CERCETĂRI PRIVIND CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI … · TEZĂ DE DOCTORAT - Cercetări privind...

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ

CLUJ-NAPOCA ŞCOALA DOCTORALĂ

Facultatea de Medicină Veterinară

SOTOC OCTAV CORNELIU SORIN

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CERCETĂRI PRIVIND CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI

SEMINAL DE VIER

Conducător ştiinţific, Prof. Univ. Dr. IOAN GROZA

_________________________________________________________

Cluj-Napoca 2011

TEZĂ DE DOCTORAT - Cercetări privind crioconservarea materialului seminal de vier ==========================================================================

INTRODUCERE

Debutul activităţii de congelare a materialului seminal de vier a fost semnalat în anul 1956, atunci când Polge a realizat cu succes această procedură pentru sperma de taur.

Cercetările realizate ulterior pe sperma de vier au demonstrat un fapt neaşteptat, şi anume – răspunsul la răcire şi congelare diferă între sperma de vier şi cea de taur. Astfel, s-a demonstrat clar faptul că diferenţele de sensibilitate ale spermatozoizilor mamiferelor la crioconservare, face aproape imposibilă extrapolarea unor tehnici stabilite, de la o specie la alta.

Eforturile în direcţia congelării spermei de vier au fost încununate cu succes în 1970, când s-a obţinut fertilizarea ovulelor după inseminare intraoviductală cu spermă congelată şi apoi decongelată (Woelders H. şi col., 2005). Acest succes a fost urmat şi de altele, procedeul de inseminare fiind de această dată intracervicală (Crabo şi col., 1971; Graham şi col., 1971; Pursel şi col.,1971).

Concluzia generală a specialiştilor din domeniu a fost că, sperma congelată de vier prezintă o fertilitate redusă, chiar şi în cazul măririi numărul de spermatozoizi per doză (Johnson şi col., 1982; Johnson, 1985,1989).

Cauzele reducerii performanţelor fecundante ale materialului seminal de vier supus în prealabil proceselor congelării/decongelării se presupune a fi datorate:

reducerea viabilităţiiţii şi motilităţii spermatozoizilor la congelare /decongelare; sensibilitatea crescută a spermatozoizilor de vier la crioconservare; experienţei personalului.

CERCETĂRI PROPRII Scopul lucrării

Dată fiind importanţa acestei biotehnologii, cercetările efectuate s-au orientat spre câteva direcţii prioritare:

îmbunătăţirea metodelor de apreciere a parametrilor spermatici, prin introducerea analizei morfocitometrice, care completează metodologia existentă bazată strict pe aspectele morfologice;

determinarea eficienţei congelării prin utilizarea mai multor medii standardizate destinate diluării pre - congelare a materialului seminal de vier;

elaborarea şi testarea unor medii originale pentru prelucrarea şi congelarea materialului seminal de vier;

stabilirea transformărilor calitative survenite pe parcursul congelării, mai ales din punct de vedere morfocitometric şi a evoluţiei temporale post-decongelare;

estimarea ratei de gestaţie a materialului seminal obţinut, prin tehnica inseminării artificiale;

determinarea, prin inseminare artificială, a calităţii materialului seminal congelat cu medii de congelare standardizate şi materialului seminal congelat prin utlizarea mediilor proprii.

I


EVALUAREA ŞI SELECŢIA VIERILOR ÎN VEDEREA CRIOCONSERVĂRII MATERIALULUI SEMINAL

SCOPUL CERCETĂRII

Obiectivul acestui capitol îl constituie aprecierea calităţii materialului seminal, precum şi stabilirea pretabilităţii acestuia la metodele de prelucrare şi congelare. Materialul seminal a fost examinat luându-se în considerare vârsta donatorilor şi urmărirea diferenţelor dintre parametri în funcţie de categoria de vârstă. De asemenea ne-am propus îmbunătăţirea sistemului de apreciere morfologică a spermatozoizilor suini prin introducerea în practica curentă, la specia suină, a evaluării morfocitometrice a lungimii şi lăţimii capului spermatozoizilor.

MATERIAL ŞI METODĂ Cercetările au fost efectuate în perioada februarie 2007 – noiembrie 2010 în

cadrul Clinicii de Reproducţie, Obstetrică şi Ginecologie Veterinară a Facultăţii de Medicină Veterinară din Cluj-Napoca în colaborare cu o fermă privată din judeţul Arad.

Au fost analizate ejaculatele provenite de la 20 vieri din rasa Marele Alb şi Landrace. Vierii au fost grupaţi, în funcţie de vârstă în două loturi experimentale:

lotul I alcătuit din 10 vieri, câte 5 din fiecare rasă, introduşi recent la reproducţie, cu vârsta cuprinsă între 8 luni şi 1,5 ani;

lotul II alcătuit din 10 vieri, câte 5 din fiecare rasă, utilizaţi intensiv la reproducţie, cu vârsta cuprinsă între 2 şi 3,5 ani.

Vierii au fost întreţinuţi în condiţii asemănătoare, fiind cazaţi în boxe individuale, dispuse în acelaşi adăpost. Animalele au fost hrănite cu acelaşi tip de furaj, cantitatea variind cu greutatea corporală a fiecăruia.

Recoltarea materialului seminal s-a efectuat în unitatea de provenienţă a vierilor, împreună cu membri colectivului Disciplinei de Reproducţie, Obstetrică şi Ginecologie Veterinară, asistaţi de personalul unităţii respective.

Din motive operaţionale şi comerciale, recoltarea materialului seminal s-a efectuat de trei ori consecutiv (la interval de 7 zile) realizându-se de fiecare dată evaluarea materialului seminal. Menţionăm că recoltările s-au realizat în aceeaşi zi pentru toţi vierii.

Materialul seminal a fost recoltat prin metoda manuală după saltul vierului pe manechin

Evaluarea materialului seminal a presupus efectuarea unei analize macroscopice completate de un examen microscopic şi de efectuarea citomorfometriei sprematozoizilor. Analiza macroscopică realizată imediat după recoltare a vizat determinarea următorilor parametri: volum, miros, culoare. Aprecierea microscopică a urmărit determinarea concentraţiei (cu aparatul SpermaCue®), mobilităţii, densităţii, viabilităţii (coloraţia intravitală cu eozină 5%) şi descrierea morfologiei (fiziologice sau patologice) a spermatozoizilor (coloraţia Spermac). Morfocitometria s-a realizat cu ajutorul microscopului optic cu inversie şi a computerului, utilizîndu-se soft-ul Motic™ Images Plus aflat în dotarea laboratorului Spermolab, din cadrul Disciplinei de Reproducţie, Obstetrică şi Ginecologie Veterinară. Din punct de vedere al tehnicii,

II


aceasta a presupus măsurarea computerizată a lungimii şi lăţimii capului spermatozoizilor.

REZULTATE ŞI DISCUŢII

Aprecierea materialului seminal s-a axat pe determinarea parametrilor macro- şi microscopici specifici pentru fiecare vier, iar rezultatele obţinute au fost cuprinse în fişa andrologică întocmită individual. În funcţie de rezultatele obţinute probele au fost admise sau resprinse de la prelucrare în vederea crioconservării şi inseminării artificiale.

La lotul I, volumul de material seminal recoltat s-a încadrat între 52-160 ml la rasa Marele Alb şi între 62-184 ml la vierii din rasa Landrace. Valorile înregistrate privind concentraţia în spermatozoizi a materialului seminal au oscilat situându-se între 128 – 343 x 106 spermatozoizi/ml la rasa Marele Alb şi între 149 – 444 x 106

spermatozoizi/ml la vierii Landrace. Procentul de spermatozoizi mobili s-a încadrat între 55-80% pentru vierii Marele Alb şi între 55 – 87% pentru rasa Landrace. Analizând valorile viabilităţii spermatozoizilor la ambele rase de porci incluse în experiment se constată că acest parametru s-a încadrat între 65-90%. Din punct de vedere al examenului morfologic, spermatozoizii normali s-au regăsit în proporţie de 85-95% pentru cele două rase de vieri. Anomaliile de ordin primar s-a încadrat între 3-4,2% la rasa Marele Alb şi între 2,6-4% la rasa Landrace, iar cele secundare între 7,6 – 8% la Marele Alb şi între 5-7,4% la vierii din rasa Landrace. Referitor la lungimea capului spermatozoizilor se constată o mică diferenţă în favoarea vierilor din rasa Landrace (6,96 - 8,75 μm) faţă de rasa Marele Alb (6,50 – 8,60 μm). Lăţimea capului spermatozoizilor a oscilat între 2,80 – 3,94 μm la vierii Marele Alb şi între 3 – 4,10 μm la vierii Landrace.

La lotul II, volumul de material seminal recoltat a fost cuprins între 63-230 ml la vierii Marele Alb şi între 74-250 ml la vierii Landrace. Concentraţia spermatozoizilor a variat în limite foarte mari, fiind arareori motivul calităţii slabe a materialului seminal şi depăşind frecvent valoarea de 300 x 106 spermatozoizi/ml. Mobilitatea spermatozoizilor înaintea conservării a fost cuprinsă între 70-95% la rasa Marele Alb, iar la rasa Landrace între 75 – 95%. Viabilitatea spermatozoizilor a variat între 74-95% pentru vierii Marele Alb şi între 78-95% pentru cei din rasa Landrace. Procentul mediu de spermatozoizi morfologic normali depistaţi cu metoda Spermac a fost cuprins între 89,8 – 94% pentru ambele rase de porci incluse în experiment. Anomaliile spermatozoizilor au fost mai evidente la coloraţia Spermac, care a facilitat identificarea atât a anomaliilor primare, cât şi a celor secundare. În urma studiului citomorfometric al capului spermatozoizilor au fost evidenţiate diferenţe minore între lungime şi lăţime, mediile obţinute pentru parametri studiaţi încadrându-se în limite considerate normale pentru specia suină (tabel 1).

III


Centralizator privind valoarea medie a parametrilor spermatici Nr. lot Rasa Vol

(ml) C

(x 106 spz/ml) M (%) Vi (%)

Morfologie (%) Morfocitometrie(μm) N Ap As L l

Lot I M.A 117,66 236,33 67,46 82 88,33 3,86 7,80 6,50-8,60 2,80-3,94 L 120,40 290,73 71,66 83,66 90,33 3,53 6,13 6,96-8,75 3,00-4,10

Lot II M.A 174,20 349,46 85,20 88,80 91,46 3,20 5,33 7,26-8,74 3,15-4,23 L 182,40 405,40 88,73 90,60 92,66 2,73 4,60 7,79-8,84 3,84-4,37

M.A. – Marele Alb; L – Landrace; Vol. – volum; C- concentraţie; M – mobilitate; Vi. – viabilitate; N – spermatozoizi normali; Ap – anomalii primare; As – anomalii secundare; L- lungime cap; l – lăţime cap;

CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI SEMINAL DE VIER ŞI STABILIREA EFICIENŢEI ACESTEIA PRIN METODE DE LABORATOR

SCOPUL CERCETĂRII

Cercetările efectuate în acest capitol au avut menirea să răspundă mai multor scopuri, după cum urmează:

stabilirea eficienţei congelării prin utilizarea mai multor medii standardizate destinate diluării materialului seminal de vier;

elaborarea şi testarea unor medii de congelare proprii, originale pentru materialul seminal de vier;

estimarea modificărilor survenite pe parcursul congelării, din punct de vedere al mobilităţii, viabilităţii şi a morfologiei spermatozoizilor normali;

morfocitometria spermatozoizilor cu estimarea variaţiilor dimensiunilor acestora pe parcursul procesului de crioconservare;

utilizarea şi exprimarea evoluţiei temporale a indicilor calitativi ai materialului seminal post-decongelare, în funcţie de diluantul folosit pentru congelare

MATERIAL ŞI METODĂ

Cercetările s-au efectuat în intervalul calendaristic 2007-2010 pe un număr de 35 probe de material seminal, reprezentând 58,33% din totalul recoltat. Au fost acceptate spre prelucrare acele ejaculate care prezentau mai mult de 75% spermatozoizi mobili şi normali. Probele care au constituit subiectul cercetărilor au fost recoltate astfel:

la prima recoltare s-au obţinut 13 probe de material seminal; la a doua recoltare s-au obţinut 12 probe de material seminal; la a treia recoltare s-au obţinut 11 probe de material seminal.

Diluarea materialului seminal de vier Imediat după determinarea concentraţiei, materialul seminal a fost diluat,

aceasta fiind una dintre etapele premergătoare protocolului de conservare prin congelare.

În vederea diluării probelor de material seminal s-a testat eficienţa a trei medii de diluţie consacrate în literatura de specialitate:

mediul BTS® permite conservarea materialului seminal timp de 2 zile; mediul MERCK III® permite conservarea materialului seminal timp de 4 zile;

IV


mediul ANDROHEP® Plus permite conservarea materialului seminal timp de 7 zile.

a) b) c)

Mediile comerciale testate: a) BTS®; b) MERCK III®; c) ANDROHEP® Plus

Compoziţia mediilor de diluţie a fost modificată în mod original, rezultând

pentru fiecare mediu câte două variante experimentale. Crioconservarea materialului seminal de vier Crioconservarea probelor de material seminal s-a efectuat în cadrul

laboratorului de disciplinei de Reproducţie, Obstetrică şi Ginecologie Veterinară, după protocoalele descrise de Pena şi col., 2003, Bianchi şi col., 2008, cu modificări proprii propuse de colectivul disciplinei şi doctorand.

Tehnica de lucru presupune parcurgerea următorilor timpi: materialul seminal diluat în proporţie de 1:2 cu mediul de diluţie (MEDIUL A), preîncălzit la 32,5 0C, s-a repartizat în tuburi Falcon şi s-a menţinut timp de 1 oră la temperatura camerei (22oC);

tuburile s-au introdus în centrifuga cu temperatură reglabilă şi s-au menţinut la 15oC timp de 3 ore;

materialul seminal s-a centrifugat (3500rotaţii/min) timp de 10 minute, la 15oC;

Centrifugarea materialului seminal

după centrifugare, supernatantul s-a îndepărtat, iar sedimentul a fost resuspendat cu 80 ml β-lactoză şi 20 ml gălbenuş de ou (MEDIUL B);

V


temperatura probei obţinute s-a redus progresiv de la 15 la 5 0C, câte 0,2 0C/minut, după care s-a efectuat o a treia diluţie cu 89,5 ml MEDIUL C şi 9 ml glicerol 3% (MEDIUL D), menţinut la 4oC;

împaietarea s-a realizat în paiete de 0,5 ml, la temperatura de 4oC, folosind aparatul de împaietat semiautomat Filling&Sealling Machine (MiniTube);

congelarea s-a realizat în vapori de azot lichid, prin plasarea unui suport metalic pe care s-au aşezat paietele, deasupra acestuia, la o distanţă de 4-5 cm; temperatura de păstrare s-a diminuat de la 5 la -120 0C, cu o rată de scădere de aproximativ 30 0C/minut;

etapa finală a constat în transferarea paietelor de pe suportul metalic în cisterna containerului plin cu azot lichid.

Decongelarea materialului seminal de vier Decongelarea materialului seminal s-a efectuat prin plonjarea paietelor în baie

de apă la o temperatură de 38 oC timp de 20 de secunde. După decongelare, au fost apreciaţi microscopic următorii parametri spermatici: mobilitatea, viabilitatea, precum şi modificările morfologice şi morfocitometrice ale materialului seminal.

Aprecierea microscopică a materialului seminal


Protocolul de decongelare a materialului seminal din paiete a fost urmat de aprecieri în ceea ce priveşte mobilitatea, viabilitatea, morfologia şi morfocitometria spermatozoizilor. Rezultatele decongelării au fost trecute în fişele individuale de decongelare.

Testarea mediilor pe bază de BTS s-a soldat cu următoarele rezultate: testarea mediilor de congelare pe bază de BTS a permis menţinerea mobilităţii spermatozoizilor între 25 – 26% după efectuarea congelării;

viabilitatea spermatozoizilor în cazul congelăriii cu mediile BTS s-a situat între 28- 31%;

în privinţa procentului de spermatozoizi morţi valorile obţinute se încadrează între 69-72%;

procentul de spermatozoizi normali din punct de vedere morfologic înregistrat a fost cuprins între 86-91,5%;

VI


anomaliile s-au regăsit în procent de 8,50-14%. Evaluarea mediilor de congelare pe bază de MERCKIII a permis obţinerea

următoarelor rezultate: evaluarea mediilor de congelare pe bază de MERCKIII a permis obţinerea unei mobilităţii a spermatozoizilor cuprinsă între 25-28,1%;

viabilitatea spermatozoizilor supuşi congelării cu mediile MERCK s-a încadrat între 30-34%;


congelarea spermei de vier a permis obţinerea unor procente bune de spermatozoizi normali cuprinse între 89-93%;

anomaliile s-au regăsit în procent de 7-11%. Utilizarea mediilor de congelare pe bază de ANDROHEP® Plus s-a concretizat

cu următoarele rezultate: utilizarea mediilor de congelare pe bază de ANDROHEP® Plus a permis menţinerea mobilităţii spermatozoizilor între 26,6-28,1%;

viabilitatea spermatozoizilor supuşi congelării cu mediile ANDROHEP® Plus s-a încadrat între 31-34%;


congelarea spermei de vier a permis obţinerea unor procente bune de spermatozoizi normali cuprinse între 89-92%;

anomaliile s-au regăsit în procent de 8-11%. Analiza morfocitometrică a relevat valori considerate normale ale dimensiunilor

studiate (lungimea şi lăţimea capului spermatozoizilor) cu tendinţă discretă de reducere după congelare.

Determinarea parametrilor morfocitometrici

VII


APRECIEREA EFICIENŢEI CRIOCONSERVĂRII PRIN REALIZAREA DE INSEMINĂRI ARTIFICIALE

SCOPUL CERCETĂRII

Pe lângă aprecierile de laborator post-decongelare a materialului seminal congelat, în direcţia mobilităţii, procentului de spermatozoizi vii, procentelor de anomalii precum şi a rezistenţei şi persistenţei acestor parametri în timp, determinarea ratei de gestaţie se impune ca o metodă suplimentară şi, totodată, ca şi cea mai relevantă metodă de apreciere a eficienţei congelării şi a calităţii materialului seminal congelat. În consecinţă, inseminarea artificială a scroafelor cu material seminal obţinut prin utilizarea diferitelor medii de congelare, s-a practicat cu următoarele scopuri:

realizarea tratamentului hormonal de inducere şi sincronizare a căldurilor la scroafele receptoare;

compararea ratelor globale de gestaţie în cazul inseminării cu material seminal diluat sau congelat;

stabilirea pretabilităţii pentru inseminare artificială a trei medii de congelare obţinute prin metode proprii: BTS1, MIII2, A2;

trasarea ratei de gestaţie a scroafelor inseminate cu material seminal congelat în medii proprii .

MATERIAL ŞI METODĂ

Cercetările au fost efectuate în perioada 2007 - 2010 pe un efectiv de 180 scroafe de vârste şi rase diferite aparţinând unei ferme private din judeţul Arad, cu vârsta cuprinsă între 1-4 ani, metişi apartinand raselor Marele Alb şi Landrace.

Scroafele aflate în evidenţă, au fost repartizate în patru loturi a câte 45 de scroafe.

Tratamentul hormonal şi categoria de material seminal utilizată pentru inseminarea artificial

Nr. crt. Lot Nr. scroafe Tratament hormonal Categorie spermă 1 Lot I 45 Estru fiziologic Spermă diluată 2 Lot II 45 Estru fiziologic Spermă congelată 3 Lot III 45 Regumate individual în furaj Spermă diluată 4 Lot IV 45 Regumate individual în furaj Spermă congelată

Aspecte din timpul inseminării artificiale

VIII



Procentul de întoarceri a fost favorabil loturilor I şi II (0) comparativ cu loturile

(III şi IV) supuse tratamentului de inducere şi sincronizare a căldurilor la care s-au înregistrat valori cuprinse între 6,66 şi 11,11%. Instalarea gestaţiei la loturile inseminate artificial cu material seminal diluat a fost de 91,11% la lotul I şi de 80% la lotul III. La loturile inseminate artificial cu material seminal congelat gestaţia s-a confirmat în procent de 75,55 la lotul II şi de 68,88 la lotul IV. În cazul utilizării de material seminal congelat rata cea mai mare a gestaţiei a fost obţinută utilizând mediul A2 (26,66%), urmat de celelalte două medii la care s-au înregistrat valori cuprinse între 22,22-24,44%. Numărul mediu de purcei fătaţi a fost superior pentru loturile la care inseminarea artificială s-a realizat cu material seminal diluat (lotul I – 11,97 purcei/scroafă, lotul III - 11,15 purcei/scroafă) comparativ cu loturile la care s-a utilizat material seminal congelat (lotul II – 9,93 purcei/scroafă, lotul IV – 9,70 purcei/scroafă). Raportul s-a păstrat şi în ceea ce priveşte numărul de purcei înţărcaţi, valorile consemnate la loturile I şi III fiind cuprinse între 9,65 şi 10 purcei înţărcaţi/scroafă, iar la loturile II şi IV între 8,15 şi 8,51 purcei înţărcaţi/scroafă.

Rezultatele obţinute în urma inseminărilor artificiale

DIAGNOSTIC ESTRU FIZIOLOGIC SINCRONIZARE Lot I Lot II Lot III Lot IV

Estru 45 45 41 42 Anestru 0 0 4 3 G după primul ciclu 43 36 38 32 G după al II-lea ciclu 2 4 3 5 Negestante 0 5 4 5 Purcei născuţi 11,97 9,93 11,15 9,70 Purcei înţărcaţi 10 8,51 9,65 8,15

IX


CONCLUZII GENERALE

În urma cercetărilor efectuate în intervalul februarie 2007 – noiembrie 2010, pe un efectiv de 20 vieri, din rasele Marele Alb şi Landrace, cu vârste cuprinse între 8 luni şi 3,5 ani, sănătoşi din punct de vedere clinic, s-au formulat următoarele concluzii:

1. la lotul I, volumul de material seminal recoltat s-a încadrat între 52-160 ml la rasa Marele Alb şi între 62-184 ml la vierii din rasa Landrace;

2. valorile înregistrate la lotul I privind concentraţia în spermatozoizi a materialului seminal s- au situate între 128 – 343 x 106 spermatozoizi/ml la rasa MArele Alb şi între 149 – 444 x 106 spermatozoizi/ml la vierii Landrace;

3. procentul de spermatozoizi mobili în cazul vierilor din lotul Is-a încadrat între 55-80% pentru vierii Marele Alb şi între 55 – 87% pentru rasa Landrace;

4. analizând valorile viabilităţii spermatozoizilor la ambele rase de porci din lotul I se constată că acest parametru s-a încadrat între 65-90%;

5. din punct de vedere al examenului morfologic, spermatozoizii normali s-au regăsit în proporţie de 85-95% pentru cele două rase de vieri incluse în experimentele din lotul I;

6. la lotul I, anomaliile de ordin primar s-a încadrat între 3-4,2% la rasa Marele Alb şi între 2,6-4% la rasa Landrace, iar cele secundare între 7,6 – 8% la Marele Alb şi între 5-7,4% la vierii din rasa Landrace;

7. referitor la lungimea capului spermatozoizilor se constată o mică diferenţă în favoarea vierilor din rasa Landrace (6,96 - 8,75 μm) faţă de rasa Marele Alb (6,50 – 8,60 μm);

8. lăţimea capului spermatozoizilor a oscilat între 2,80 – 3,94 μm la vierii Marele Alb şi între 3 – 4,10 μm la vierii Landrace,

9. la lotul II, volumul de material seminal recoltat a fost cuprins între 63-230 ml la vierii Marele Alb şi între 74-250 ml la vierii Landrace;

10. în cazul lotului II, concentraţia spermatozoizilor a variat în limite foarte mari, fiind arareori motivul calităţii slabe a materialului seminal şi depăşind frecvent valoarea de 300 x 106 spermatozoizi/ml;

11. mobilitatea spermatozoizilor înaintea conservării a fost cuprinsă între 70-95% la rasa Marele Alb, iar la rasa Landrace între 75 – 95%;

12. viabilitatea spermatozoizilor a variat între 74-95% pentru vierii Marele Alb şi între 78-95% pentru cei din rasa Landrace;

13. procentul mediu de spermatozoizi morfologic normali depistaţi cu metoda Spermac a fost cuprins între 89,8 – 94 pentru ambele rase de porci incluse în cercetările din lotul II;

14. anomaliile spermatozoizilor au fost mai evidente la coloraţia Spermac, care a facilitat identificarea atât a anomaliilor primare, cât şi a celor secundare;

15. în urma studiului citomorfometric al capului spermatozoizilor au fost evidenţiate diferenţe minore între lungime şi lăţime, mediile obţinute pentru parametri studiaţi încadrându-se în limite considerate normale pentru specia suină;

16. testarea mediilor de congelare pe bază de BTS a permis menţinerea mobilităţii spermatozoizilor între 25 – 26 % după efectuarea congelării;

X


17. viabilitatea spermatozoizilor în cazul congelăriii cu mediile BTS s-a situat între 28- 31%;

18. procentul de spermatozoizi normali din punct de vedere morfologic înregistrat a fost cuprins între 86-91,5%;

19. evaluarea mediilor de congelare pe bază de MERCKIII a permis obţinerea unei mobilităţii a spermatozoizilor cuprinsă între 25-28,1%;

20. viabilitatea spermatozoizilor supuşi congelării cu mediile MERCK s-a încadrat între 30-34%;

21. congelarea spermei de vier a permis obţinerea unor procente bune de spermatozoizi normali cuprinse între 89-93%;

22. utilizarea mediilor de congelare pe bază de ANDROHEP® Plus a permis menţinerea mobilităţii spermatozoizilor între 26,6-28,1%;

23. viabilitatea spermatozoizilor supuşi congelării cu mediile ANDROHEP® Plus s-a încadrat între 31-34%;

24. congelarea spermei de vier a permis obţinerea unor procente bune de spermatozoizi normali cuprinse între 89-92%;

25. analiza morfocitometrică a relevat valori considerate normale ale dimensiunilor studiate (lungimea şi lăţimea capului spermatozoizilor) cu tendinţă discretă de reducere după congelare;

26. procentul de întoarceri a fost favorabil loturilor I şi II (0) comparativ cu loturile (III şi IV) supuse tratamentului de inducere şi sincronizare a căldurilor la care s-au înregistrat valori cuprinse între 6,66 şi 11,11%;

27. instalarea gestaţiei după primul ciclu de călduri la loturile inseminate artificial cu material seminal diluat a fost de 91,11% la lotul I şi de 80% la lotul III;

28. la loturile inseminate artificial cu material seminal congelat gestaţia s-a confirmat în procent de 75,55 la lotul II şi de 68,88 la lotul IV;

29. în cazul utilizării de material seminal congelat rata cea mai mare a gestaţiei a fost obţinută utilizând mediul A2 (26,66%), urmat de celelalte două medii la care s-au înregistrat valori cuprinse între 22,22-24,44%;

30. numărul mediu de purcei fătaţi a fost superior pentru loturile la care inseminarea artificială s-a realizat cu material seminal diluat (lotul I – 11,98 purcei/scroafă, lotul III - 11,15 purcei/scroafă) comparativ cu loturile la care s-a utilizat material seminal congelat (lotul II – 9,92 purcei/scroafă, lotul IV – 9,68 purcei/scroafă);

31. raportul s-a păstrat şi în ceea ce priveşte numărul de purcei înţărcaţi, valorile consemnate la loturile I şi III fiind cuprinse între 9,65 şi 10 purcei înţărcaţi/scroafă, iar la loturile II şi IV între 8,15 şi 8,51 purcei înţărcaţi/scroafă

XI


XII

RECOMANDĂRI PRACTICE

1. Datorită performanţelor ştiinţifice extraordinare a biotehnologiilor în domeniul medicine veterinare considerăm că este necesar aplicarea cu mai multă deschidere şi rapiditate a diferitelor noutăţi specifice bioingineriei şi biotehnologiei, fapt pentru care recomandăm introducerea în cadrul conceptului de spermogramă citologică (parte componentă a fişei andrologice) a unui compartiment de citomorfometrie a materialului seminal, considerând că spermogramele citomorfometrice trebuie efectuate periodic.

2. De asemenea recomandăm utilizarea şi interpretarea corectă a spermogramei uzuale şi speciale conform căreia toţi parametri trebuie corelaţi şi interpretaţi comparativ fără a absolutiza sau exacerba importanţa numai a unui singur parametru.

3. Rezultatele consemnate în urma cercetărilor indică faptul că procesul de conservare a materialului seminal de vier prin congelare reduce, în timp, calitatea spermatozoizilor din punct de vedere al mobilităţii, viabilităţii, morfologiei precum şi a morfocitometriei. De aceea recomandăm efectuarea congelării materialului seminal de vier în numai scop experimental.

4. Rezultatele modeste obţinute în cazul utilizării de material seminal congelat ne permit să recomandăm utilizarea acestuia doar atunci când este imposibil de realizat inseminarea artificială a scroafelor cu material seminal proaspăt sau diluat.

CERCETĂRI PRIVIND CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI … · TEZĂ DE DOCTORAT - Cercetări privind...

Documents

Transcript of CERCETĂRI PRIVIND CRIOCONSERVAREA MATERIALULUI … · TEZĂ DE DOCTORAT - Cercetări privind...