BIOLOGIA MOLECULAR A CICLULUI CELULAR

DESCRIEREA FAZELOR CICLULUI CELULARCiclul celular este cuprins ntre momentele apariiei unei celule dup diviziune i sfritul diviziunii acesteia din care rezult dou celule fiice. Importana biologic a existenei ciclului celular este enorm pentru ntreaga lume vie. Parcurgerea ciclului celular este esenial pentru reproducerea tuturor formelor de via de la cele mai simple organisme unicelulare i pn la organsimele complexe compuse dintr-un numr mare de celule. Dezvoltarea ontogenetic a organismelor pluricelulare ce consta ntr-o secven complet de diviuziune celulara ca i succesiunea generaiilor la plante i organismele superioare sunt consecina derulrii normale a ciclurilor de via ale celulelor componente. Organismele adulte ce i-au ncheiat creterea manifest un status cvo remarcabil ce provine din compensarea pierderilor de celule determinate de diferite cauze ca rennoirile continue i controlate ale celulelor. Dei pe scara filogenetic, ciclul celular mbrac o varietate impresionant de forme reflectnd aspectele evolutive i adaptative ale diferitelor organisme, schema general a ciclului vital poate fi secveniat n 2 etape. Perioada cuprins ntre dou diviziuni succesive se numete interfaz i perioada de diviziune propriu-zis se numete faz mitotic. Dei n interfaz are loc sinteza continu a tuturor componentelor moleculare necesare existenei i activitii acesteia, sinteza/replicarea ADN-ului are loc doar ntr-o perioad determinat a interfazei faza S. n funcie de acest eveniment, ciclul de via al unei celule poate fi mprit n 4 perioade sau faze distincte:- Faza G1 (presintetic) ce este cuprins ntre sfritul diviziunii celulei-mam i nceputul sintezei ADN-ului n celulele-fiice; - Faza S, sinteza ADN-ului;- Faza G2 (postsintetic) cuprins ntre sfritul sintezei ADN i nceputul diviziunii celulei;- Faza M (mitoza). Primele 3 faze ale ciclului reprezint interfaza. Spre deosebire de replicarea ADN-ului ce const ntr-o dublare exact a cantitii acestui component molecular per celul, duplicarea majoritii componentelor celulare (moleculare i organite celulare) nu se supune unui control strict fiind necesar un numr minim dublu sau mai mare de copii ale unei anumite molecule sau organit celular. Aceast constatare este valabila i n ceea ce privete repartiia componentului celular n cele 2 celule fiice ce rezult dup diviziune. Din punct de vedere al controlului sintezei i distribuirii materialului celular la nivelul nucleului i al citoplasmei este mai comod s se vorbeasc despre 2 cicluri celulare distincte, dar corelate ntre ele: un ciclu cromozomial i unul citoplasmatic. n ciclul cromozomial, sinteza ADNului, ce corespunde duplicaiei cromozomilor, alterneaz cu mitoza, n care cele 2 copii ale moleculelor de ADN se separ. n ciclul citoplasmatic, creterea celular ce se reflect prin multiplicarea constituenilor celulari alterneaz cu citokineza ce mparte citoplasma celulei-mam n 2 pri sensibil egale. Se poate vorbi i despre un ciclu centrosomal ce const n duplicarea celor 2 centri celulari, proces necesar organizrii fusului de diviziune. Acest ciclu poate fi considerat o a treia component major a ciclului de via al unei celule.

DURATA CICLULUI CELULARDurata ciclului celular este un parametru foarte variabil dependent de tipul celular, specie, etapa de dezvoltare a organismului, condiiile de mediu etc. n cazul eucariotelor superioare, ciclul celular poate dura de la aproximativ o or (celulele embrionare de la amfibieni) pn la peste 1 an (celulele hepatice adulte). n medie, celulele cu proliferare rapid a eucariotelor superioare parcurg ciclu vital n 16 pn la 24 de ore din care faza M dureaz aproximativ 1 pn la 2 ore. Deoarece lungimea fazei M este remarcabil de constant pentru diferite celule, rezult c diferena de durat a diferitelor cicluri celulare provine din lungimea diferit a interfazei i, n special, a fazei G1. Celulele cu ciclu foarte lung de via, de ordinul lunilor, anilor, sunt blocate n faza G1 i, prin urmare, sunt denumite curent celule aflate n faza G0 (celule G0). Dup ce faza G1 a fost depit, intervalul de timp necesar finalizrii ciclului celular este surprinztor de apropiat n cazul diferitelor celule.

METODE STUDIU ALE DURATEI CICLULUI CELULARStudiul fazelor ciclului celular precum i al duratei acestora s-a efectuat prin diferite tehnici experimentale precum i pe modele celulare diferite. Autoradiografia a fost utilizat pentru prima oar n 1950, n vederea evidenierii momentului n care are loc sinteza de ADN. Metoda a constat n folosirea precursorilor de ADN marcai radioactiv cum ar fi timidina tritiat (3H-timidina) care sunt administrai fie animalelor vii prin injectare, fie introdui n mediul de cretere al celulelor care se dezvolt n culturi. n prima variant experimental, se preleveaz eantioane tisulare la intervale determinate de timp (intervale stabilite anterior prin tatonri repetate), apoi se fixeaz celulele i se realizeaz autoradiografiile acestora. Dup developarea radiografiilor i compararea lor cu micrografiile electronice ale seciunilor tisulare corespunztoare, radioactivitatea poate fi localizat cu precizie sub forma unor granule de argint cantonate n interiorul nucleilor celulelor studiate. Celulele care incorporeaz precursorii radioactivi n catenele de ADN nou sintetizate se gsesc n faza S i sunt observate n eantioanele care au avut cea mai scurt expunere la aciunea precursorului radioactiv (au fost prelevate primele). Radiografiile realizate la intervale de timp din ce n ce mai mari, reflect progresia celulelor n ciclul celular, adic este vorba de acele celule care se aflau iniial n faza S. Cuantificarea duratei fiecrei faze a ciclului se face prin numrarea celulelor aflate n acea faz astfel dac se admite c celulele din populaia respectiv au o cretere regulat i prolifereaz toate cu aceeai vitez, atunci fraciunea (procentul) de celule aflate ntr-o faz dat a ciclului celular va fi aproximativ egal cu durata fazei n care se gsesc celulele. De exemplu, dac pe seciunile fixate la circa o jumtate de or dup administrarea de precursori radioactivi i apoi autoradiografiate, apar circa 30% din celule radiomarcate (n faza S), iar durata total a ciclului acestor celule este de circa 24 ore, atunci durata fazei S va fi calculat dup formula:

Dac celulele sunt injectate cu pirimidin tritiat dup mai multe ore, atunci celulele aflate n mitoz vor deveni radioactive. Procentul celulelor aflate n mitoz este foarte mic i constituie aa-numitul indice mitotic. El este, de regul, 5 % ceea ce nseamn c durata fazei M este de:

Durata minim de timp cuprins ntre momentul observrii radiomarcajului n celulele S i momentul decelrii radioactivitii n celulele M reprezint durata fazei G2. n aceast manier, determinnd duratele fazelor S, G2, i M i durata total a ciclului celular, se poate calcula prin sustragerea duratei celor trei faze, durata G1. Pentru calculul precis al lungimii etapelor ciclului celular este necesar ca n formula de calcul s se introduc i un factor de corecie care este cuprins ntre 0.7 pentru celulele aflate n G1 i 1.4 pentru celulele mitotice deoarece ... aprute dup diviziune dect celule btrne ntr-o populaie celular cu cretere continu. Pentru o mai bun nelegere a celor prezentate, se utilizeaz n mod curent o schem ce reprezint celulele ca fiind aezate pe o plac turnant i parcurgnd toate ciclul celular cu aceeai vitez. Poziia celulelor pe plac reflect etapa ciclului celular n care aceste celule au ajuns. Studiul celulelor aflate n cultur. Studiul duratei fazelor ciclului celular este mai facil de realizat n culturile celulare dect pe esuturile complexe mai puin accesibile ale animalelor. Dintre metodele curente utilizate n acest scop se pot enumera microcinematografia care permite urmrirea unei celule individuale, cum ar fi diviziunea i creterea ei precum i msurarea direct a duratelor individuale a fazelor ciclului celular precum i a duratei totale a acestuia. Autoradiografia se realizeaz pe acelai principiu aplicat i pe celulele organismelor vii. n acest caz, izotopii radioactivi se administreaz celulelor direct n mediul de cultur. nseamn c, practic, aceste celule consum aceti precursori ca i cum ar fi orice alt substan nutritiv. Citofluorimetria sau flow-citometria se bazeaz pe trierea celulelor n funcie de coninutul lor n ADN. Aceste celule devin fluorescente cnd sunt marcate cu un fluorocrom care se ataeaz la ADN-ul lor nuclear. Intensitatea de emisie fluorescent va fi proporionala cu cantitatea de ADN prezenta n fiecare celul. Citofluorimetrul va separa celulele n funcie de cantitatea lor relativ de ADN n trei categorii: - celule care au un complement de ADN nereplicat, ceea ce nseamn o unitate arbitrar de fluorescen (celule care se afla n G1), - celule care au un complement de ADN complet replicat adic dou uniti arbitrare de fluorescen (celule care se gsesc n fazele G2 i M) i - celule care au cantitate intermediar de ADN care se afl n faza S. Numrul celulelor separate din fiecare categorie va indica durata relativ a fazelor ciclului celular al acestora (aceast durat este mai mare n G1 n comparaie cu faza S sau fazele G2+M). Obinerea de populaii celulare sincrone care sunt formate din celule aflate n aceeai faz a ciclului celular. Exist dou tehnici principale de obinere a culturilor de celule sincrone. Prima metod se refer la tratarea celulelor cu ageni chimici care acioneaz asupra unei etape specifice a ciclului celular blocnd progresia n ciclu dincolo de aceast etap. Dac expunerea la agentul inhibitor este prelungit, atunci toate celulele vor fi blocate n acest stadiu astfel nct o dat cu ndeprtarea agentului blocant ele vor termina ciclul sincron. Exist ns riscul ca substana respectiv s nu acioneze coordonat n toate celulele datorit complexitii proceselor ce se desfoar n timpul ciclului celular. A doua metod se refer la separarea celulelor dintr-o populaie pe baza taliei i formei lor. n cursul mitozei, cele mai multe celule de mamifere care sunt cultivate in vitro i modific forma rotunjindu-se ca urmare a redispunerii intracitoplasmatice a elementelor lor de citoschelet. Datorit formei sferice celulele mitotice vor adera mai puin la suprafaa plcii de cultur n comparaie cu celulele interfazice ceea ce permite detaarea i suspendarea lor facil din masa mediului printr-o agitare uoar, colectate apoi i resuspendate n mediu proaspt i vor continua ciclul n manier sincron. n plus, datorit diferenelor de mas, celulele aflate n diferitele etape ale ciclului pot fi separate ntre ele prin centrifugare difereniat obinndu-se astfel, n final, fraciuni/sedimente constituite din celule aflate n acelai stadiu al ciclului lor vital. Indiferent de modul de obinere al culturilor de celule sincrone, aceasta calitate, sincronizarea, se diminueaz n timp, pentru a se pierde, n final, dup mai multe cicluri, datorit variabilitii aleatorii a vitezei ciclurilor celulare individuale. EVENIMENTE MOLECULARE ALE CICLULUI CELULAR I CONTROLUL MOLECULAR AL CICLULUI CELULARn condiii favorabile de cretere se constat c pe parcursul ciclului celular masa celulelor se dubleaz datorit sintezei continue dar cu viteze diferite a constituenilor celulari care se acumuleaz n citoplasm. De exemplu, coninutul proteic al celulelor crete mai mult sau mai puin constant pe durata ciclului. n cursul mitozei ns se constat o diminuare a ratei de proteosintez. Calitativ se observ i diferene ntre ratele de sintez a diferitelor tipuri de proteine in etapele ciclului celular. Astfel electroforezele bidimensionale n gel de poliacrilamid permit detectarea a circa 1000 de fraciuni proteice sintetizate n perioadele G1 i S. Dintre acestea doar 2 fraciuni proteice apar a fi sintetizate cu rate sensibil diferite n cele dou perioade. Histonele necesare condensrii cromatinei nu sunt sintetizate dect n timpul fazei S similar i altor proteine care sunt necesare replicrii ADN-ului. ARN-ul se sintetizeaz cu viteze relativ constante de-a lungul ciclului celular, cu excepia fazei M n care datorit puternicei condensri a cromozomilor are loc o inhibiie aproape total a transcripiei. Pe fondul creterii celulare i a sintezelor moleculare continue n cursul ciclului celular se produce un ansamblu de modificri brute i anume sinteza ADN-ului care este cantonata doar n perioada S i este uor detectabil i de asemenea sinteza unor compui care controleaz derularea normal a ciclului celular i depirea aa numitelor puncte critice sau puncte de control ale ciclului care sunt:-primul punct de restricie (punct de iniiere sau Start) care este situat la finele fazei G1 -al doilea punct de restricie care se gsete la sfritul fazei G2 Aceste constatri sugereaz faptul c exist un control molecular al cronologiei evenimentelor ciclului celular precum i o coordonare a acestora cu procesul continuu de cretere celular. CONTROLUL MOLECULAR AL CICLULUI CELULARIdeea existenei unor molecule, factori citoplasmatici care controleaz desfurarea normal a ciclului celular sintetizai n anumite momente determinate ale acestuia a fost testat pe diferite sisteme experimentale i n primul rnd prin experimente de fuzionare a celulelor din culturile in vitro, celule care se gsesc n diferite faze ale ciclului celular. n funcie de variantele, de combinaiile experimentale realizate s-au desprins urmtoarele concluzii:-cnd o celul aflat n faza S fuzioneaz cu o celul aflat n faza G1, nucleul acesteia din urm intr foarte rapid n faza S. Explicaia acestei transformri este urmtoarea, celulele S dispun n citoplasm, aparent din abunden, de un ansamblu de semnale chimice sau doar un semnal care controleaz replicarea propriilor molecule de ADN. n produsul rezultat n urma fuziunii S/G1 semnalul produs i existent n celulele S iniiale, induce i duplicarea genomului n nucleii celulelor G1. Acest semnal denumit generic activator al fazei S marcheaz totodat i limita dintre fazele G1 i S n celulele normale. -fuzionarea celulelor G2 cu celulele G1 a artat c n acest caz nucleul G1 nu este indus prematur s sintetizeze ADN, el parcurgnd programul normal al unei celule aflate n faza G1. n schimb nucleul G2 rmne n aceasta faz sincronizndu-se n final cu nucleul G1. Aceste constatri demonstreaz c activatorul fazei S este produs numai n aceasta faz i este eliminat rapid din celule la sfritul ei, citoplasma celulelor G2 nu mai conine deci acest semnal difuzibil. -n cazul fuzionrii celulelor S cu celulele G2, nucleul acestora din urm va fi ntrziat n aceast faz, pe cnd nucleul S parcurge programul normal al unei celule aflate n faza S. Concluzia acestei variante este aceea c odat replicat genomul nu mai sufer noi replicri, din acest motiv nucleii G2 nu mai revin n faza S dup fuziune.Aadar se poate vorbi despre existena unui blocaj al re-replicarii care face ca genomul s se replice o dat i numai o singur dat n cursul unui ciclu celular. Acest blocaj este ns ndeprtat odat cu terminarea mitozei unei celule i intrarea ntr-o noua faz G1. Meninerea funcionalitii factorului activator al fazei S pe toat durata acestei perioade necesit existena i a unui mecanism complementar. Acest mecanism explic capacitatea celulelor S de a-i prelungi aceast faz dincolo de limitele ei normale i de a-i continua sinteza de ADN atunci cnd au fost tratate pentru un anumit timp cu un inhibitor al replicrii dup care inhibitorul a fost ndeprtat. Mecanismul meninerii capacitii funcionale a activatorului fazei S ar putea fi reprezentat chiar de prezena furcilor de replicare ale ADN-ului. Se consider c prima furc de replicare aprut ntr-o caten de ADN asigur ntr-o manier nc necunoscut producia unei pri eseniale a activatorului fazei S i n felul acesta iniierea formrii noilor furci n alte regiuni ale ADN-ului. Iniierea unui fus de replicare constituie deci un semnal de tip totul sau nimic pentru declanarea fazei S. Teoretic un nucleu care i-a ncheiat faza S i a intrat n G2 este capabil s-i condenseze cromozomii i s iniieze mitoza. Cu toate acestea, constatrile obinute prin blocarea artificial a sintezei ADN-ului n urma fuziunii celulelor S i G2 sau n urma lezrii ADN-ului cu raze X urmat de repararea natural a acestuia, arat c intrarea n faza M este ntrziat pn n momentul n care ntreaga cantitate de ADN este replicat. n concluzie se poate afirma c exist un al doilea semnal citoplasmatic controlat de ADN care acioneaz ca un retardant sau blocant al debutului mitozei. Acest semnal ar putea fi sau nu identic cu activatorul fazei S.Dispariia din citoplasm a semnalelor retardante ale fazei M nu este suficient n sine pentru declanarea mitozei. Iniierea acestui proces necesit existena unui alt semnal esenial produs de data aceasta n faza G2. Din acest punct de vedere faza G2 poate fi considerat drept un interval pregtitor al produciei acestui semnal dup dispariia factorilor retardani a fazei M. Prezena acestui factor a fost demonstrat tot prin experimente de fuziune ntre celulele aflate n faza M i celule care se gsesc n una dintre perioadele interfazei. n toate aceste cazuri dup fuziune nucleii interfazici au evoluat rapid spre faza M condensndu-i n grade diferite cromozomii i dezorganizndu-i membrana nuclear. Deci se poate afirma c citoplasma celulelor M conine un puternic factor promotor al fazei M (MPF-> M-phase Promoting Factor) care induce mitoza i n nucleii aflai n oricare perioad a interfazei n celulele fuzionate. Factorii citoplasmatici retardani ai mitozei inhib deci producia de MPF dar nu mai pot bloca aciunea sa odat ce acesta a fost sintetizat. n concluzie experimentele amintite pun n eviden 3 tipuri de molecule implicate n mod esenial n controlul evenimentelor ciclului celular. Dei n realitate aceti factori sunt complexe moleculare pentru eficiena clasificrii, ei pot fi considerai drept molecule unice:1. Factorul iniiator al fazei S prezent normal numai n citoplasma celulelor S i care activeaz sinteza ADN-ului.2. MPF care este prezent numai n citoplasma celulelor M i controleaz condensarea cromozomilor. 3. Factorul retardant al fazei M ce este ADN-dependent, prezent de asemenea n citoplasma celulelor S i care inhib producia de MPF i n consecin intrarea celulelor n mitoz. Producia sau dispariia brusc a acestor factori difuzibili n citoplasm sunt elemente definitorii ale ciclului celular, iar perioadele ce separ aceste evenimente determin durata/lungimea total a ciclului.Relaiile cauzale dintre aceti factori i probabil dintre acetia i alii care sunt nc necunoscui garanteaz realizarea proceselor fundamentale ale ciclului ntr-o ordine strict determinat i totodat prevenirea unor anomalii cu consecine fatale asupra celulelor. Fiecare dintre etapele succesive ale ciclului celular depinde de buna desfurare a etapei precedente. Astfel celulele nu pot intra n mitoz dect dup sinteza MPF, acesta nu poate fi produs dect dup ce factorul retardant a disprut, factorul retardant i activatorul fazei S nu dispar dect dup replicarea completa a ADN-ului .a.m.d. Deci evenimentele ciclului celular sunt nlnuite ntre ele ntr-o ordine secvenial.ALTE MODELE DE STUDIU ALE CONTROLULUI CICLULUI CELULARStudiile realizate pe ovocitele (oule) i embrionii de Xenopus laevis au fost deosebit de utile pentru analiza controlului molecular al ciclului cromozomial. Ca modele celulare pentru asemenea studii se bazeaz pe mai multe considerente: talia celular excepional (diametrul de cca. 1mm pentru ovocitele fecundate), existena unei importante rezerve de substane acumulate n citoplasm, rezerv care conine aproape toate materialele intracelulare necesare unor cicluri de diviziune repetate. n plus, dup fecundaie, oul se divide foarte rapid rezultnd un embrion format din mii de celule. Ovocitul (oul imatur) este o celul blocat n faza G2 a primei diviziuni meiotice, care a acumulat o cantitate important de rezerve nutritive n citoplasm. Sub influena hormonilor ce acioneaz n momentul ovulaiei are loc maturarea ovocitului care progreseaz n diviziunea meiotica astfel nct n momentul depunerii pontei el se gsete blocat n faza M a celei de a 2-a diviziuni meiotice. Fecundaia declaneaz n continuare o serie uimitor de rapid de diviziuni ale oulor ce conduce la clivarea acestora ntr-un mare numr de celule embrionare, aceste diviziuni avnd o caracteristic eseniala: nu se nregistreaz nici o cretere a taliei oului fecundat n urma diviziunilor. Dup prima diviziune mitotica ce dureaz aproximativ 90 de minute se produc 11 diviziuni mai mult sau mai puin sincrone, o data la 30 de minute, astfel ntr-o perioad de 7 ore embrionul va avea 212 celule, adic 4096 de celule. n cursul acestor diviziuni rapide are loc doar sinteza macromoleculelor de ADN i a unei game foarte limitate de proteine. Acumularea prealabila de materiale intracelulare permite aceast succesiune de diviziuni rapide i totodat suprimarea timpului necesar creterii celulare pe parcursul fiecrui ciclu celular. Embriogeneza timpurie la Xenopus consta n esena ntr-o succesiune de cicluri de replicare i diviziune ale ADN-ului n care fazele S i M sunt accelerate, iar fazele G1 i G2 sunt att de scurte nct devin aproape nedecelabile. Talia considerabila a ovocitelor i oulor fecundate de Xenopus a permis totodat izolarea i studiul factorilor moleculari implicai n controlul fazelor ciclului celular, n special a MPF. S-a constatat c ovocitele blocate n G2 conin cantiti reduse de MPF pe cnd ovulele mature aflate n faza M au un nivel ridicat de MPF citoplasmatic. Ciclurile rapide de diviziune ale oulor induse de fecundaie coincid cu ciclurile repetate ale MPF ce oscileaz ntre concentraii reduse i concentraii crescute corespunztoare fazei M. Mai mult dect att, microinjectarea ovocitelor cu citoplasma provenit din ovule a determinat antrenarea primelor n faza M care a fost detectat prin observarea unui fus mitotic n apropierea suprafeei celulare, pe cnd injectarea ovocitelor cu citoplasm dintr-o celula G2 nu a produs nici o progresie n ciclul celular. n prezent, se cunoate faptul ca MPF prezint o importan universal pentru celulele eucariote i este nalt conservat n cursul evoluiei. De exemplu, extractele purificate de MPF provenite din celule mitotice foarte diferite (ex. celule mamaliene, celule de molute, de drojdii i altele) pot prin injectare s induc mitoza n ovocitele de Xenopus. S-a reuit de asemenea purificarea unei molecule cu activitate de tip MPF din ovocitele mature de Xenopus. Aceasta este o protein (complex proteic) de talie mare i care este format din 2 subuniti: o protein kinaza i o a doua subunitate ce este fosforilata de prima. Altfel spus, MPF este capabil de autoactivare, adic sub aciunea unei mici cantiti de MPF injectat ntr-un ovocit imatur se sintetizeaz o cantitate important din acest compus din rezervele inactive de MPF ale celulei receptoare. Aceste constatri sugereaz faptul ca apariia si dispariia MPF n cursul ciclului celular depinde de fosforilarea, respectiv defosforilarea acestei molecule mai curnd dect de sinteza de novo a sa sau de degradarea ei.LEVURILE UN SISTEM MODEL DE STUDIU A CICLULUI CELULARLevurile sunt ciuperci unicelulare ce formeaz un grup destul de heterogen de organisme. n timp ce oule de Xenopus reprezint un valoros obiect de studiu al biologiei i biochimiei controlului ciclului celular, drojdiile sunt utilizate frecvent ca modele celulare pentru identificarea, clonarea i caracterizarea direct a genelor implicate n controlul acestui proces. Orientarea cercetrilor de acest tip spre drojdii este motivat n primul rnd de capacitatea lor de multiplicare foarte rapid care este comparabil chiar cu cea a bacteriilor i de asemenea de dimensiunea foarte redus a genomului lor care reprezint mai puin de 1% din genomul mamiferelor. Speciile de levuri care sunt consacrate n studiile complexe de biologie celular si genetic aparin la 2 mari grupe care sunt difereniate dup modalitatea lor fundamental de diviziune: - drojdii care nmuguresc > Saccharomyces cerevisiae (drojdia de bere), specie care se divide ntr-o manier asimetric, celula mam dnd natere unei celule fiice de mici dimensiuni care poarta numele de mugure care n continuare crete i la un moment dat se separ de celula mam. - drojdii fisionabile (fisipare) -> Schizosaccharomyces pombe (drojdie de bere african), se divid simetric, rezultnd dou celule fiice identice.Dei distana filogenetic dintre cele 2 tipuri de drojdii este apreciabil, ciclurile lor vitale sunt totui similare. Astfel, ambele specii prolifereaz prin diviziuni mitotice rapide, att n stare haploid ct si diploid sau sufer meioza n condiii nefavorabile de cultur (carene nutritive), dnd natere la asce cu ascospori. Celulele haploide pot fuziona ntre ele, deci conjug, formnd celule diploide sau asce. Diferena principal dintre cele dou specii const n ponderea relativ a celor 2 stri cromozomiale (diplofaza i haplofaza) fa de care se subordoneaz i desfoar i celelalte faze ale ciclului lor celular i anume:-diplofaza care este predominant la S. cerevisiae-haplofaza care este predominant la Schizo. PombeExistena unei faze haploide decelabile dei de durat diferit la cele 2 specii de levuri faciliteaz analiza lor genetic i permite totodat izolarea de mutante care sunt deficiente ntr-o anumit funcie. Aceast posibilitate este foarte redus ns n cazul celulelor diploide. n cazul ambelor drojdii fenomenul de sexualitate i compoziia mediului de cultur joac un rol esenial n controlul ciclului celular. MUTANTE N CICLUL DE DIVIZIUNE CELULAR (MUTANTE CDC - CELL DIVISION CYCLE)Identificare genelor implicate n controlul ciclului celular presupune nu doar utilizarea unor mutante adecvate ci i a metodelor corespunztoare de obinere i cultivare, meninere a acestor mutante. Deoarece n principiu alterarea mecanismelor ciclului celular inhib n final diviziunea celular, n practic nu se utilizeaz orice tip de mutante, ci aa numitele mutante condiionate la care fenotipul mutant nu se exprim dect n anumite condiii determinate. Cele mai frecvent utilizate mutante condiionate sunt cele de tip termo-condiionate adic cele la care structura unei gene este doar uor modificat, ceea ce face ca aceasta s activeze normal ntr-un domeniu de temperatur (temperatur permisiv) dar sa nu funcioneze ntr-un alt domeniu termic (temperatur restrictiv). Pentru mutantele termo-sensibile n general temperaturile sczute sunt permisive, iar cele ridicate sunt restrictive. Mutantele termo-sensibile, cresc i se dezvolt normal la temperaturile permisive, dar prin ridicarea temperaturii are loc inactivarea genei investigate, iar fenotipul mutant devine analizabil. n cazul mutaiilor n ciclul celular (mutante de tip CDC) se produce blocarea celulelor ntr-o etap specific a ciclului celular la temperatura restrictiv. De exemplu n cazul drojdiilor care nmuguresc prezena i talia mugurelui furnizeaz informaii directe asupra fazei ciclului celular n care celula mutant CDC este blocat. n cazul speciei S. pombe aceast analiz este mai complex. La mutantele CDC termosensibile n general se constat o cretere celular continu indiferent de faza n care ciclul celular este blocat. i n cazul altor mutante termic-dependente care sunt mutante non-CDC dar sunt defective n procesele de biosintez (ex. producia de ATP) are loc n schimb oprirea aleatorie a celulelor n orice etap a ciclului celular n momentul epuizrii rezervelor lor biochimice. Graie utilizrii acestui tip de mutante peste 50 de gene CDC au fost identificate la cele 2 specii de drojdii. Produii unor gene CDC au fost identificai i apoi definii biochimic i funcional. De exemplu, mutantele CDC n faza S prezint deficiene n codificarea fie a ADN-ligazei, fie a enzimelor necesare sintezei precursorilor ADN-ului. Blocarea celulelor mutante CDC ntr-o etap definit a ciclului celular, etap n care genele CDC respective se manifest, demonstreaz faptul c la levuri i n general la organismele superioare levurilor, ciclul celular const ntr-o secven nlnuit de evenimente n care trecerea ntr-o nou etap este condiionat de finalizarea corect a etapei precedente. Analiza celulelor purttoare a unei combinaii de mutaii CDC n schimb demonstreaz c evenimentele ciclului cromozomial de exemplu, se desfoar ntr-o succesiune care nu este strict dependent de secvena de evenimente ale ciclului citoplasmatic sau ciclului centrosomal. Studiul unor mutante de S. cerevisiae crescute la temperaturi non-permisive arat c celulele se opresc ntr-o faz determinat a unuia dintre cele 3 cicluri fr ca celelalte 2 cicluri s se opreasc, cel puin parial. Aceste mutante sunt: CDC 28 care este blocat n faza G1 la punctul de start. Centriolul (corp polar al fusului sau SPB Spindle Polar Body) acestor celule nu este duplicat i nici cromozomii nu sunt replicai; CDC 31 la aceasta SPB nu este duplicat, ADN este replicat n schimb, iar mugurele a emers deja; CDC 24 SPB si ADN-ul s-au duplicat, in schimb nu se formeaza mugurele; CDC 8 SPB este duplicat, mugurele a aprut dar ADN-ul nu s-a replicat.n concluzie, existena acestor mutante demonstreaz c ciclul cromozomial, citoplasmatic i centrosomal sunt relativ independente ntre ele. De asemenea din aceste exemple rezult faptul c atunci cnd citodiereza este blocat (n cazul mutantei CDC 24) aceste mutante i continu ciclul suferind mai multe replicri ale ADN-ului i diviziuni nucleare aprnd astfel celule plurinucleate care se ntlnesc nu numai la drojdii ci i la eucariotele superioare.

Viteza de cretere i diviziunea unor organisme celulare simple (drojdiile) depind n mod esenial de aportul nutritiv al mediului de cultur. n condiii trofice defavorabile, teoretic, drojdiile au la dispoziie 2 alternative pentru a crete i a se nmuli:a) nmulire cu vitez constant prin cicluri rapide de diviziune. O astfel de cale ar conduce la o reducere progresiv a taliei celulelor n cursul ciclurilor succesive de diviziune, rezultnd n final celule extrem de mici care sunt incapabile de supravieuire.b) reducerea vitezei de replicare pn n momentul n care celulele ating o talie normal dup care ele pot intra n diviziunea celular. Aceast posibilitate care const efectiv n rspunsul celular n condiii de caren nutritiv, conduce la o meninere mai mult sau mai puin constant a dimensiunii celulare n cursul diviziunii succesive. Rezult aadar c celulele de drojdii au nevoie de un mecanism de control al duratei ciclului celular precum i al vitezei de diviziune. Acest control este dependent de viteza de cretere a celulelor.Deoarece sinteza ADN-ului i mitoza sunt procese biochimice complexe, dificil de ncetinit sau chiar de ntrerupt, altfel spus, fazele S i M sunt relativ constante, rezultnd c n cazul drojdiilor precum i n cel al eucariotelor superioare, doar lungimea fazei G1 poate fi influenat i prelungit n condiiile nutritive defavorabile.n consecin, la levuri, similar eucariotelor superioare, controlul ciclului celular se exercit n primul rnd prin controlul duratei fazei G1 la sfritul creia exist un punct critic a crui depire pemite derularea restului ciclului independent de condiiile de mediu. Acest punct este denumit punct de plecare sau START i este echivalent cu punctul de restricie de la celulele de mamifer.Pentru celulele de S. cerevisiae crescute n medii care au carene nutritive, G1 apare ca o perioad de cretere lent, iar ieirea din G1 prin depirea startului se produce numai atunci cnd celulele ating o talie standard.n mediile bogate nutritiv, faza G1 este mai scurt, dar talia celular, n momentul atungerii startului este practic aceeai.Dac se modific condiiile de cretere, pentru a se obine celule anormal de mari sau anormal de mici, dup diviziune, aceste celule i vor scurta, respectiv prelungi staionarea n G1 n aa fel nct vor depi de start numai atunci cnd se vor situa n jurul taliei standard.Se cunosc relativ puine lucruri n legtur cu mecanismele de recunoatere de ctre celulele unei anumite talii. O posibil explicaie a acestui fenomen, valabila pentru toate celulele eucariote, este aceea c dimensiunile celulare sunt n general propoionale cu starea de diploidie a celulelor respective. O celul diploid este de cca de dou ori mai voluminoas dect o celul haploid, iar una tetraploid de cca dou ori mai voluminoas dect una diploid. Aceste observaii sugereaz faptul c factorul critic n aceast privin este raportul dintre volumul celular i numrul de copii ale genelor sau altfel spus, raportul dintre volumul celular i cantitatea total de ADN. Acest raport se mai numete raport nucleo-citoplasmatic.n aceast perspectiv, o molecul difuzibil cum ar fi de exemplu un tip de ARN, va fi sintetizat ntr-o doz proporional cu cantitate de ADN nuclear. Atunci cnd volumul celular crete, concentraia moleculei difuzibile considerate i va diminua proporia, devenind astfel insuficient pentru susinerea unei funcii importante a celulei. Prin urmare, aceast diminuare de concentraie, sub un anumit nivel, poate reprezenta semnalul necesar pentru depirea punctului de start. Oricare ar fi mecanismul implicat, depirea punctului de start corespunde unei modaliti profunde a ctorva sisteme de comutare molecular. Codificarea compuilor acestui sistem de control este asigurat de mai multe gene CDC (4 gene de aciune tip, ntlnite la drojdiile nmuguritoare, 2 gene la drojdiile fisionabile), gene care funcioneaz n perioada sau n proximitatea punctului de start. Dintre aceste gene, 2 prezint un interes deosebit, i anume gena CDC-28 de la S. cerevisiae i CDC-2 de la S. pombe. Aceste gene prezint i o alt particularitate, de mare importan, n special n cazul drojdiilor fisionabile, adic produsul lor de sintez nu este esenial numai pentru depirea startului, ci i unui al doilea punct de control al ciclului i anume iniierea fazei M.Celulele eucariote de la organismele superioare care reprezint un punct de restricie la sfritul fazei G1, analog cu punctul de start de la drojdie, au un sistem de control mult mai complez dect cel al drojdiilor. Genele CDC-28 si CDC-2 au fost izolate i studiate prin tehnici de inginerie genetic care preteaz foarte bine pe celulele de drojdie. Astfel, fragmente de ADN, provenite din celule normale sau de tip slbatic de levuri, au fost clonate n plasmide bacteriene, construind n final bnci de ADN de drojdii, transfectate n celule CDC mutante. Rarele plasmide ce conineau CDC-slbatic au permis selectarea genelor CDC-normale, deoarece acestea permit celulelor mutante gazd s-i completeze eficiena, adic s se divid la temperatur restrictiv. Aceast metod a permis clonarea att a genei CDC-28 la S. cerevisiae ct i a genei CDC-2 la S. pombe, precum i descoperirea unor corespondene remarcabile n privina punctelor de start i al mitozei, att la cele dou drojdii, ct i la vertebrate.Secvena precum i funcia genelor CDC28 i CDC2 sunt analoge la cele 2 tipuri de drojdii. Ca atare, deficienele CDC2 la celulele mutante pot fi compensate prin introducerea genei CDC28 n celulele drojdiei fisionabile.Aceleai deficiene pot fi anulate prin clonarea unui segment de ADN uman n celulele de Schizosaccharomices pombe, segment a crui secven este complementar cu cea a genelor CDC2 i CDC28. Toate aceste experimente sugereaz faptul c acest element de control al ciclului celular este comun la levuri, mamifere i probabil la toate eucariotele.Clonare genei CDC2 a permis totodat i izolarea relativ facil a proteinei pe care acesta o codific. Aceast protein este o preotein-kinaz ce pare a fi omolog cu subunitatea protein-kinazic a MPF-ului de la vertebrate. Tot prin clonare sa demonstrat c o alt gen CDC da la drojdiile fisionabilitate i anume gena CDC3 al crui produs interacioneaz cu cel al genei CDC2 este strns nrudit cu gena ciclinei. Aceste descoperiri indic faptul c MPF i ciclina prezint o importan universal n controlul ciclului celular al eucariotelor.Dublul rol al genelor CDC2 i CDC28, adic de control al startului precum i de control al iniierii mitozei sugereaz c subunitile corespondente ale MPF de la vertebrate ar putea fi implicate ntr-o anumit manier i n controlul iniierii fazei S la drojdii.Conform datelor obinute pe drojdiile fisionabile, variaiile strii de fosforilare ale acestei molecule reglatoare pot constitui un mijloc de ajustare a vitezei de iniiere a unui ciclu de diviziune n funcie de condiiile de mediu.

CONTROLUL DIVIZIUNII CELULARE I AL CICLULUI CELULAR LA ORGANISMELE PLURICELULAREn cazul organismelor unicelulare de tipul levurilor, bacteriile, protozoarelor, unde exist o puternic presiune selectiva, pentru ca celulele s cresc i s se divid ct mai rapid, viteza de derulare a ciclului celular nu este limitat dect de viteza de preluare i transferul nutrienilor n rezerve nutritive intracelulare. n schimb, organismele pluricelulare sunt entiti specializate ale unor colectiviti complexe, ceea ce face ca supravieuirea organismelor s primeze fa de supravieuirea i proliferarea celulelor individuale. Pentru ca organismele s supravieuiasc, unele celule trebuie s-i limiteze diviziunea, chiar dac nutrienii sunt prevzui din abunden.Cu toate acestea, pierderile celulare, produse accidental prin leziuni sau datorit senescenei i morii celulare sunt compensate rapid prin intrarea n diviziune a altor celule.La organismele pluricelulare sunt necesare deci mecanisme complexe de reglare a ciclului celular ce funcioneaza suplimentar sau additional fa de cele ale unui organism simplu (ex: drojdiile). La organismele pluricelulare se poate vorbi aadar de un control social al diviziunii celulare.

DURATA CICLULUI DE VIATA LA ORGANISMELE PLURICELULARECele circa 1013 celule ale corpului uman se divid cu viteze foarte diferite. In functie de durata ciclului lor celular, celulele umane, de exemplu, se impart in trei categorii: categoria1 celule nervoase si fibre musculare scheletice care sunt celule ce nu se divid, categoria a 2a celule hepatice care se divid in mod obisnuit anual sau chiar o data la doi ani de zile, categoria a 3a celule epiteliale, intestinale, ce se divid de circa 2 ori pe zi asigurand astfel o reinnoire constanta a suprafetei luminale a intestinului. La nivelul intestinului subtire, de exemplu, celulele care se divid sunt cantonate la baza criptelor intestinale ce reprezinta invaginari digitiforme localizate langa vilozitatile intestinale. Ele formeaza un inel de circa 20 de celule stem ce functioneaza ca celule susa pentru staturile celulare superioare si au o durata a ciclului celular de circa 24 de ore. Deasupra lor se gaseste un manson de celule cu diviziune rapida (o data la 11 ore) celule provenite din celulele susa. In fine, extremitatea superioara a criptei este formata din celule dediferentiate care nu se mai divid numite celule quescente si impinse progresiv spre vilozitatile intestinale datorita diviziunii celulelor subiacente. Aceste celule sunt eliminate in final la varful vilozitatii, durata lor totala de viata fiind cuprinsa astfel intre 3-5 zile. Marea majoritate a celulelor vertebratelor se situeaza insa intre extremele reprezentate de categoria 1 si 3, altfel spus ele se divid, dar cu frecventa redusa. Ca si la unicelulare, durata ciclului de viata a celulelor vertebratelor depinde in mod hotarator de lungimea fazei G1. Astfel unele celule pot ramane blocate in aceasta faza saptamani sau chiar luni de zile. Timpul necesar parcurgerii fazelor S, G2 si M este insa remarcabil de constant pentru diferitele categorii de celule ale organismelor pluricelulare. Celulele blocate in G1 sunt denumite celule G0. Timpul petrecut de celulele aflate in etapa nonproliferativa G0 variaza nu numai in functie de tipul celular, ci si in functie de factorii externi. Printre acestia se numara si factorii umorali. De exemplu, hormonii sexuali stimuleaza celulele din peretele uterin sa prolifereze rapid timp de cateva zile dupa menstruatie pentru a compensa pierderile celulare din aceasta perioada. De asemenea, pierderile sanguine stimuleaza proliferarea precursorilor celulelor sanguine. Lezarea ficatului provoaca proliferarea regenerativa a hepatocitelor care se divid o data la una sau doua zile samd. Inteparea epiteliului cristalinului cu un ac provoaca un raspuns proliferativ prompt reparator al leziunii. Localizarea spatiala a diviziunilor celulare in acest exemplu s-a facut prin incubarea celulelor epiteliale ale cristalinului in timidina tritiata pe perioade determinate de timp. La sfarsitul fiecarei perioade, celulele au fost fixate si autoradiografiate. Developarea autoradiogramelor a permis identificare celulelor aflate in fazele S si M care contin precursorul incorporat. S-a constat ca stimulul de diviziune se propaga progresiv spre periferie incepand cu nivelul zonei lezate determinand iesirea celulelor din G0 si intrarea lor in diviziune. Zona circulara prezenta in autoradiograme reprezinta celulele aflate in faza S, circumscrie un nivel circular intern format din celule M. Cele doua zone se indeparteaza progresiv de centrul leziunii ca niste unde circulare datorita straturilor celulare aparute dupa diviziune care se aglomereaza dupa lezare. Dupa circa 40 de ore de la lezate, in jurul intepaturii apare un al doilea val circular de radioactivitate care arata intrarea celulelor in al doilea ciclu de sinteza al ADNului.

Majoritatea studiilor asupra ciclului celular realizate pe celulele cultivate s-au efectuat pe liniile celulare stabile cu proliferare nedefinita. Aceste linii celulare cum ar fi: liniile fibroblastice derivate din celulele 3T3-murine de la soarece sunt modele de studiu ale comportamentului proliferativ ale celulelor somatice normale. Celulele acestor linii se divid mai rapid atunci cand se fixeaza pe suprafata vasului de cultura si sunt crescute intr-un mediu bogat in nutrienti si care contine suplimentar ser sanguin. Daca se reduce insa aportul unui anumit constituient nutritiv sa zicem de exemplu un aminoacid si se adauga in mediu un inhibitor al proteosintezei, celulele se comporta intr-o maniera asemanatoare cu cele de drojdii. Si anume durata medie a fazei G1 creste, iar durata restului ciclului celular este putin afectata. O data ce celulele au iesit din G1 ele sunt pregatite sa finalizeze si fazele S, G2 si M indiferent de conditiile de mediu. Deci similar celulelor de levuri, care poseda un punct de start in ciclul celular, la celulele eucatiotelor pluricelulare exista un punct de restrictie notat cu R situat la sfarsitul fazei G1. R reprezinta punctul in care celulele se opresc din crestere, in conditii de mediu limitative si care o data depasit permite derularea celorlalte faze ale ciclului, semnificatia punctului R este mai complexa decat cea a startului de la levuri fiind posibil sa existe mai multe puncte de restrictie usor diferite in G1 corespunzator unui control multiplu al proliferarii celulare. Observarea celulelor care se divid rapid in cultura prin cronofotografiere a aratat ca desi aceste celule sunt genetic identice, durata generatiilor celulare aparute prin diviziune este foarte variabila. Duratele variabile de diviziune par a fi dependente de anumite evenimente aleatorii care survin mai ales in timpul fazei G1 a ciclului celular. Pe masura ce celulele se apropie de punctul de restrictie R unele dintre ele par ca raman in asteptare inaintea de depasirea acestui punct. Astfel aproximativ jumatate dintre celule depasesc punctul R in primele trei ore, jumatate din celulele restante in urmatoare trei ore, jumatate din jumatatea restanta in inca trei ore si asa mai departe. Indiferent de cauzele acestei intarzieri, variabilitatea aleatorie a lungimii ciclului celular la celulele cultivate indica faptul ca populatiile celulare initiale sincrone isi pierd sincronizarea de-a lungul catorva generatii celulare care se succed. Acest comportament poate fi avantajos pentru organismele pluricelulare deoarece in conditiile unui sincronism proliferativ ar rezulta clone celulare de talie mica formate in general din celule rotunde care ar realiza putine contacte celulare cu restul tesutului afectandu-i astfel integritatea tesutului.Pentru celulele animale, conditiile necesare cresterii si diviziunii sunt mult mai complexe decat pentru celulele de drojdii. De exmeplu, daca celulele mamaliene sunt introduse intr-un mediu complet lipsit de ser, ele nu vor depasi punctul de restrictie oprindu-si cresterea si progresia in ciclul cromozomial. Studiile complexe au relevat faptul ca componentele esentiale ale serului sunt proteine foarte specifice existente in concentratii foarte mici (10-9 10-11 M) . Unele dintre aceste proteine sunt direct si specific implicate in stimulare diviziunii celulare fiind denumite factori de crestere. Izolarea PDGF a plecat de la urmatoarea observatie: fibroblastele cultivate prolifereaza in prezenta serului sanguin in timp ce plasma sanguina nu exercita un asemenea efect. Explicatia acestei observatii este aceea ca plachetele sanguine care se aglomereaza in trombus in timpul coagularii sunt stimulate si isi elibereaza continutul veziculelor lor in ser. PDGF impreuna cu factorii coagularii fac parte dintre produsii eliberati in serul sanguin si reprezinta principalul responsabil pentru proliferarea fibroblastelor din cultura. In vivo se pare ca PDGF are acelasi efect cu cel observat in cultura, stimuland diviziunea celulelor conjunctive si a celulelor musculare netede la nivelul unei leziuni favorizand in felul acesta cicatrizarea. La nivelul leziunilor, PDGF este produs probabil si de alte celule cum ar fi de exemplu macrofage, fibre musculare netede ale vaselor de sange si celulele endoteliului vascular. Celulele strimulate de PDGF au receptori specifici pentru acest factor de crestere cat si receptoori pentru alti factori la nivelul membranelor lor. Alte celule prezinta configuratii diferite ale receptorilor membranari ce intervin in raspunsul la diferiti factori de crestere dintre care unii sunt prezenti in ser. Factorii de crestere au fost dificil de izolat deoarece sunt secretati in doze foarte mici si deoarece majoritatea celulelor necesita o combinatie de factori de crestere si nu doar unul singur pentru dezvoltarea si proliferarea lor. Numarul de factori de crestere cunoscuti pana in prezent (>30) nu este foarte mare deoarece unii dintre ei descoperiti initial in contexte diferite au fost ulterior sinonimizati primind statulul de molecule unice. Aceasta constatare numerica sugereaza ca sunt necesare combinatii formate dintr-un numar mic de factori de crestere pentru reglarea specifica a proliferarii a numeroase tipuri de celule din care este alcatuit organismul unui animal superior. Unii factori de crestere sunt prezenti in circulatie dar majoritatea actioneaza ca MCL. Familia mediatorilor chimici locali cuprinde probabil un numar mai mare de factori de crestere inca insuficient definiti ce participa la reglarea diviziunii si a diferentierii celulare. In afara de factorii de crestere care stimuleaza divizunea celulara exista si factori compensatori care o inhiba si care in majoritate sunt inca necunoscuti. Exemple de factori de crestere si actiunile acestora: PDGF stimuleaza proliferarea celulelor conjunctive dar si a celulelor gliale. EGF determina proliferarea numeroaselor tipuri de celule Somatomedinele A si C impreuna cu PDGF si EDF determina stimularea proliferarii adipocitelor si a celulelor conjunctive FGF stimuleaza proliferarea fibroblastelor, a celulelor endoteliale, a mioblastelor si a altor categorii de celule NGF favorizeaza cresterea axonilor si supravietuirea neuronilor Interleukina 2 (IL2) stimuleaza proliferarea limfocitelor T.