 3. Serotiparea, prin reacţia de aglutinare cu seruri de iepure adsorbite,a permis evidenţierea a 7 tulpini Lis. monocytogenes serovar 1a şi o tulpinăLis. monocytogenes serovar 4b, 19 tulpini au fost evidenţiate ca fiind Lis.innocua, 1 tulpină a fost identificată ca Lis. grayi, iar 2 tuplini ca Lis.welshimeri. 4. Lis. monocytogenes, specia tip a genului Listeria, condiţionat-patogenă pentru om şi animale, a fost întâlnită în produse de carne în cursde preparare sau netratate termic. De asemenea, 17 din cele 19 tulpiniidentificate ca Lis. innocua şi o tulpină Lis. grayi, nepatogene, au fostevidenţiate în preparatele de carne. 5. În produse lactate (caşcaval, lapte praf, lapte crud) au fostevidenţiate două tulpini Lis. innocua şi o tulpină Lis. welshimeri, probabilcontaminate în timpul procesării sau păstrării. 6. Listeriile pot proveni de la animale purtătoare de germeni sau potcoloniza diversele suprafeţe inerte, ori pot forma “biofilme” pe suprafaţaalimentelor în curs de procesare. 7. Lis. monocytogenes la, serotip frecvent întâlnit în România, undeboala are caracter sporadic, a fost relevat in produse de carne de provenienţăindigenă. 8. Lis. monocytogenes 4b, serotip răspândit în ţările Europeioccidentale şi America de Nord, unde boala poate evolua sub aspectepidemic, a fost prezent în produse de origine animală, import Italia. 9. Lis. innocua este considerată specie nepatogenă pentru om şianimale, ca şi Lis. grayi şi Lis. welshimeri. 10. Speciile de Listeria întâlnite în produse lactate provenite din laptepasteurizat sunt considerate ca germeni de contaminare din mediul extern. 11. Lis. monocytogenes are cel mai important potenţial patogen pentruom şi animale.



1.15. Toxiinfecţiile alimentare produse de Listeria monocytogenes

Pentru prima data Listeria monocytogenes fost descrisă în 1911 decătre Hiilphers, după care în 1923 Murray et. al. a facut o descoperire maiamănunţită a acestei bacterii. Primul caz uman de listerioză a fost raportat în 1929, boala având oevoluţie sporadică. Lis. monocytogenes este agentul etiologic cel mai desîntâlnit şi a fost izolat în Anglia şi Ţara Galilor în 98% din cazurile umaneşi 85% din cele animale. Lis. ivanovii a produs infecţia în 3 cazuri umane,iar Lis. seeligeri numai într-unul. Între 1986-1988 numărul de cazuri de listerioză umană a scăzut înAnglia şi Ţara Galilor. Rata de mortalitate la 558 de cazuri umane în MareaBritanie a fost de 46%. În perioada 1983-1987 au fost raportate 775 de cazuri în Ţara Galilorcu 219 (28%) morţi, fiind neabortigenă. Numărul de cazuri de listerioză la 1 milion de oameni în 1992 a fostîn Australia 2, Canada 2-4, Danemarca 4-5, Marea Britanie 2-3 şi în S.U.Ade 4. Numărul estimativ total de cazuri, în SUA, în 1993 a fost de 1092 cu248 de cazuri. Nu toate au fost de origine strict alimentară. În Belgia şi Olanda 10% din vacile sănatoase testate au fost purtătoarede listerii, iar în probele de fecale umane recoltate din diferite centre deprelucrarea hranei au fost pozitive 5%. În Marea Britanie, într-o perioadă de 18 luni, din 5000 de probe defecale analizate, 32 au ieşit pozitive. Infecţia încrucişată cu Lis. monocytogenes a fost observată în infecţiilecongenitale ale noilor născuţi, până la cei aparent sănătoşi. Listeria a fostizolată de la oameni sănătoşi în proporţie de 1% până la aproape de 15%. În cazul „fast-food”-urilor, carnea şi produsele din carne de pasărereprezintă principalele sursă de infecţie.

Mijloacele de apărare ale organismului: Rezistenţa organismului la patogenii intracelulari (virusuri, paraziţi,Listeria monocytogenes) este mediată de celulele T (limfocite care seformează în măduva osoasă şi a căror maturare are loc în timus). Spre deosebire de celulele B prin care se realizează imunitatea umorală,celulele T activate acţionează direct asupra non-selfului. Atunci când un patogen pătrunde în interiorul celulei gazdă acesta numai poate fi distrus de către anticorpii circulanţi, însă prezenţa patogenului



este semnalată de schimbările structurale de la nivelul celulei parazitate. Celulele T sunt implicate în distrugerea celulei gazdă care nu mai esterecunoscută ca self. Macrofagele leagă şi „prezintă” Lis. monocytogenes celulelor T, înaşa fel încât să fie recunoscute ca non-self. Atunci când celulele T atacăbacteriile, ele se măresc în dimensiuni şi formează clone specifice antigenelorrespective. Celulele T pentru a fi activate secretă interleukina-1 (IL-1), iarapoi se multiplică şi se diferenţiază pentru a forma diverse substraturi. Celemai importante subseturi de celule T sunt cele helper sau CD4(L3T4+)si cele killer CD8(Lyt2+). Celulele TCD4 reacţionează cu antigenul dupăproducerea de linfokine (citokine): IL-1, IL-2, IL-6 sau gamma interferonşi altele. Gamma interferonul (a cărui producţie este asistată de factorul denecroză al tumorilor induce producerea de receptori IL-2 pe monocite. De asemenea IL-2 măreşte activarea celulelor Killer care pot lizamacrofagele infectate. IL-2 administrat la şoarece într-o cantitate mai mică de 0,6 micrograme/şoarece, măreşte rezistenţa acestora la Lis. monocytogenes. Gamma interferonul activează macrofagele şi celulele killer. Acesteadin urmă lizează macrofagele infectate. Atât CD4 cât şi CD8 sunt stimulatede Lis. monocytogenes activând macrofagele (prin producţia lor de gammainterferon) şi contribuind la rezistenţa la listerioză. Se pare că infecţia indusăexperimental la şoarece este asemănătoare cu cea de la om. O dată cu înglobarea bacteriei de către macrofage acestea secretă lalocul infecţiei un factor de creştere a monocitopoezei (factor-increasing-monocytopoiesis) (FIM). Acesta este transportat în măduva osoasă undestimulează producerea de alte macrofage. Numai listeriile viabile pot inducerăspunsul celulelor T şi imunitatea contra listeriozei. LLO reprezintă factorulde virulenţă la Lis. monocytogenes care stimulează reacţia celulelor T şieste o proteina termosensibilă. Subsetul celulelor (CD8) pare a fi principalulcomponent responsabil de imunitatea anti-listeria, stimulând producereade citokine de către macrofage; imunitatea pasivă poate fi dobândită printransferul subsetului de celule CD8. Acţiunea Lis. monocytogenes relevă rolul multifuncţional allimfokinelor în imunitatea celulelor T şi importanţa critică aparentă afactorului primar de virulenţă LLO al acestei bacterii. Ceea ce face cagazdele imunocompromise să fie mult mai susceptibile la acest tip deinfecţie este efectul agenţilor imunosupresori asupra sistemului de celule T.Pe baza rolului jucat de limfokine în apărarea organismului au fost sugerateunele terapii posibile, dar efectele acestora la om sunt încă neclare.



Rezistenţa bacteriei în alimente: Datorită faptului că Lis. monocytogenes rezistă la temperaturi cuprinseîntre 1-45°C şi la un pH între 4,1-9,6 este de aşteptat ca aceasta să reziste înalimente o lungă perioadă de timp, iar acest lucru a fost confirmat. Tulpinile Scott A şi V7 inoculate în caşcaval în cantitate de 104-105/gau supravieţuit 28 de zile la 3°C. Când aceste două tulpini au fost inoculate în brânza Camembertîmpreună cu alte două tulpini creşterea a avut loc în 18 zile de la maturarecu niveluri de 104-105 iar după 65 de zile de 106-107/g. Lis. monocytogenes a supravieţuit în pachetele cu caşcaval cu acidascorbic 0,3%, 130 de zile. Limitele legale ale numărului de listerii din alimente: Unele ţări au stabilite limite legale ale numărului de listerii din alimente(în special cele de tip fast-food), în timp ce altele nu. Guvernul S.U.A. duce cea mai strictă politică în ceea ce priveştenumărul de germeni din alimente aceştia fiind desemnaţi cu termenul de„adulteranţi”. Acest lucru se traduce prin faptul că orice aliment „fast-food”care conţine acest germen în probele de 50 grame poate fi reţinut sau retrasde pe piaţa. Toleranţa 0 în general înseamnă absenţa microorganismului în probelede 25 grame. Comisia Europeana (EC) a dat o directivă pentru produsele şisubprodusele din lapte prin care specifică toleranţa 0 pentru brânzeturilefine şi absenţa bacteriei în probe de 1g pentru celelalte produse. Comisia Internaţională de Microbiologie Specifică Alimentelor(ICMSF) a stabilit că dacă acest microorganism nu depăşeşte 100 germeni/gram în momentul consumului, alimentul poate fi consumat de către indiviziisănătoşi. În anii 1994-1998 în S.U.A. Lis. monocytogenes a fost responsabilăde 61% din cele 1328 retrageri de alimente, urmată de salmonele cu 11%. Oricum nu este corect să presupunem că toate alimentele confiscate arfi provocat boala dacă ar fi fost vândute. Nu toate tulpinile produc listeriozela oameni, iar carnea şi produsele de carne de pasăre nu sunt folosite înacelaşi mod de către consumatori.

1.16. Profilaxie şi combatere

Producătorii de alimente şi de echipament pentru procesarea acestoratrebuie să cunoască proprietăţile listeriei. Fabrica şi echipamentul trebuie



proiectate astfel încât să faciliteze curăţenia şi igienizarea, pentru a reduceposibilitatea contaminării şi colonizării cu Lis. monocytogenes. Producătorii,transportatorii şi comercianţii alimentelor perisabile trebuie să utilizezeun bun echipament de refrigerare, împreună cu o împachetare adecvată şiinformaţii pentru consumator, de tipul termenului de garanţie şi al condiţiiloroptime de păstrare. Pentru siguranţa şi calitatea produsului final, esterecomandabilă aplicarea unui program de tipul HACCP sau a unei schemede control şi evaluare similare. În ultimul deceniu, industria alimentară dinEuropa şi America de Nord a fost activă în investigarea prezenţei listerieiîn alimente şi mediul, în implementarea analizelor de risc şi în stabilireaunor coduri de procedură existând dovezi care atestă ameliorarea calităţiimicrobiologice a unor alimente în această perioadă. Deoarece Listeria monocytogenes este un patogen potenţial, iardetectarea altor specii de Listeria poate indica o contaminare a mediului (înspecial, în cazul acelor alimente care au trecut printr-un proces bactericid),idealul ar fi excluderea tuturor germenilor din alimente, acţiune care ar trebuiîntreprinsă viguros. Realizarea acestui obiectiv este probabil impracticabilăpentru toate alimentele şi este în mod clar de neatins în cazul alimentelorcrude sau a celor care nu au fost supuse unui proces listericid. Reacţiaautorităţilor naţionale faţă de prezenţa Listeriei în alimentele vândute cuamănuntul a variat de la excluderea totală a anumitor alimente (politicăaplicată în Statele Unite ale Americii şi în unele ţări din ComunitateaEuropeană), până la toleranţa unei anumite contaminări. Listeria monocytogenes se poate multiplica (deşi lent) la temperaturilede refrigerare, de aici rezultând nu numai importanţa excluderii sale dinalimente, ci şi a inhibării multiplicării şi supravieţuirii sale. Această problemăpoate fi abordată prin îmbunătăţirea reglementărilor privind temperatura şidurata de păstrare. În prezent este posibilă evaluarea nivelului de Listeriadin alimente, ceea ce furnizează informaţii suplimentare valoroase asupracalităţii microbiologice a acestora, prin faptul că un nivel mai înaltreflectă probabil încălcări ale normelor de igienă, durată şi temperatură dedepozitare. Pentru evitarea listeriozei şi a altor toxiinfecţii alimentare, publicullarg trebuie educat în ce priveşte utilizarea alimentelor de bună calitate şia măsurilor de igienă personală, din momentul cumpărării hranei până laconsum. Aceasta include evitarea contaminării încrucişate între alimentelecrude şi cele gătite, utilizarea unor frigidere corespunzătoare şi nedepăşireaduratei de păstrare normale a alimentelor. Întrucât Listeria este largrăspândită în mediu, evitarea totală şi eliminarea completă a germenuluidin toate alimentele este imposibilă şi este probabil că toţi indivizii vor


30 BIBLIOGRAFIE SELECTIVAfi la un moment dat expuşi infecţiei cu Listeria. Cu toate acestea, femeilegravide şi persoanele imunocompromise prezintă un risc mai mare de acontracta listerioza. În multe ţări (incluzând Marea Britanie, Statele Uniteale Americii, Franţa, Noua Zeelandă şi unele regiuni din Australia) indiviziiexpuşi riscului sunt sfătuiţi să-şi ia măsuri speciale de precauţie. Alimentelepreparate sau semipreparate, cum ar fi brânzeturile cu pastă moale şi pateul,s-au dovedit a fi în mod special periculoase. În Anglia şi Ţara Galilor afost emisă recomandarea generală ca indivizii vulnerabili să nu le consume.O altă recomandare generală a fost emisă în Statele Unite pentru evitareaunor tipuri de brânză (telemea şi brânza de tip mexican), a alimentelor tip„delicatesă” şi pentru reîncălzirea preparatelor din carne. În lumina recentelorpusee epidemice din Australia, ar putea fi, de asemenea, prudentă evitareaunor alimente gătite precum şi a semipreparatelor din peşte şi moluşte. Indivizii susceptibili trebuie să evite consumarea cărnii şi alimentelorde origine marină crude sau inadecvat preparate, să spele fructele şi legumelecare vor fi consumate crude şi să reîncălzească atent toate alimentelesemipreparate înainte de consum, în special pe cele înalt procesateanterior. O afecţiune pseudogripală inexplicabilă la femeile gravide sau la ceiimunocompromişi trebuie investigată prin hemoculturi. În plus, persoanelecare îngrijesc animalele infectate trebuie să cunoască posibilitatea listeriozeioculare sau cutanate şi să solicite asistenţă medicală în cazul dezvoltăriiunor leziuni suspecte. De asemenea, poate fi prudentă avertizarea femeilorgravide şi a celor imunocompromişi să evite asistarea la fătarea mieilor,să nu mulgă oile care au fătat recent, să nu intre în contact cu placentele şimieii nou-născuţi. Acestea reprezintă în mod clar căi potenţiale de infecţie,deşi, cu excepţia leziunilor oculare şi cutanate, nu s-au observat asociaţiisemnificative între cazurile de listerioza şi mediul rural. Pentru prevenirea infecţiei încrucişate în perioada neonatală trebuieîntreprinse măsuri stricte de control al infecţiei in momentul naşterii. Acestemăsuri necesită îngrijirea separată a pacienţilor, utilizarea echipamentuluisterilizat termic sau a celui de unică folosinţă, ştergerea cu alcool asuprafeţelor, purtarea mănuşilor şi a şorţurilor, care vor fi schimbate înaintede spălarea mâinilor şi asistarea altor pacienţi. Deoarece listerioza umană este o afecţiune rară, schemele desupraveghere şi investigare epidemiologică a cazurilor sunt esenţialepentru identificarea grupurilor de pacienţi cu aceeaşi sursă şi cale deinfecţie. Utilizarea studiilor tip caz-control pentru investigarea puseelor delisterioza a avut rezultate contradictorii, iar episoadele cu sursă comună potfi recunoscute numai prin recoltarea produselor patologice de la pacienţii



infectaţi şi identificarea tulpinilor comune. Întrucât Lis. monocytogenes estelarg răspândită în mediu (inclusiv în alimente), este importantă utilizareaschemelor de tipaj discriminatoriu în compararea izolatelor. Metodelede determinare a subtipurilor aplicate la Lis. monocytogenes au inclusserotipajul, tipajul cu bacteriocină, analiza plasmidelor, tipajul fagic, analizafragmentelor de restricţie DNA (incluzând electroforeza în gel), amplificareaaleatorie a DNA-ului polimorf şi electroforeza enzimatică multiloculară.Metodele tradiţionale de analiză au utilizat serotipajul şi tipajul fagic, deşicombinarea acestora cu metodele moleculare sau cu electroforeza enzimaticămultiloculară oferă un grad mult mai înalt de discriminare. Pentru a utilizaaceste metode este necesară o investiţie considerabilă de timp, personalşi echipament, acestea fiind practicabile numai în laboratoarele centrelornaţionale de referinţă cu un interes special pentru Listeria. După cum s-a discutat anterior, pentru prevenirea listeriozei animaletrebuie acordată atenţie hranei acestora, în special furajelor. Pentru uz animalau fost elaborate vaccinuri vii atenuate, afirmându-se că acestea oferă ooarecare protecţie, deşi studiile în teren sunt echivoce. Totuşi, o dată curevoluţia apărută în înţelegerea patogenezei acestei infecţii şi a interacţiuniloragentului etiologic cu imunitatea celulară a gazdei, împreună cu capacitateade manipulare genetică, pare probabil că Listeria va reprezenta în viitor undomeniu activ de investigaţie.

1.17. Metoda şi schema de lucru utilizată pentru izolarea şi identificarea lui Lis. monocytogenes

Se obţine omologatul alimentar din amestecarea a 25 grame de alimentcu 225 mililitri de apă peptonată şi se amestecă bine într-un blender steril.Incubarea se realizează la 20°C, timp de 1-2 ore. Preîmbogăţirea. Se amestecă 25 grame de probă cu 225 mililitribulion Demi-Fraser (M82). Incubarea se realizează la 30°C, timp de 24 deore. Îmbogăţirea selectivă. Câte 1 mililitru din cultura obţinută prinresuscitare şi preîmbogăţire se însămânţează în 100 mililitri bulion Demi-Fraser. Incubarea se realizează la 30°C, timp de 24 de ore. Trecerea pe mediul selectiv de izolare. 0,1 mililitri din cultura caatare sau din amestecul 0,5 mililitri cultură + 4,5 mililitri KOH se striază pesuprafaţa agarului Palcom (M83). Incubarea se realizează la 35°C, timp de24-48 de ore. Izolarea coloniilor caracteristice. Se selectează 5 colonii tipice şi sepasează în plăci Petri cu agar nutritiv (sau agar TSYEA). Se incubează la



35-37°C, timp de 18-24 de ore.

Identificarea şi confirmarea lui Lis. monocytogenes

1. Coloraţia Gram: listeriile apar ca bacili Gram pozitivi saucocobacili. 2. Testul mobilităţii: se transplantează de pe mediile agarizate,selective, 5 colonii caracteristice într-o eprubetă cu bulion creier şi cord debovină şi 3 colonii într-o eprubetă cu agar nutritiv moale şi se incubează la25°C, 24 de ore. Se execută, din cultura în bulion, examenul între lamă şilamelă. Lis. monocytogenes prezintă o mobilitate intensă şi caracteristică şiexecută mişcări de rostogolire ce alternează cu scurte perioade de repaus. Peagarul moale, mobilitatea bacteriei este exprimată prin dezvoltarea culturiisub formă de umbrelă. 3. Testul catalazei: Catalaza este o enzimă hemoporfirinică, cecatalizează reacţia de descompunere a apei oxigenate. Reacţia se evidenţiază,atunci când se pune în contact o ansă de cultură cu o picătură de apăoxigenată. Apariţia bulelor de gaz se interpretează ca reacţie pozitivă, fiindspecifică pentru listerii. 4. Fermentarea carbohidraţilor: Se foloseşte apă peptonată cu roşu-fenol. Listeria monocytogenes fermentează glucoza şi ramnoza, cu producerede acid, fără producere de gaz, dar nu fermentează xiloza şi manitolul. Teste de confirmare: a) Testul hemolizei. Prin acest test se pot diferenţia două specii strânsînrudite şi anume Lis. monocytogenes şi Lis. innocua. Speciile hemoliticede listerii sunt: Lis. monocytogenes, Lis. ivanovii, Lis. seeligeri. Se procedează astfel: suprafaţa agarului cu sânge de oaie se striazăcu cultura bacteriană de testat. Se incubează 24 de ore la 35-37°C. Lis.monocytogenes formează colonii mici cu un halou mic, clar, în jur, specifichemolizei beta. Lis. ivanovii are o activitate hemolitică puternică formândîn jurul coloniilor zone clare, întinse, iar Lis. seeligeri produce o hemolizăslabă. b) Testul CAMP. Poate evidenţia clar caracterele hemolitice şi serealizează prin însămânţarea lui Stp. aureus şi Rco. equi sub formă destriuri, într-o singură direcţie pe placa cu agar sânge, iar tulpinile de Listeriaperpendicular, faţă de traiectoria acestora, fără a le atinge. Hemolizatulpinilor de Lis. monocytogenes este mai exacerbată în apropierea striuluide Stp. aureus, iar pentru Lis. ivanovii, numai în apropierea striului de Rco.equi.



Testarea patogenităţii: se realizează pe baza următoarelor teste:

• testul lui Anton; • pe şoareci imunocompromişi, infectaţi intraperitoneal cu tulpinivirulente de Lis. monocytogenes; • prin inocularea pe membrana corioalantoidiană a oului embrionat. Testul lui Anton: se realizează pe cobai, prin instilare în saculconjunctival a câtorva picături dintr-o cultură proaspătă de 24 de ore. Încazul reacţiei pozitive apar simptome de cheratoconjunctivită purulentă,care se vindecă spontan în câteva zile.



Lis. monocytogenes – frotiu din cultură. Se Lis. monocytogenes microscopie electronică;remarcă polimorfism, forme predominantBacili scurţi, drepţi sau încurbaţibacilare, dar şi forme cocobacilare, cocoide.

Lis. monocytogenes – microscopie electronică, coloraţie negativă

Lis. monocytogenes – hemocultură. Listeriile apar fie extracelular, fiefagocitate, ceea ce constituie o probă certă în diagnosticul listeriozei

Lis. monocytogenes – testul CAMP

Lis. monocytogenes – testul mobilităţii. În mediile semisolide, după însămânţarea listeriei prin înţeparea mediului în profunzime şi incubarea la 37°C, aceasta creşte sub forma unei “umbrele”.



Nucleu

Listeria în citoplasmă

Microscopie electronică a unui macrofag după 8 ore de la infecţia cu Lis. monocytogenes. Bacteria a trecut de bariera lizozomilor şi se divide în citoplasmă. Cromatina nucleului macrofagului apare condensată şi citoplasma se află într-un stadiu progresiv de liză

Mediul OCLA (Oxoid Chromogenic Listeria Listeria monocytogenes – beta hemolizăAgar) coloniile de Listeria monocytogenes


contaminanti listeria.docx

Documents

Transcript of contaminanti listeria.docx