Decarboxilarea oxidativa a piruvatului (Pyr) are loc n matricea mitocondriala sub actiunea catalitica a complexului, multienzimatic piruvat dehidrogenaza (Pyr-DH) si este etapa premergatoare a ciclului citric. n afara de NADH procesul produce si acetilCoA. n mitocondrie una din principalele cai catabolice care consuma acest compus este ciclul citric. El fiind cea mai importanta cale de producere de NADH si FADH2, care se vor oxida n lantul respirator. Decarboxilarea oxidativa se mai ntlneste n cadrul ciclului citric n transformarea E-cetoglutratului n succinil CoA. De asemenea degradarea scheletelor mai multor aminoacizi cum ar fi valina, leucina , izoleucina implica decarboxilari oxidative ale E-cetoacizilor, rezultati prin transaminare.9.1.1. Complexul multienzimatic Pyr-DH

Agregatul care catalizeaza decarboxilarea oxidativa a piruvatului consta din copii multiple a 3 enzime: -E1, piruvat dehidrogenaza cu coenzima TPP atasata prin forte coulombiene, -E2, dihidrolipoil transacetilaza cu coenzima lipoamida legata covalent si coenzima A care nu se recicleaza si -E3, dihidrolipoil dehidrogenaza cu coenzima FAD si coenzima NAD+, cea din urma fiind nereciclabila. n timpul decarboxilarii oxidative, proces cu mai multe etape, intermediarii ramn legati de c 929g68j omplex, cu urmatoarele avantaje: complexul este capabil sa transfere intermediarii ntre centrele active ale enzimelor E1, E2, E3 n ordinea n care urmeaza sa reactioneze, ceea ce mareste eficienta cinetica si termodinamica a procesului. distantele pe care intermediarii trebuie sa le parcurga prin difuzie sunt micsorate, adica viteza procesului este crescuta.

Cinetica acestui proces este mbunatatita, ca urmare a "pendularii bratului flexibil" de lipoil-lizil ntre centrele active ale E1 si E3 pentru a transfera gruparea acetil si doi electroni de la piruvat la coenzima A, respectiv FAD. De remarcat faptul ca structurile complexelor decarboxilarii oxidative a altor E-cetoacizi au tot 3 enzime ce contin aceleasi coenzime si catalizeaza aceleasi tipuri de reactii.9.1.2. Mecanismul chimic

Piruv atul produs glicoliza traverseaza membrana mitocondrial a interna prin intermediul unui symport specific piruvat H+. Conversia n CoA acetilse n citosol de

face printro secventa de 5 reactii. Rea ctia 1 Prin decarboxilare se pierde C(1) al piruvatului. Aceasta reactie este de piruvat dehidrogenaza (E1) si atomul catalizata coincide cu

etapa de formare a hidroxietil-TPP. n reactia 2 tot sub actiunea enzimei E1 are loc oxidarea gruparii hidroxietil pna la acetat. Cei doi electroni rezultati prin oxidare reduc puntea disulfurica la doua grupari tiol una din ele fiind esterificata cu acetat. Se regenereaza astfel TPPE1, care poate relua reactia 1. n reactia 3 enzima dihidrolipoil transacetilaza (E2) catalizeaza transferul gruparii acetil de la acetildihidrolipoamida-E2 necesara formarea la CoASH rezultnd este principalul produs al procesului, acetil-CoA. Energia tioesterului macroergic, furnizata de oxidarea hidroxietilului. Reactia 4 este catalizata de dihidrolipoil dehidrogenaza (E3) care contine o legatura disulfurica reductibila la doua grupari tiol ceea ce regenereaza lipoamida-E2 care apoi poate relua reactia 2. Astfel cei doi electroni pot trece de la E2 la E3. Reactia catalizata tot de E3, consta de la E3 la NAD+ prin intermediul 5, FAD,

n trecerea electronilor

produsul net fiind NADH. Astfel, E3-FAD regenerata poate relua reactia 4.9.1.3. Otravirea complexului E-cetoacid-dehidrogenaza

Arsenitul este o otrava pentru complexul Pyr-DH datorita capacitatii lui de a se lega covalent la dihidrolipoamida: Conform reactiei este inhibata lipoamida-E2 din compozitia piruvat dehidrogenazei si Ecetoglutarat, dehidrogenazei. Otravirea decarboxilarilor oxidative este de fapt inhibitia unei etape, timpurii a respiratiei celulare. Compusii pe baza de arsen sunt mai toxici fata de microorganisme dect fata de oameni. Aceasta diferenta a fost folosita pentru terapia unor boli cum ar fi sifilisul (care acum se trateaza actualmente cu antibiotice) si alte treponozomiaze

(treponozomii sunt boli provocate de bacterii din familia Treponemataceae). Acesti compusi arseno-organici au fost printre primele antibiotice, ei prezentnd nsa severe efecte secundare.9.1.4. Controlul activitatii complexului Pyr-DH

Mecanismele prin care este controlata decarboxilarea oxidativa a piruvatului sunt urmatoarele:9.1.4.1. Inhibitia prin produsi

Acetil-CoA si NADH n exces ncetinesc reactiile actionnd direct asupra procesului de decarboxilare oxidativa. Excesul de acetil-CoA blocheaza enzima E2 prin mentinerea ei n forma acetilata (acetil-dihidrolipoamida-E2), incapabila sa accepte gruparea hidroxietil de la hidroxietil-TPPE1 care ramne blocata n aceasta forma. Aceasta nseamna ca sunt blocate reactiile 2 si 3. NADH n exces blocheaza enzima E3 prin mentinerea ei n forma redusa, incapabila sa accepte cei doi electroni de la coenzima enzimei E2 care ramne blocata sub forma acetilat. Aceasta nseamna ca sunt blocate reactiile 2-5. ntruct cantitatea de E1 este mica se va acumula piruvatul. Global, ncetinirea decarboxilarii oxidative a piruvatului prin inhibitie prin produsi va reduce producerea acestora (CH3COSCoA si NADH) si deci excesul lor se va diminua. Controlul activitatii Pyr-DH intereseaza si reglarea concomitenta a glicolizei si gluconeogenezei.9.1.4.2. Reglarea prin mecanism covalent

Enzima E1 si n consecinta complexul Pyr-DH devin inactive atunci cnd un radical de serina al E1 este fosforilat cu ATP sub actiunea catalitica a unei kinaze. Fosforilarea este activata de aceiasi metaboliti ca si n cazul inhibitiei prin produsi. Enzima E1 fosforilata este reactivata prin hidroliza gruparii fosforil sub actiunea catalitica a unei fosfataze, stimulatori fiind ionii Ca2+ si Mg2+. Aceeasi ioni activeaza E1 prin inhibarea fosforilarii ei.9.2.Ciclul citric

Ciclul citric mai poarta numele de Ciclul Krebs, dupa numele (Hans Krebs) celuia care n 1937 a postulat existenta lui. Hans Krebs mpreuna cu Fritz Lipmann au primit premiul

Nobel n 1953 pentru descoperirea ciclului citric si respectiv descoperirea Coenzimei A si a ciclului ATP-ului. De asemenea ciclul citric este cunoscut si sub numele de Ciclul acizilor tricarboxilici, avnd n vedere implicarea acestor acizi n ciclu.9.2.1. Mecanismul chimic al ciclului citric

ntregul echipament enzimatic al ciclului citric se gaseste n matricea mitocondriala cu exceptia succinat dehidrogenazei care este "ngropata", n membrana interna. Etapele ciclului sunt: 1) Sinteza citratului este o condensare aldolica dintre acetil-CoA si o cetona avnd ca intermediar citril-CoA care hidrolizeaza. Reactia este catalizata de citrat sintaza. Denumirea de sintaza este data unei enzime care catalizeaza o condensare aldolica. Alte condensari aldolice sunt catalizate de aldolaze (vezi glicoliza si fructozoliza). Att sintazele ct si aldolazele catalizeaza reactii cu formare de legaturi C-C fara consum de ATP sau alt compus macroergic. Sintetazele catalizeaza reactii de condensare n care legaturile covalente se formeaza pe seama energiei furnizate de ATP sau alti nucleozid trifosfati. 2) Transformarea citratului n isocitrat se face prin intermediul compusului instabil cisaconitat. n a doua etapa, prin hidratarea cis-aconitatului rezulta isocitrat. Pentru ambele reactii enzima este aconitaza. Daca aceasta reactie ar fi neenzimatica ar rezulta 4 stereoizomeri. Totusi, ntruct aconitaza este o enzima stereospecifica, aditia apei produce numai stereoizomerul (2R, 3S)-isocitrat. Ionul de Fe2+ joaca un rol deosebit n aceasta reactie, el formeaza cu citratul un chelat (complex intern) stabil. Acest chelat este necesar pentru activitatea enzimei. Doze mari de fluoruri, fac ca fluorul sa reactioneze cu acidul citric, implicat n ciclul Krebs, avnd drept urmare formarea acidului monofluorocitric care nemaiputnd participa la reactiile ciclului citric, ntrerupe ciclul, deci producerea de energie, consecinta este moartea celulei. De asemenea acidul monofluorocitric este un inhibitor puternic al aconitazei.

3) izocitratului n

Transformarea E cetoglutarat

(ECG) elibereaza prima molecula de CO2 a ciclului. Enzima izocitrat

dehi-drogenaza catalizeaza o reactie n doua etape avnd ca intermediar instabil Exista oxalo-succinatul.

doua izoenzime ale izocitrat dehidrogenazei. Cea implicata n ciclul citric este NAD dependenta si se gaseste numai n matricea mitocondriala. Cealalta este NADP dependenta se gaseste att n matricea mitocondriala ct si n citosol, unde produce NADPH necesar proceselor anabolice. 4) Decarboxilarea oxidativa a ECG elibereaza cea de a doua molecula de CO2. Catalizator este complexul multienzimatic E-

cetoglutarat-DH, similar complexului Pyr-DH. Acest complex este format din urmatoarele subunitati enzimatice: E-cetoglutarat dehidrogenaza (E1), dihidrolipoil transsuccinaza (E2) si dihidrolipoil dehidrogenaza (E3). 5) Conversia succinil-CoA n succinat. Enzima, succinil-CoA sintetaza se mai numeste succinat tiokinaza n functie de sensul n care este citita reactia. Se stie ca la animale aceasta enzima foloseste GDP ca substrat iar la plante si bacterii foloseste ADP. Formarea cuplata a GTP (sau ATP) pe seama energiei eliberate prin decarboxilarea oxidativa aECG este un exemplu de fosforilare la nivel de substrat. Fosforilarea la nivel de substrat implica enzime solubile pe cnd fosforilarea oxidativa implica enzime legate de membrana interna mitocondriala. Pe seama energiei legaturii tioesterice se produce direct o legatura macroergica fosfat. Simultan are loc fosforilarea ADP n reactie cu GTP: GTP + ADP ATP + GDP

Pna n acest punct al ciclului s-au generat doua molecule de NADH si una de ATP (din GTP). 6) Dehidrogenarea succinatului dehidrogenaza, o flavoproteina. Succinat-DH este la catalizata de succinat eucariote este singura enzima a ciclului citric care este asociata adnc la membrana interna mitocondriala. Enzima contine cteva complexe [Fe-S] care intermediaza trecerea electronilor de la FADH2 la transportorii de biologica). 7) Hidratarea fumaratului cu formare de malat este catalizata de fumaraza Fumaraza care are specificitate absoluta adica ea catalizeaza hidratarea fumaratului nu si a maleatului, izomerul cis al fumaratului. n sens invers fumaraza catalizeaza numai deshidratarea Lmalatului nu si a D-malatului. 8) Oxidarea L-malatului cu refacerea oxalacetatului (OA) este catalizata de malat dehidrogenaza. Desi aceasta reactie este endergonica ((G' = + 29,7 kJ/mol), ea este deplasata in vivo spre dreapta datorita ndepartarii rapide a produsilor de reactie, oxalacetatul n reactia 1 si NADH oxidat n latul respirator.9.3.Reglarea ciclului citric

electroni ai lantului respirator (vezi capitolul oxidarea

Reglarea ciclului citric asigura producerea de intermediari si produsi astfel nct sa mentina starea de echilibru a celulelor si pentru a evita supraproductia neeconomica de metaboliti. Enzimele cheie ale ciclului citric sunt controlate aproape exclusiv pe 3 cai simple A)

disponibilitatea substratului B) inhibitia prin acumulare de produsi, C) feed back negativ competitiv Cele 3 enzime cheie: (a) citrat sintaza, (b) isocitrat dehidrogenaza, (c) E-cetoglutarat dehidrogenaza. Astfel, disponibilitatea substraturilor citrat sintazei (acetil-CoA si oxalacetatul, care este substrat si catalizator) variaza n functie de conditiile metabolice si uneori aceasta limiteaza viteza de formare a citratului. Pe de alta parte, NADH rezultat la oxidarea isocitratului si a E cetoglutaratului (si malatului) se poate acumula n anumite conditii. Daca raportul din [NADH]/[NAD+] n conformitate cu legea actiunii maselor. n mod similar, oxidarea malatului este la echilibru n conditii fiziologice. De aceea atunci cnd raportul [NADH]/[NAD+] este crescut concentratia oxalacetatului este scazuta datorita deplasarii echilibrului reactiei catre malat. Din aceasta cauza este ncetinita prima reactie a ciclului datorita lipsei de disponibilitate a substratului, oxalacetatul. Acumularea de produsi inhiba toate cele 3 etape limitatoare de viteza. Succinil-CoA inhiba complexul multienzimatic ECG-DH. Citratul blocheaza citrat sintaza iar produsul final

mitocondrie devine mare vitezele reactiilor de oxidare ale intermediarilor aratati se micsoreaza

ATP inhiba izocitrat-DH. Inhibitia sintazei de catre succinil-CoA este o reglare prin feed-back competitiv n care inhibitorul intra n competitie cu acetil-CoA la centrul activ al sintazei. Ionii de calciu activeaza printr-un mecanism alosteric izocitrat-DH, si ECG-DH dar si complexul multienzimatic Pyr-DH. n concluzie, concentratiile intermediarilor ciclului citric regleaza fluxul metabolic al ciclului astfel nct acesta sa furnizeze ATP si NADH pentru mentinerea lor la concentratii optime indiferent de intensitatea lantului de oxidare biologica.9.4.Caracterul amfibolic al ciclului citric. Anapleroza.

n mod obisnuit se crede ca o cale metabolica este necesara (conservarii) libere, necesara fie fie catabolica, eliberarii energiei anabolica sintezei

biomoleculelor cu consum de energie libera (ATP). Ciclul citric are un caracter catabolic deoarece el degradeaza unitati acetil fiind unul din principalele procese ale energogenezei. Este necesar ca intermediarii ciclului sa se mentina la concentratii suficient de mari pentru a asigura functionarea lui. nsa exista mai multe cai metabolice care utilizeaza intermediari ciclului citric (scaznd astfel concentratia lor), ca materiale de pornire n sinteze (anabolism). De aceea acest ciclu are un caracter dublu, catabolic si anabolic, adica amfibolic.

Toate transformarile anabolice care utilizeaza intermediari citrici sunt consumatoare de energie libera. Din acest motiv functia catabolica a ciclului nu poate fi ntrerupta. Pin urmare intermediarii scosi n scop anabolic trebuie imediat nlocuiti. Reactiile de completare a acestora se mai numesc reactii anaplerotice. Printre reactiile anabolice se numara: - sinteza glucozei (gluconeogeneza) care se desfasoara n citosol pe seama malatului care este transportat n afara mitocondriei prin intermediul unui sistem de transport aflat n membrana interna mitocondriala; - biosinteza lipidelor (acizi grasi, colesterol) care are loc n citosol pornind de la acetilCoA. Aceasta din urma nu poate traversa membrana mitocondriala dect prin intermediul navetei citrat-piruvat. Citratul mitocondrial iese n citosol iar piruvatul patrunde n mitocondrie. Sub actiunea citrat liazei citratul se transforma n acetil - CoA cu consum de energie. Acetil CoA astfel rezultata initiaza sinteza acizilor si a colesterolului (vezi capitolul Metabolismul lipidic). - biosinteza aminoacizilor utilizeaza intermediarii ciclului citric pe doua cai. a. aminarea reductiva a ECG catalizata de glutamat dehidrogenaza NAD+ sau NADP+ dependenta: ECG + NAD(P)H + NH3 Glu + NAD(P)+ + H2O

b. transaminarea la care participa ECG si oxalacetatul din rndul intermediarilor ciclului citric: ECG + Ala OA +Ala Glu + Pyr Asp + Pyr

- biosinteza hemului ncepe n mitocondrie utiliznd ca material de pornire succinil-CoA (vezi capitolul Metabolismul proteic).

Reactiile anaplerotice rencarca ciclul pornind de la precursori ne-citrici. Principala reactie anaplerotica care actioneaza n ficat si rinichi este carboxilarea piruvatului

catalizata de piruvat carboxilaza, enzima biotin-dependenta.

Pyr + CO2 + ATP + H2O

OA + ADP +Pi

Aceasta enzima sesizeaza scaderea nivelului intermediarilor ciclului citric, pentru ca ea are drept activator acetil-CoA. O descrestere a vitezei de desfasurare a ciclului cauzata de cantitatea insuficienta de oxalacetat (OA) sau alti intermediari produce acumularea acetil-CoA care, activeaza rencarcarea ciclului via oxalacetat. Exista si alte reactii anaplerotice producatoare de oxalacetat. n miocard si muschiul scheletic are loc reactia:

PEP + CO2+ GDP -

OA + GTP

O seric de cai catabolice produc intermediari ai ciclului citric printre care mentionam F-

oxidarea acizilor cu numar impar de atomi de carbon si degradarea valinei, izoleucinei si metioninei, care dau nastere propionil-CoA, care n urma a doua reactii ulterioare trece n succinil-CoA. De asemenea fenilalanina, tirozina si aspartatul se degrada dnd nastere la fumarat si acetoacetat n cazul Phe si Tyr si respectiv fumarat (vezi capitolele Metabolismul lipidic si respectiv al aminoacizilor).

+ CO

2

+ ATP9.5.Ciclul acidului glioxilic

Succinil- CoA + ADP +PI

Unele microorganisme, plantele si anumite nevertebrate, utilizeaza acetil-CoA att drept combustibil ct si drept sursa pentru sinteza carbohidratilor. De aceea, la aceste organisme unele enzime ale ciclului citric opereaza n doua moduri: a. functioneaza conform ciclului citric, b. produc secventa: izocitrat glioxilat; glioxilat+acetil-CoA malat Aceasta secventa dubleaza

transformarea ciclului citric a izocitratului n malat realiznd un ciclu "scurt" numit ciclul glioxilic.