cercetări farmacologice şi modele virtuale predictive asupra ...

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE DIN CRAIOVA

REZUMAT

TEZĂ DE DOCTORAT

CERCETĂRI FARMACOLOGICE ŞI

MODELE VIRTUALE PREDICTIVE

ASUPRA IMPLICĂRII UNOR

DERIVAŢI DIN CLASA OXICAMILOR

ÎN STRESUL OXIDATIV LA PACIENŢI

CU BOALĂ ARTROZICĂ

Conducător ştiinţific Prof. univ. dr. Florica Popescu

Doctorand Denisa-Constantina Amzoiu

CRAIOVA 2011

2

CUPRINS

1. Introducere ............................................................................................................... 4 STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII 2. Artroza ...................................................................................................................... 5

2. 1. Clasificarea artrozelor ....................................................................................... 5 2. 2. Factorii de risc ................................................................................................... 5 2. 3. Diagnostic ......................................................................................................... 5 2. 4. Tratament .......................................................................................................... 6

3. Implicaţiile stresului oxidativ în artroză ................................................................ 6 3. 1. Radicalii liberi şi derivaţii lor ........................................................................... 6 3. 2. Sisteme antioxidante ......................................................................................... 7 3. 3. Implicaţiile stresului oxidativ în patofiziologia artrozei ................................... 7 3. 4. Influenţa ROS/RNS asupra dezvoltării artrozei ................................................ 9 3. 5. Implicaţiile ROS/RNS în îmbătrânirea celulară şi apoptoza condrocitelor ...... 9

4. Utilizarea oxicamilor în tratamentul artrozei ....................................................... 10 4. 1. Inflamaţia în artroză .......................................................................................... 10 4. 2. Clasa oxicamilor ................................................................................................ 11

5. Studii de modelare moleculară. Modele virtuale predictive ................................ 13 5. 1. Principii QSAR/QSPR ....................................................................................... 13 5. 2. Andocarea moleculară........................................................................................ 14

CONTRIBUŢII PERSONALE 6. Motivarea studiului şi ipoteze de lucru .................................................................. 15 7. Obiectivele studiului ................................................................................................ 15 8. Cercetări farmacologice asupra implicării unor derivaţi din clasa oxicamilor

în stresul oxidativ la pacienţi cu boală artrozică .................................................. 16 8. 1. Material şi metode ........................................................................................... 16

8. 1. 1. Organizarea studiului clinic ............................................................... 16 8. 1. 2. Metode de investigaţie ...................................................................... 16 8. 1. 3. Metode de prelucrare statistică ......................................................... 17

8. 2. Rezultate .......................................................................................................... 17 8. 2. 1. Caracteristicile demografice ale pacienţilor din loturile de studiu ... 17 8. 2. 2. Tratamentul medicamentos administrat pacienţilor incluşi în studiu ......................................................................................................... 18 8. 2. 3. Parametrii biochimici şi funcţionali determinaţi la pacienţii trataţi

cu piroxicam ..................................................................................... 18 8. 2. 4. Parametrii biochimici şi funcţionali determinaţi la pacienţii trataţi

cu tenoxicam ..................................................................................... 20

3

8. 2. 5. Parametrii biochimici şi funcţionali determinaţi la pacienţii trataţi cu meloxicam .................................................................................... 21

8. 3. Discuţii ............................................................................................................ 23 8. 3. 1. Efectul oxicamilor asupra nivelului malondialdehidei ..................... 24 8. 3. 2. Efectul oxicamilor asupra nivelului oxidului nitric .......................... 24 8. 3. 3. Efectul oxicamilor asupra activităţii superoxid dismutazei .............. 25 8. 3. 4. Efectul oxicamilor asupra activităţii glutation peroxidazei .............. 26 8. 3. 5. Evaluarea parametrilor funcţionali şi cuantificarea calităţii vieţii la

pacienţii cu artroză ............................................................................ 26 8. 4. Concluzii ......................................................................................................... 26

9. Modele virtuale predictive. Studii de modelare moleculară ................................ 31 9. 1. Material şi metodă ........................................................................................... 32

9. 1. 1. Studiul QSAR/QSPR al coeficientului de partiţie apă/octanol ......... 32 9. 1. 2. Docking molecular ............................................................................ 32

9. 2. Rezultate .......................................................................................................... 33 9. 2. 1. Studiul QSAR/QSPR al coeficientului de partiţie apă/octanol ......... 33 9. 2. 2. Docarea piroxicamului, tenoxicamului şi meloxicamului în situsul

activ al mieloperoxidazei şi al ciclooxigenazelor ............................. 35 9. 3. Discuţii ............................................................................................................ 38

9. 3. 1. Studiul QSAR/QSPR al coeficientului de partiţie apă/octanol ......... 38 9. 3. 2. Docarea piroxicamului, tenoxicamului şi meloxicamului în situsul

activ al mieloperoxidazei şi al ciclooxigenazelor ............................. 39 9. 4. Concluzii ......................................................................................................... 40

10. Concluzii finale ....................................................................................................... 41

11. Bibliografie ............................................................................................................. 43

4

1. Introducere Artroza este definită ca un grup heterogen de afecţiuni, fiind caracterizată de

manifestări articulare, asociate cu alterări ale integrităţii cartilajului, osului subcondral şi structurilor periarticulare. Incidenţa bolii este crescută mai ales datorită speranţei mari de viaţă, clasându-se pe locul al doilea, după bolile cardiovasculare, în cadrul afecţiunilor cronice [1].

Speciile reactive ale oxigenului şi azotului (cum sunt anionul radical superoxid, oxigenul singlet, radicalul hidroxil, radicalul perhidroxil, oxidul nitric, peroxinitritul ş.a.) sunt implicate în patogeneza artrozei, la pacienţii cu artroză fiind observată creşterea nivelului markerilor de stres oxidativ comparativ cu persoanele sănătoase [2].

În conformitate cu recomandările OARSI (Osteoarthritis Research Society International) inhibitorii neselectivi şi selectivi ai ciclooxigenazei (COX) sunt incluşi în strategiile de tratament farmacologic ale artrozei [3]. Antiinflamatoarele nesteroidiene (AINS) influenţează sinteza de prostaglandine prin inhibarea izoformelor COX, COX-1 şi/sau COX-2. Mecanismul acţiunii antiinflamatoare al AINS nu este însă complet cunoscut, pe lângă efectul de inhibiţie al COX, diferitele AINS având, posibil, şi alte mecanisme adiţionale de acţiune. AINS influenţează stresul oxidativ, unele diminuând, altele crescând producerea speciilor reactive.

Mieloperoxidaza deţine un loc important printre multiplele mecanisme de producere a speciilor reactive, fiind implicată direct în inflamaţie şi ducând la sinteza acidului hipocloros, care are acţiune oxidantă puternică. Rolul acestei enzime în diferite patologii este intens cercetat, ea constituind o potenţială ţintă terapeutică.

Astfel, acest studiu s-a concentrat pe evidenţierea in vivo şi compararea acţiunii antioxidante a trei AINS din clasa oxicamilor – piroxicamul şi tenoxicamul, care sunt inhibitori neselectivi ai ciclooxigenazei şi meloxicamul, un inhibitor selectiv al COX-2 –la pacienţi cu boală artrozică şi sugerarea unui posibil mecanism al acestei interferenţe cu stresul oxidativ – interacţiunea cu mieloperoxidaza.

Rezultatele demonstrează o influenţă mai putenică asupra oxidului nitric şi superoxid dismutazei în cazul piroxicamului şi o acţiune mai slabă a tenoxicamului şi meloxicamului asupra markerilor de stres oxidativ. Aceste rezultate sunt susţinute şi de studiile in silico ce evidenţiază o capacitate relativ redusă de interacţiune cu mieloperoxidaza a cestor trei oxicami.

Ţin să mulţumesc în primul rând Doamnei Prof. Univ. Dr. Florica Popescu pentru faptul că m-a acceptat ca şi doctorand. Îi mulţumesc pentru încrederea şi sprijinul acordate şi pentru susţinerea continuă în realizarea acestei teze. Mulţumesc, de asemenea, Domnului Prof. Univ. Dr. Johny Neamţu – Decanul Facultăţii de Farmacie. Experimentele din cadrul acestei teze de doctorat nu ar fi fost posibile fără ajutorul unor persoane deosebite, astfel încât, la finalizarea tezei, doresc să exprim sincere mulţumiri Doamnei Conf. Univ. Dr. Marinela Beznă pentru efortul considerabil în selectarea şi diagnosticarea pacienţilor, Doamnei Prof. Univ. Dr. Cătălina Pisoschi precum şi colectivului disciplinei Biochimie pentru ajutorul şi disponibilitatea arătate. Cuvinte cheie: piroxicam, tenoxicam, meloxicam, artroză, stres oxidativ, malondialdehidă, oxid nitric, superoxid dismutază, glutation peroxidază, mieloperoxidază, ciclooxigenază, andocare moleculară.

5

STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII 2. Artroza Artroza (osteoartrita, boala artrozică sau reumatismul articular degenerativ) este

definită conform ACR (American College of Rheumatology) ca un grup heterogen de afecţiuni care determină manifestări articulare, asociate cu alterări ale integrităţii cartilajului, însoţite de modificări ale osului subcondral şi structurilor periarticulare (capsulă, ligamente, tendoane, musculatură), a cărei frecvenţă este în creştere mai ales datorită măririi speranţei de viaţă şi care are consecinţe şi impact semnificativ în societate [1, 4].

Artroza nu constituie o maladie distinctă, ci un grup de afecţiuni care se suprapun parţial, având etiologii diverse, dar cu expresie clinică, anatomopatologică şi biologică unitară, asemănătoare unei insuficienţe articulare, articulaţia fiind astfel asimilată unui organ [1].

Artroza constituie o problemă de sănătate publică majoră, fiind cea mai frecventă afecţiune articulară şi se plasează pe locul al doilea ca diagnostic după afecţiunile cardiovasculare, în cadrul bolilor cronice [1,5].

2. 1. Clasificarea artrozelor Clasificarea artrozelor în funcţie de etiologie: primitivă (primară) sau

idiopatică şi secundară, deşi o distincţie între cele două forme nu este întotdeauna clară [1].

Clasificarea artrozei în funcţie de articulaţiile afectate: poliartroză (artroză generalizată, globală sau poliarticulară), artroză bilaterală şi uniarticulară sau cu localizare specifică (ex. mână, şold, genunchi, gleznă) [6].

Clasificarea artrozelor în funcţie de stadiul de evoluţie al bolii: foloseşte tehnici imagistice (radiografică, rezonanţa magnetică) şi sistemul de clasificare Kellgren-Lawrence, care cuprinde 5 trepte, de la 0 la 4: gradul 0 – fără modificări articulare; gradul 1 – semne neconcludente; gradul 2 – artroză minimală; gradul 3 – artroză moderată; gradul 4 – artroză severă [6,7].

2. 2. Factorii de risc Intervin patogenic pe două căi: definirea unei predispoziţii generale (prin

ereditate, vârstă, sex, status endocrin, obezitate, metabolism, nutriţie, osteoporoză, diabet zaharat) şi biomecanica articulară anormală (mediul mecanic al articulaţiei, încărcarea cartilajului, traumatismul, deformarea articulară, slăbirea musculaturii, solicitarea profesională, activităţile sportive) [1,4,8,9].

2. 3. Diagnostic În momentul actual nu există un test de diagnosticare standard pentru artroză şi

deşi diagnosticul este frecvent radiografic descoperirea bolii poate fi nespecifică [4]. Tablou clinic. Artroza este caracterizată de simptome care evoluează progresiv:

durere, redoare matinală, dizabilitate, tumefiere/deformare articulară, instabilitate articulară şi limitarea mişcării articulaţiilor implicate [1,10].

6

Explorări paraclinice. Teste de laborator. Explorările biologice uzuale sunt, în general, normale în artroze, dar în episoadele inflamatorii care apar în evoluţia bolii pot fi identificate niveluri serice crescute ale reactanţilor de fază acută: proteina C-reactivă, VSH [1]. Explorarea imagistică. Evaluarea radiologică este obligatorie, eficace, accesibilă şi reproductibilă, putând evidenţia modificări precoce, chiar în cazuri asimptomatice [1]. Rezonanţa magnetică constituie un mijloc util de analiză, având o sensibilitate mai mare în monitorizarea evoluţiei bolii, însă cu costuri mult mai mari [1, 10]. Evaluarea funcţională. Cuantificarea calităţii vieţii în ceea ce priveşte starea de sănătate în artroză joacă un rol important în descrierea, măsurarea severităţii bolii şi a răspunsului la terapie. Rezultatele raportate de pacient oferă informaţii despre starea de sănătate, statusul funcţional, simptome, tratamentul preferat şi calitatea vieţii din perspectiva personală a fiecărui pacient [11]. HAQ (Health Assessment Questionnaire) are două versiuni: HAQ complet şi HAQ scurt, care conţine doar indexul de dizabilitate HAQ (HAQ-DI) şi scala vizuală analogă pentru durere (VAS) [11]. Scorul WOMAC (Western Ontario and McMaster Universities) pentru artroze are mai multe variante, cele mai utilizate versiuni fiind WOMAC LK3.1 şi WOMAC VA3.1 [12]. Chestionarul Oswestry este formulat pentru a da informaţii despre modul în care durerea de la nivelul spatelui sau piciorului afectează viaţa cotidiană. [12]. Indexul funcţional Lequesne pentru artroze descrie durerea sau disconfortul resimţite de pacient în anumite situaţii [14].

2. 4. Tratament Tratamentul farmacologic al artrozelor este etapizat în funcţie de evoluţie: -analgezice din clasa I (AINS - paracetamol) sau din clasa a II-a (analgezice

opioide slabe – tramadol până la opiode puternice în durerea severă); antiinflamatoare nesteriodiene în episoadele acute de artroze;

-terapia simptomatică cu acţiune lentă (sulfat de condroitină, sulfat de glucozamină, doxiciclină, săruri nesaponificabile de avocado şi soia);

-terapia intraarticulară efectuată cu glucocorticoizi, acid hialuronic. Terapia medicamentoasă poate fi completată cu terapie nonfarmacologică:

fizioterapie, electroterapie, hidroterapie, laserterapie etc. sau cu terapie chirurgicală [1,3,9].

3. Implicaţiile stresului oxidativ în artroză Stresul oxidativ, determinat de un dezechilibru între ROS/RNS şi sistemele

antioxidante biologice, poate duce la alterări ale macromoleculelor, producând degradări ale ADN-ului, inhibarea activităţii unor enzime celulare şi inducerea morţii celulare prin activarea cascadelor kinazelor şi caspazelor [15]. Domeniul reglării redox este important şi din punctul de vedere al rolului pe care stresul oxidativ îl joacă în numeroase boli, echilibrul fragil care există între efectele benefice şi cele dăunătoare constituind un aspect important al vieţii [16].

3. 1. Radicalii liberi şi derivaţii lor Radicalii liberi sunt atomi, molecule sau fragmente moleculare care conţin unul

sau mai mulţi electroni impari (neîmperecheaţi) pe orbitalul extern sau chiar pe doi orbitali [17], care conferă de obicei un anumit grad de reactivitate [18].

7

Radicalii liberi ai oxigenului sau mai exact speciile reactive ale oxigenului (ROS), ca şi speciile reactive ale azotului (RNS) sunt produşi ai metabolismului celular normal, având un rol dual, putând fi atât benefici cât şi nocivi sistemelor vii. Deci, stresul oxidativ apare în reacţiile metabolice care folosesc oxigen şi reprezintă un dezechilibru între reacţiile antioxidante şi prooxidante care au loc în organismele vii [18].

Speciile reactive ale oxigenului Radicalii liberi derivaţi de la oxigen reprezintă cea mai importantă categorie a

speciilor de radicali care apar în sistemele vii [18] şi pot fi grupaţi în : -specii radicali: anorganici: superoxidul (O2

•−), radicalul hidroxil (HO•), radicalul perhidroxil (HO2

•) şi organici: radicalul alcoxil (RO•), radicalul hidroperoxil (ROO•);

-specii neradicali: peroxidul de hidrogen (H2O2), acidul hipocloros (HOCl), oxigenul singlet (1O2), ozonul (O3), dioxigenul (O2) [17].

Speciile reactive ale azotului Azotul poate forma specii reactive (RNS – reactive nitrogen species) de tipul: - radicali: oxid nitric sau monoxid de azot (NO•), dioxid de azot sau oxid nitros

(NO2•);

- neradicali: acid azotos sau acid nitros (HNO2), acid azotic sau acid peroxinitros (HNO3), trioxid de azot (N2O3), tetraoxid de azot (N2O4), cationul nitrozoniu (NO+), anioni: nitroxil (NO–), peroxinitrit (ONOO−), nitrit (NO2

–), nitrat (NO3–) [17].

Supraproducţia RNS se numeşte stres nitrozativ şi duce la reacţii de nitrozilare care alterează structura proteinelor, inhibându-le funcţionarea normală [18].

3. 2. Sisteme antioxidante Sistemele antioxidante ale eucariotelor s-au dezvoltat din trei sisteme enzimatice

clasice – SOD, catalaza şi glutation peroxidaza – pentru a include un grup de agenţi enzimatici şi neenzimatici care încă se extinde [19]: glutation S-transferaza, sitemele tioredoxine/peroxiredoxine, tiroid peroxidaza, eozinofil peroxidaza, sulfiredoxina [20], sestrinele 1 şi 2 [19,21], proteinele complexante: transferina, feritina, lactoferina, albumina, ceruloplasmina şi metalotioneinele [21], agenţii antioxidanţi cu masă moleculară mică:glutationul, coenzima Q, acidul lipoic, hormonii sexuali, bilirubina [19],

vitamina C (acid ascorbic), vitamina E (tocoferol), vitamina P (flavonoide), provitamina A (beta-caroten) [22,23].

3. 3. Implicaţiile stresului oxidativ în patofiziologia artrozei Modificările care apar în cartilajul artrozic provin din dezechilibrul dintre

procesele anabolice şi cele catabolice influenţate de forţele biomecanice ca şi de defecte ale reglării autocrine, paracrine şi endocrine la nivel celular, ducând la un dezechilibru al turnoverului normal al ţesutului articular [24].

Cartilajul articular Este un material biologic înalt specializat, o matrice avasculară, aneurală şi

alimfatică, sintetizată de celule numite condrocite, formând suprafaţa netedă şi alunecoasă a articulaţiilor sinoviale. Constituenţii majoritari ai cartilajului articular sunt: colagenul, proteoglicanii, un grup heterogen de proteine non-colagenice non-proteoglicanice, iar cea mai mare parte din greutatea cartilajului este dată de apa legată de proteoglicani [25].

8

Colagenii în artroză. Boala este caracterizată de creşterea proceselor de degradare care au loc în fibrilele ce conţin colagen de tip II [26], ceea ce determină diminuarea elasticităţii cartilajului [27]. Degradarea fibrilelor de colagen în cartilajul artrozic este realizată de mai mulţi membrii ai familiei MMP care acţionează concomitent, determinând fibrilarea ireversibilă a cartilajului [26].

Proteoglicanii în artroză. Agrecanii sunt probabil printre primii constituenţi ai matricei cartilajului afectaţi, de vreme ce se constată o depleţie a lor odată cu agravarea bolii, condrocitele parând incapabile să compenseze în totalitate pierderea de proteoglicani, chiar dacă sinteza creşte [26].

Factorii anabolici cei mai studiaţi factori de creştere implicaţi în formarea şi funcţionarea cartilajului sunt: TGF-β (transforming growth factor β), BMP (bone morphogenetic proteins), CDMP (cartilage-derived morphogenetic proteins), IGF (insulin-like growth factors), CTGF (connective-tissue growth factor), HGF (hepatocyte growth factor) şi FGF (fibroblast growth factor) [26].

Factorii catabolici: proteazele (metaloproteazele (MMP), tiol proteazele) fibronectina, anumiţi neuromediatori (leptina, substanţa P) pot să amplifice procesele degenerative ale cartilajului, ducând astfel la apariţia artrozei [26].

Factori inflamatorii: IL-1β, TNF-α, OSM (oncostatin M), IL-6, LIF (leukemia inhibitory factor), IL-17, IL-18 – consideraţi ca factori potenţiali ai patogezei artrozei şi mediatorii inflamatori care au un rol important în procesele patologice din artroză: NO, eicosanoide (prostaglandinele şi leucotrienele) şi PAR-2 (protease activated receptor 2). Cartilajul artrozic produce mari cantităţi de NO şi ROS. iNOS este up-reglată în condrocitele artrozice, crescând sinteza NO, iar IL-1 şi TNFα stimulează producţia NO în cartilaj [27]. NO acţionează prin reducerea proceselor anabolice majore şi creşterea proceselor catabolice [26].

Membrana sinovială, lichidul sinovial şi capsula articulară Membrana sinovială are funcţii importante pentru homeostazia articulaţiei. În

procesul degenerativ din artroză se pot observa două modele de reacţie sinovială: hiperplazia sinovială şi sinovita bogată în produşi de degadare din ultimele stadii ale bolii, când fragmente de cartilaj şi os sunt încorporate în membrana sinovială. [25].

Capsula articulară împreună cu ligamentele asigură stabilitatea mecanică şi permite flexibilitatea articulaţiei, astfel încât îngroşarea stratului de colagen, caracteristică multor pacienţi cu artroză, în special în stadiile avansate, reduce semnificativ capacitatea de mişcare a articulaţiei. Astfel, fibroza capsulară joacă un rol important în apariţia rigidităţii articulare, care este după durere, caracteristica simptomatică a degenerării cartilajului în artroză. În plus, determină îngustarea capsulei articulare, ceea ce duce la creşterea stresului biomecanic asupra cartilajului deja lezat prin mărirea presiunii în întreaga articulaţie [25].

Structurile juxtaarticulare (ligamente, tendoane, capsula articulară) sunt afectate progresiv, putând să apară: fibroză, scurtări şi rupturi ligamentare, amiotrofii, iar în stadiile finale anchiloză articulară şi dispariţia completă a spaţiului articular, malalinieri, deformări cu repercursiuni funcţionale majore [1].

Osul subcondral Modificările morfologice în artroză includ apariţia osteofitelor marginale

(proliferări osoase la baza leziunilor cartilaginoase), a chistelor subcondrale de retenţie (arii necrotice de os subcondral) şi scleroza subcondrală [1]. În afara sclerozei osoase

9

extinse, o caracteristică obişnuită a degenerării articulare în artroză o constituie nercroza osoasă aseptică. În zonele de destrucţie totală a cartilajului, lichidul sinovial are acces la măduva osoasă şi induce modificări fibrotice şi chiar condrometaplastice ale celulelor precursoare mezenchimale. Aceasta duce la apariţia nodulilor cartilaginoşi care apar frecvent în aceste zone în stadiile avansate ale bolii. Modificările apărute în osul subcondral în cazul destrucţiilor moderate până la severe constituie o sursă a apariţiei durerilor articulare în artroză [25]. În artroză, în regiunea osului subcondral s-au găsit cantităţi ari de MMP, TNF-α, IL-1α şi IL-8, ceea ce implică osul subcondral în procesele inflamatorii din patologia artrozei [28].

3. 4. Influenţa ROS/RNS asupra dezvoltării artrozei Stresul oxidativ este implicat în artroză nu numai în distrucţia cartilajului [29], ci

are şi acţiune indirectă prin activarea colagenazelor, proenzimelor şi up-reglarea unor gene care codifică enzime implicate în degradarea matricei şi producţiei de citokine [30]. Radicalii liberi degradează colagenul şi împiedică formarea fibrilelor de colagen [31], inflamaţia şi stresul mecanic sunt asociate cu up-reglarea NO [29], care poate avea efecte diverse asupra condrocitelor, precum: inhibiţia sintezei colagenului şi proteoglicanilor, modularea expresiei citokinelor, activarea MMP, supresia proliferării şi promovarea apoptozei condrocitelor [32].

NO prezintă un rol important în modularea funcţiilor condrocitare [29]: inhibă sinteza proteoglicanilor şi colagenului, activează MMP, mediază apoptoza condrocitelor şi promovează răspunsul inflamator al condrocitelor. NO şi RNS pot regla activitatea MMP-9, nivele scăzute de NO exogen crescând activitatea MMP-9 şi inhibând activitatea TIMP-1. NO măreşte expresia MMP şi reglează expresia unor molecule care influenţează expresia MMP în cartilajul atrozic. De exemplu, endotelina-1 induce sinteza MMP-1 şi MMP-13 în condrocitele artrozice umane prin inducerea iNOS de către GMPc [33].

HOCl atacă preferenţial proteinele din lichidul sinovial, reducând vâscozitatea acestuia, mai ales prin precipitarea hialuronanului solubil. De asemenea, HOCl reacţionează cu polizaharidele, formând acetat, care, corelat cu activitatea MPO din lichidul sinovial, implică HOCl în degradarea cartilajului [30]. HOCl determină depleţia ATP şi GSH în condrocite şi scade viabilitatea condrocitelor. [34].

Se poate concluziona că în circumstanţe patologice ROS contribuie la distrucţia cartilajului prin degradarea directă a componentelor matricei, susţinerea activităţii citokinelor catabolice şi prin reducerea capacităţii de reparare a cartilajului [34].

3. 5. Implicaţiile ROS/RNS în îmbătrânirea celulară şi apoptoza

condrocitelor Progresia artrozei este corelată cu senescenţa celulară şi apoptoza în toate

compartimentele articulare, în aceste procese fiind implicate şi ROS/RNS [29]. Stresul oxidativ crescut accelerează senescenţa şi iniţiază apoptoza condrocitelor, diminuând astfel capacitatea condrocitelor de a menţine şi reface cartilajul [35].

ROS/RNS au reactivitate înaltă şi pot influenţa reglarea expresiei unor gene, activarea factorilor de transcripţie, proliferare celulară, afectarea ADN şi apoptoză [36].

Acţiunea NO, corelată cu cea a altor radicali liberi, antrenează nitrozilarea proteinelor şi favorizează moartea celulară [37]. Nitrotirozina, formată prin oxidarea tirozinei în prezenţa NO, este supraexprimată în cartilaj la persoanele vârstnice şi în

10

cartilajul artrozic, sugerând implicaţiile SO în îmbătrânirea şi degenerarea cartilajului [38].

4. Utilizarea oxicamilor în tratamentul artrozei Antiinflamatoarele nesteroidiene (AINS) sunt substanţe din grupa analgezice-

antipiretice-antiinflamatoare, cu efect predominant antiinflamator, folosite în scop antiinflamator şi analgezic. Efectul antireumatic este imediat, însă are durată scurtă după întreruperea administrării. Sunt substanţe cu acţiune simptomatic-patogenică, diminuând sau înlăturând unele simptome ale inflamaţiei în bolile reumatice cronice, dar nemodificând evoluţia procesului patologic [39]. Efectul cel mai important al AINS este inhibarea ciclooxigenazei (COX), diminuând astfel biosinteza prostaglandinelor. Mecanismul acţiunii antiinflamatoare al AINS nu este însă complet cunoscut, pe lângă efectul de inhibiţie al COX, diferitele AINS având, posibil, şi alte mecanisme adiţionale de acţiune.

4. 1. Inflamaţia în artroză Lezarea celulară asociată inflamaţiei acţionează asupra membranelor celulare,

determinând eliberarea de către leucocite a enzimelor lizozomale; se formează din precursori acidul arahidonic, apoi sunt sintetizaţi variaţi eicosanoizi. La locul leziunii tisulare sunt eliberate kinine, neuropeptide, histamina, componente ale complementului, citokine şi alte produse ale leucocitelor şi plachetelor. Stimularea de la nivelul membranelor neutrofilului produce radicali liberi derivaţi ai oxigenului activat. [39]. NO acţionează ca vasodilatator, dar are şi proprietăţi antimicrobiene prin interacţia cu alte ROS şi formarea peroxinitritului, S-nitrozotiolilor (RSNO) şi a nitriţilor (NO2

−). ROS sunt eliberate extracelular de leucocite după expunerea la agenţi chemotactici şi complexe imune [22], iar prin interacţiunea acestor compuşi cu acidul arahidonic are ca rezultat generarea de substanţe chemotactice, ducând la perpetuarea procesului inflamator [90].

Expresia COX-2 este crescută în condrocitele artrozice care produc spontan PGE2 ex vivo. Efectele supraproducţiei de eicosanoide determină atât activităţi catabolice cât şi anabolice, datorită în parte faptului că diferiţii produşi finali care se formează (ex. PGE1, PGE2) acţionează prin intermediul a diferiţi receptori ai PGE şi prin căi de semnalizare diferite, exercitând efecte divergente asupra metabolismului condrocitelor [40].

Există studii care sugerează o posibilă legătură între stresul oxidativ iniţial şi inducerea consecutivă a proceselor inflamatorii mediate de COX. În timpul sintezei PG sunt generaţi radicali liberi, deci inhibitorii sintezei PG pot fi consideraţi epuratori ai radicalilor liberi. Inhibitorii COX blochează activitatea NOS în trombocitele umane. NO stimulează activitatea COX, ceea ce duce la eliberarea mediatorilor inflamatori ca PGE2. Inhibitorii COX scad producerea anionului superoxid. Co-oxidarea substanţelor chimice dependentă de PGH-sintază poate duce la formarea de metaboliţi ai radicalilor liberi intracelular [41].

Formarea ROS şi RNS activează factori de transcripţie redox-sensibili, ducând la generarea moleculelor proinflamatorii şi a inflamaţiei cronice, care, la rândul ei, determină generarea ROS şi RNS, activând astfel o buclă de feedback care amplifică procesele de lezare şi deteriorare a celulelor şi organelor ţintă. ROS şi RNS generate de

11

macrofagele activate induc stres oxidativ, ducând la apariţia unor compuşi cu masă moleculară mică oxidaţi şi nitraţi precum 4-hidroxinonenalul, malondialdehida, 3-nitrotirozina, acidul 3-nitro-4-hidroxifenilacetic, 5-nitrotocoferolul, 8-hidroxi-deoxiguanozina şi la peroxidarea lipidelor. Eliberarea extracelulară a unor nivele scăzute de ROS/RNS pot creşte expresia chemokinelor (ex. IL-8), citokinelor şi moleculelor de adeziune, amplificând cascada care provoacă răspunsul inflamator [22].

Au fost clonate şi investigate două izoforme majore ale COX, COX-1 şi COX-2 [42,43,44]. COX-1 este constitutivă în aproape toate tipurile de celule şi ţesuturi, şi funcţionează pentru a menţine homeostazia [42,45]. În anul 2002 s-a descoperit COX-3, care nu este o izoformă diferită genetic precum COX-2, ci o variantă a COX-1, fiind prezentă în principal în creierul uman şi în inimă şi s-a sugerat că este implicată în mecanismul febrei şi durerii din inflamaţie [46]. COX-2 este inductibilă şi apare ca răspuns la diferiţi agenţi proinflamatori (citokine, factor de creştere şi alţi mediatori asociaţi cu inflamaţia) [42,47], sugerând rolul cheie pe care COX-2 îl are în producerea inflamaţiei.

Diferite AINS pot avea, posibil, mecanisme adiţionale de acţiune cum sunt: inhibarea activării celulelor inflamatorii (cum sunt polimorfonuclearele neutrofile) cu diminuarea formării de endoperoxizi şi radicali liberi; diminuarea formării şi acţiunii moleculelor de adeziune de către celulele endoteliale, leucocite, plachete; inhibarea chemotaxiei celulelor inflamatorii; reglarea ,,down’’ a producerii de IL-1; interferarea unor fenomene celulare mediate de calciu; inhibarea şi a lipoxigenazei [39]; decuplarea fosforilării oxidative; inhibarea eliberării enzimelor lizozomale; inhibarea activării complementului [42]. A fost descrisă o acţiune directă de micşorare a procesului de activare a neutrofilelor de către stimulii inflamatori. Aceasta, alături de inhibarea COX duce la diminuarea formării de endoperoxizi intermediari, respectiv de radicali liberi agresivi, care contribuie la generarea inflamaţiei [48].

Toate aceste acţiuni sugerează că AINS pot avea activitate antiinflamatorie prin mecanisme diferite de capacitatea de a inhiba COX. Este posibil ca în viitor noile AINS să acţioneze prin mecanisme care nu au legătură cu inhibiţia COX

4. 2. Oxicamii Oxicamii constituie o clasă de AINS ce cuprinde compuşi cu structură de acizi

enolici. Aceste substanţe pot acţiona ca inhibitori neselectivi ai COX (piroxicam, tenoxicam, lornoxicam), dar şi prin blocarea selectivă a COX-2 (meloxicam).

Piroxicamul Proprietăţi farmacocinetice. Are absorbţie bună după administrare orală,

concentraţiile plasmatice menţinându-se stabile timp de 24 de ore după administrarea într-o singură priză pe zi. Piroxicamul este metabolizat extensiv, sub 5% din doza zilnică fiind excretată nemodificată în urină şi materiile fecale. Timpul de înjumătăţire plasmatică este de aproximativ 50 ore.

Proprietăţi farmacodinamice. Piroxicamul este un AINS având şi proprietăţi analgezice şi antipiretice. Este eficient indiferent de etiologia inflamaţiei, studiile in vitro şi in vivo demonstrând că piroxicamul intervine în diferitele etape ale răspunsului imun şi inflamator prin: inhibarea sintezei de prostaglandine prin inhibarea reversibilă a COX, inhibarea agregării neutrofilelor, inhibarea migrării polimorfonuclearelor şi monocitelor

12

la nivelui zonei de inflamaţie, inhibarea eliberării de enzime lizozomale din limfokinele stimulate; inhibarea producerii de către neutrofile a anionilor superoxid, scăderea producerii de factor reumatoid atât sistemic, cât şi la nivelul lichidului sinovial la pacienţii cu poliartrită reumatoidă seropozitivă. Piroxicamul este eficient ca analgezic instalarea efectului fiind rapidă.

Reacţii adverse. Piroxicamul este în general bine tolerat, cele mai multe reacţii adverse fiind cele gastrointestinale, dar de obicei apariţia lor nu necesită întreruperea tratamentului.

Indicaţii terapeutice: diferite afecţiuni care necesită un tratament antiinflamator şi/sau analgezic, cum sunt: artroză, poliartrită reumatoidă, poliartrită reumatoidă juvenilă, spondilită anchilozantă, afecţiuni musculo-scheletice acute, criză de gută, dureri post-operatorii şi post-traumatice acute, dismenoree primară la paciente cu vârsta peste 12 ani, ameliorarea febrei şi durerii asociate cu inflamaţiile acute ale tractului respirator superior. Local este indicat pentru: tratamentul afecţiunilor inflamatorii dureroase ale sistemului osteoarticular şi muscular: tendinite, tenosinovite, periartrită scapulo-humerală, contuzii, entorse, luxaţii.

Dozare şi mod de administrare: la adulţi în: artroză, poliartrită reumatoidă, spondilită anchilozantă: doza iniţială recomandată este de 20 mg piroxicam pe zi, administrate în priză unică. La majoritatea pacienţilor, ca tratament de întreţinere se va menţine doza de 20 mg pe zi. Medicamentul trebuie administrat o dată pe zi [49].

Tenoxicamul Proprietăţi farmacocinetice. După administrarea pe cale orală absorbţia este

rapidă şi completă (biodisponibilitate absolută 100%). În sânge se leagă în proporţie de peste 99% de albumină şi are o bună penetrare în lichidul sinovial, unde atinge concentraţii maxime mai târziu decât în plasmă. T1/2 mediu prin eliminare este de 72 ore. Este excretat după o biotransformare aproape completă sub formă de metaboliţi inactivi.

Proprietăţi farmacodinamice. Are proprietăţi antiinflamatorii, analgezice, antipiretice şi de inhibare a agregării plachetare. Experimentele efectuate in vitro cu peroxidaza leucocitară, au demonstrat că tenoxicamul neutralizează radicalii activi ai oxigenului. Tenoxicamul este un puternic inhibitor in vitro al MMP (stromelisină şi colagenază) care induc afectarea cartilaginoasă. Aceste efecte farmacologice explică, cel puţin parţial, eficacitatea terapeutică în tratamentul afecţiunilor inflamatorii şi degenerative dureroase ale sistemului osteomuscular.

Reacţii adverse. Este bine tolerat la dozele recomandate, reacţiile adverse raportate fiind uşoare şi trecătoare. Reacţii adverse cu frecvenţă mai mare de 1%: disconfort gastric, epigastric şi abdominal, dispepsie, arsuri şi greaţă; ameţeală, cefalee.

Indicaţii terapeutice. Tratamentul simptomatic al următoarelor afecţiuni inflamatorii şi degenerative dureroase ale sistemului osteomuscular: artrită reumatoidă, osteoartrită, artroză, spondilită anchilopoietică, afecţiuni extra-articulare, de exemplu tendinită, bursită, periartrită umerală sau de şold, întinderi ligamentare entorse, gută acută, durere postoperatorie, dismenoree primară.

Dozare şi mod de administrare. Doza uzuală, este de 20 mg zilnic, în acelaşi moment al zilei. În tratamentul tulburărilor cronice, efectul terapeutic ale tenoxicamului este evident de la începutul tratamentului, dar se constată o creştere progresivă a

13

răspunsului terapeutic în timp. Mod de administrare: comprimatele vor fi luate cu un pahar de apă, în timpul sau imediat după masă [49].

Meloxicamul Proprietăţi farmacodinamice. Are proprietăţi antiinflamatoare, analgezice şi

antipiretice. In vivo, meloxicamul inhibă mai mult biosinteza prostaglandinelor de la locul inflamaţiei, decât a celor din mucoasa gastrică sau din rinichi. Acest grad crescut de protecţie se datorează inhibării selective a COX-2, faţă de COX-1.

Reacţii adverse. Studiile clinice au demonstrat o incidenţă scăzută a efectelor secundare gastrointestinale (inclusiv perforaţiilor, ulceraţiilor şi sângerărilor) la dozele recomandate de meloxicam, decât la cele ale antiinflamatoarelor standard.

Indicaţii terapeutice. Tratamentul simptomatic al artritei reumatoide, tratamentul simptomatic al osteoartritelor dureroase (artoze, boli degenerative ale articulaţiilor), alte stări inflamatorii.

Dozare şi mod de administrare. Artroză: 7,5 mg/zi; dacă este necesar doza poate fi crescută la 15 mg/zi. La pacienţii cu risc crescut de reacţii adverse, tratamentul se începe cu o doză de 7,5 mg/zi. Doza maximă zilnică recomandată este de 15 mg. Comprimatele trebuie înghiţite cu apă sau alt lichid, în timpul meselor [49].

5. Studii de modelare moleculară. Modele virtuale predictive 5. 1. Principii QSAR/QSPR Pentru a putea parametriza interacţia ligandului (medicamentul) cu receptorul

biologic, trebuie luate în considerare toate etapele prin care ligandul (substanţa medicamentoasă) pătrunde în organism, anume: eliberarea din forma farmaceutică, absorbţia, distribuţia, metabolizarea, interacţia cu receptorul şi, în final, eliminarea. Este evident deci că, o singură etapă, oricât de importantă ar fi ea, nu poate caracteriza întreaga evoluţie a substanţei medicamentoase în organism. Interacţia substanţă medicamentoasă – receptor nu este de cele mai multe ori “specifică”, ea poate să fie de natură pur chimică dar şi fizică sau fizico-chimică. Din acest motiv, o adevărată relaţie cantitativă structură – activitate biologică trebuie să cuprindă mai mulţi parametrii, care să reflecte calea urmată de substanţa medicamentoasă de la locul administrării până la receptor, cât şi interacţia acesteia cu centrii activi ai receptorului. Toate acestea fac dificilă teoretizarea unei astfel de interacţii, deosebit de complexă şi ca durată şi ca ramificaţii. Există, din această cauză, foarte mulţi parametrii de care ar trebui să se ţină cont în prospectarea unor serii de substanţe pentru sintetizarea unui compus optim. Aceşti parametrii fizico-chimici, dependenţi de structura electronică a moleculei, reflectă interacţia „specifică” substanţă medicamentoasă – receptor. Tocmai această complexitate a determinat apariţia unor noi metode de abordare, dintre care cea mai eficientă este QSAR (Quantitative Structure–Activity Relationships) / QSPR (Quantitative Structure – Property Relationships).

Domeniul QSAR [50,51] poate fi sintetic definit astfel: „Plecând de la un set de molecule date, Li, i = 1, 2, …, N, pentru care se cunoaşte un anume tip de activitate biologică, Ai, se va căuta o relaţie între această activitate şi anumite proprietăţi structurale ale moleculelor considerate“. Practic, se urmăreşte obţinerea unei ecuaţii (de preferinţă

14

liniară) între intensitatea activităţii biologice, Ai, a fiecărei molecule i şi măsurile cantitative ale proprietăţilor structurale qij, j = 1, 2, …, M, evidenţiate pentru întregul set de molecule. Acetea ecuaţii poartă denumirea de ecuaţii Hansch. Coeficienţii regresionali ai liniarizării (aj) conferă gradul de influenţare a activităţii de către respectivele proprietăţi măsurate:

Âi = a0 + a1 · qi,1 + a2 · qi,2 + a3 · qi,3 + … Relaţia de acest tip poate fi utilizată pentru predicţii în sinteze de noi molecule

cu activitate biologică dorită şi, totodată, poate să dea anumite sugestii privind mecanismul acţiunii biologice.

Calitatea corelaţiei obţinute se măsoară prin coeficientul statistic de corelare R2, care arată cât de apropiate sunt valorile activităţii medicamentoase pentru o clasă de substanţe calculate cu ajutorul ecuaţiei Hansch de valorile experimentale utilizate. Valoarea acestui coeficient permite alegerea celor mai bune ecuaţii Hansch. Domeniul valorilor lui R este 0 ≤ R2 ≤ 1 sau procentual 0 ≤ R2 ≤ 100: R2 = 0 corespunde absenţei oricărei corelări între Âi şi parametrii qij, pe când R2 = 1 sau echivalent R2 = 100 indică o corelare liniară perfectă, adică o coincidenţă între valorile prezise cu cele experimentale. Se speră, în acest fel, că o astfel de ecuaţie statistică ar putea fi utilizată pentru prezicerea activităţii medicamentoase pentru noi structuri chimice.

5. 2. Andocarea moleculară “Molecular Docking” este o metodă care poate fi utilizată în prezicerea

orientărilor favorabile ale unei molecule (ligand) către o a doua moleculă (receptor) astfel încât prin legarea celor două molecule să se formeze un complex stabil [52]. Cunoaşterea orientărilor preferate, la rândul lor, poate fi folosită pentru a prezice puterea de asociere sau afinitatea de legare între două molecule utilizându-se funcţiile scoring. Majoritatea funcţiilor scoring se bazează pe câmpul forţelor de mecanică moleculară. O energie negativă scăzută indică stabilitatea sistemului.

De asemenea, andocarea (docking) este o unealtă esenţială pentru procedeele de screening virtual, în cadrul cărora o categorie de compuşi sunt andocaţi într-o ţintă şi sunt calculate cele mai bune interacţiuni [53]. Din acest motiv, andocarea este utilizată frecvent şi în prezicerea afinităţii de legare a unor molecule mici (medicamente) de proteine ţintă sau a activităţilor biologice ale acestor molecule (medicamente) [54].

Viteza şi precizia sunt importante pentru a obţine simulări reuşite, obiectivul principal în dezvoltarea unui algoritm de docare fiind obţinerea unei metode rapide capabilă să descopere noi compuşi cheie (în sceeningul virtual) [55] sau să reproducă conformaţii experimentale (pentru validarea cu date experimentale) cu cea mai mare precizie posibilă. Există mai multe programe de docare (DOCK, AUTODOCK, HEX, GOLD, FLEXX ş.a) şi fiecare aplicaţie de docare se bazează pe un algoritm de cercetare specific, precum IC (incremental construction), GA (genetic algortihm), MC (Monte Carlo), TS (tabu search), EP (evolutionary programing), SM (fast shape matching) etc., fiecare având o metodă de cercetare şi un set specific de parametrii. Programul de docare poate să caute cea mai bună interacţie între două sau mai multe molecule, ţinând cont de câţiva parametrii obţinuţi din coordonatele de input ale receptorului şi ligandului (complemetaritatea geometrică, flexibilitatea structurală a receptorului şi a ligandului) sau de interacţiile interatomice, redând în final cea mai bună orientare în situsul de legare prezisă pentru un ligand [53].

15

CONTRIBUŢII PERSONALE 6. Motivarea studiului şi ipoteze de lucru Efectele AINS sunt actual bine studiate la pacienţii cu artroză, în special din

punctul de vedere al acţiunii de inhibare a COX. Cum artroza este însă o afecţiune complexă, cu multe alte elemente implicate în patogenia sa, printre care şi stresul oxidativ, studierea altor posibile mecanisme de acţiune ale AINS constuie o temă de interes.

Cercetările asupra implicării speciilor reactive ale oxigenului şi azotului în diferite afecţiuni precum artritele, ateroscleroza, diabetul zharat ş.a. se accelerează rapid şi înţelegerea faţă de potenţialul lor de utilitate este în creştere, AINS fiind studiate astăzi pentru acţiunea lor de epurare a radicalilor liberi şi de încetinire a progresiei bolii Alzheimer sau cancerului.

În ultimii ani un număr tot mai mare de studii au evaluat rolul stresului oxidativ în artroză, inflamaţia sinovialei fiind considerată un fenomen secundar în distrucţia cartilajului, astfel încât eficacitatea tratamentului cu AINS ar putea să nu se datoreze doar inhibiţiei COX şi a sintezei PG, ci unor interferenţe mai complexe ale acestor medicamente cu alte procese implicate în patogenia artrozei, printre care şi stresul oxidativ.

Cu toate că a fost demonstrat că unele AINS intereferă cu stresul oxidativ, mecanismele implicate nu au fost stabilite cu exactitate. Cunoaşterea lor ar putea dechide noi drumuri în crearea unor noi AINS care, pe lângă efectul antiinflamator, să demonstreze şi eficacitate antioxidantă clară.

Toate aceste considerente argumentează oportunitatea desfăşurării unui astfel de studiu.

7. Obiectivele studiului Evaluarea unor markeri ai stresului oxidativ – malondialdehida ca indice de

peroxidare a lipidelor, oxidul nitric, nivelul enzimelor antioxidante (glutation peroxidază şi superoxid dismutază) la pacienţii cu gonartroză.

Evaluarea funcţională utilizând indici raportaţi de pacient: scorul WOMAC (Western Ontario and McMaster Universities (WOMAC) LK3.1 Osteoarthritis Index), chestionarul Oswestry, chestionarul de evaluare a sănătăţii (scorul HAQ – Health Assessment Questionnaire), indexul funcţional al lui Lequesne pentru artroze, durerea folosind scara vizual analogă.

Stabilirea nivelului acestor parametrii la începutul tratamentului cu piroxicam în doză de 20 mg po zilnic şi după 20 de zile de tratament.

Stabilirea nivelului acestor parametrii la începutul tratamentului cu tenoxicam în doză de 20 mg po zilnic şi după 20 de zile de tratament.

Stabilirea nivelului acestor parametrii la începutul tratamentului cu meloxicam în doză de 15 mg po zilnic şi după 20 de zile de tratament.

Compararea efectului asupra acestor parametrii înainte şi după tratament pentru fiecare medicament administrat.

16

Compararea efectului asupra acestor parametrii la sfârşitul tratamentului în funcţie de medicamentul administrat.

Modelarea structurilor chimice ale oxicamilor şi docarea lor în situsul activ al mieloperoxidazei şi al ciclooxigenazei.

Compararea interacţiunilor de legare şi a modului de legare a oxicamilor în situsul activ al MPO şi COX.

Scopul final al acestei cercetări este evaluarea capacităţii antioxidante a piroxicamului, tenoxicamului şi meloxicamului şi elucidarea unui posibil mecanism de acţiune pentru aceste efecte.

8. Cercetări farmacologice asupra implicării unor derivaţi din clasa

oxicamilor în stresul oxidativ la pacienţi cu boală artrozică 8. 1. Material şi metode 8. 1. 1. Organizarea studiului clinic Pacienţii incluşi în studiu au fost recrutaţi din cadrul Clinicii Medicale nr.1 din

Spitalul de Urgenţă din Craiova. Toţi pacienţii au participat voluntar la studiu, în urma consimţământului informat semnat de fiecare pacient. Studiul s-a desfăşurat în conformitate cu principiile Declaraţiei de la Helsinki (“Ethics and Epidemiology: International Guidelines”), publicată de Consiliul pentru Organizaţiile Internaţionale de Ştiinţe Medicale.

Repartiţia pacienţilor pe grupuri a fost efectuată în baza unui protocol de studiu, aprobat de comisia de etică a Universităţii de Medicină şi Farmacie din Craiova.

Studiul a fost efectuat în perioada ianuarie-octombrie 2010 pe 30 de pacienţi diagnosticaţi cu gonartroză. Pacienţii au fost împărţiţi în trei loturi: lotul 1 – 10 pacienţi trataţi cu piroxicam în doză de 20 mg po zilnic, lotul 2 – 10 pacienţi trataţi cu tenoxicam în doză de 20 mg po zilnic, lotul 3 – 10 pacienţi trataţi cu meloxicam în doză de 15 mg po zilnic.

8.1.2. Metode de investigaţie Anamneza Fiecare pacient a fost examinat, răspunzând la întrebări referitoare la modul de

viaţă, prezenţa factorilor de risc, fumatul, consumul de alcool, a unor patologii asociate, cât şi despre starea generală.

Examenul clinic Examenul clinic al pacienţilor a inclus evidenţierea simptomelor care evoluează

progresiv în artroză: durere, redoare matinală, dizabilitate, tumefiere/deformare articulară, instabilitate articulară şi limitarea mişcării articulaţiilor implicate.

Explorări paraclinice Explorarea imagistică a confirmat diagnosticul de boală activă, evaluarea

radiologică indicând cel puţin unul dintre următoarele semne caracteristice artrozei: îngustarea progresivă a spaţiului articular, osteoscleroză subcondrală, scleroză trabeculară, chisturi osoase subcondrale, osteofitoză marginală, remodelarea suprafeţelor articulare (malalinieri ale segmentelor osoase articulare, subluxaţii), anchiloză articulară.

Investigaţii biochimice Investigaţiile biochimice au fost efectuate în Laboratorul de Biochimie al

Universităţii de Medicină şi Farmacie din Craiova. S-au determinat:

17

-oxidul nitric (NO) prin metoda Griess -activitatea superoxid dismutazei -activitatea glutation peroxidazei -substanţele reactive cu acid tiobarbituric (malondialdehida) Evaluarea funcţională a articulaţiilor afectate şi cuantificarea calităţii vieţii

la pacienţii cu artroză Cuantificarea calităţii vieţii în artroză este importantă pentru descrierea bolii,

măsurarea severităţii bolii şi a răspunsului la terapie. Rezultatele raportate de pacient oferă informaţii despre starea de sănătate, statusul funcţional, simptome, rezultatul tratamentului şi calitatea vieţii din perspectiva personală a fiecărui pacient. S-au folosit: scorul WOMAC (Western Ontario and McMaster Universities (WOMAC) LK3.1 Osteoarthritis Index), chestionarul de evaluare a sănătăţii (HAQ-DI – Health Assessment Questionnaire - Disability Index), scala vizual analogă pentru durere (VAS), chestionarul Oswestry, indexul funcţional Lequesne pentru artroze.

8. 1. 3. Metode de prelucrare statistică Pentru a decide efectul tratamentului asupra markerilor de stres oxidativ în

situaţiile studiate: subiecţi trataţi cu piroxicam, tenoxicam, respectiv meloxicam, a fost necesară o analiză statistică de detaliu, pentru a putea accepta sau respinge ipoteza de nul: - tratamentul nu are efect asupra stresului oxidativ – în limitele unui risc de 5% (0,05) risc unanim acceptat în astfel de studii.

Pentru analiza statistică a fost folosit Statistics Package for Social Sciences (SPSS), iar rezultatele au fost exprimate ca medie ± DS (deviaţia standard). Diferenţele între cele trei grupuri la momentul iniţial au fost evaluate folosind testul t cu eşantioane independente. Modificările observate înainte şi după tratament au fost evaluate prin testul t cu eşantioane împerecheate. O valoare p<0,05 a fost considerată semnificativă statistic.

8. 2. Rezultate 8. 2. 1. Caracteristicile demografice ale pacienţilor din loturile de studiu În studiu au fost incluşi 30 de pacienţi diagnosticaţi cu gonartroză, împărţiţi în

trei grupuri: 10 au fost trataţi cu piroxicam, 10 cu tenoxicam şi 10 cu meloxicam. Vârsta medie a pacienţilor incluşi în studiu a fost de 55,63 ± 6,53 ani (limitele de vârstă – 46 - 73 de ani) cu diferenţe între cele trei grupuri: în lotul tratat cu piroxicam vârsta medie a fost 52,8 ± 4,23 ani (limitele de vârstă – 46-61 ani), în lotul tratat cu tenoxicam vârsta medie a fost 54,2 ± 2,15 ani (limitele de vârstă – 50-57 ani), iar în lotul tratat cu meloxicam vârsta medie a fost 59,9 ± 9,14 ani (limitele de vârstă – 51-73 ani). Distribuţia după sexe a evidenţiat o preponderenţă a femeilor în toate cele trei grupuri: 20% bărbaţi şi 80% femei în loturile tratate cu piroxicam, respectiv tenoxicam şi 30% bărbaţi şi 70% femei în lotul tratat cu meloxicam.

La nivelul întregului lot de pacienţi luaţi în studiu predomină grupa de vârstă 51-60 ani (74%), urmată de grupa sub 50 ani (13%) şi peste 70 ani(10%) (Figura 1).

18

Distributia pacientilor pe grupe de varsta

13%

74%

3% 10%

sub 50 ani51-60 ani61-70peste 70 ani

Figura 1. Distribuţia pacienţilor incluşi în studiu pe grupe de vîrstă

8. 2. 2. Tratamentul medicamentos administrat pacienţilor incluşi în studiu Conform protocolului pacienţii au primit tratament astfel: -primul lot a primit piroxicam – Piroxicam LPH (LaborMed Pharma SA): cpr.

20 mg., 1 cpr/zi; -lotul al doilea a primit tenoxicam – Tenoxicam LPH (LaborMed Pharma SA):

cps. 20mg., 1 cps/zi; -lotul al treilea a primit meloxicam – Meloxicam LPH (LaborMed Parma SA):

cpr. 15mg., 1cpr./zi. Niciun pacient nu a abandonat studiul. 8. 2. 3. Parametrii biochimici şi funcţionali determinaţi la pacienţii trataţi

cu piroxicam Tabelul 1. Parametrii biochimici determinaţi la pacienţii trataţi cu piroxicam Parametrul determinat

Înainte de tratament (media ± DS)

După tratament (media ± DS)

Valoarea p

MDA (nmol/ml) 1,169 ±0,663 1,085±0,591 0,19 NO (µmol/l) 21,57±6,86 17,68±4,29 0,006 SOD (U/ml) 150,15±25,79 172,68±20,24 0,04 GPx (U/l) 7920±1600,3 8588±1494,6 0,25 MDA – malondialdehidă; NO – oxid nitric; SOD – superoxid dismutază; GPx – glutation peroxidază.

După tratamentul cu piroxicam s-a putut observa o scădere nesemnificativă a valorilor MDA (p=0,19) şi GPx (p=0,25). Nivelul NO s-a diminuat semnificativ după tratament (21,57±6,86 µmol/l vs. 17,68±4,29 µmol/l, p=0,04), iar activitatea SOD a crescut semnificativ (150,15±25,79 U/ml vs. 172,68±20,24 U/ml, p=0,04) (Tabelul 1, Fig. 2-5).

19

Tabelul 2. Evaluarea calităţii vieţii şi a parametrilor funcţionali la pacienţii trataţi cu piroxicam

Testul de evaluare funcţională Înainte de tratament

(media ± DS)

După tratament

(media ± DS)

Valoarea p

HAQ-DI 1,425±0,27 0,862±0,23 <0,01 Durerea – scala VAS (mm) 85±11,78 66,5±8,18 <0,01 Indexul functional Lequesne 7,4±0,84 4±0,66 <0,01 Scorul Oswestry (%) 57±10,42 38,2±7,8 <0,01 Scorul WOMAC - durere 15±2,49 8,5±2,46 <0,01 Scorul WOMAC – rigiditate 5±1,56 2,5±1,17 <0,01 Scorul WOMAC – funcţia fizică 52,2±8,24 33,7±6,99 <0,01

În cazul lotului tratamentului cu piroxicam, după 20 de zile de tratament s-a constatat îmbunătăţirea semnificativă a calităţii vieţii şi a parametrilor în cazul tuturor evaluărilor funcţionale (p<0,01). În ceea ce priveşte evaluarea utilizând HAQ-DI, se constată trecerea de la un scor între 1 şi 2 (1,425 ± 0,27), care reprezintă dizabilitate moderată până la severă la un scor între 0 şi 1, reprezentând în general o dificultate uşoară până la moderată (0,862 ± 0,23) (Tabelul 2).

Variatia valorilor MDA la pacientii tratati cu piroxicam

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 2 4 6 8 10 12

MDA

(nm

ol/m

l)

initialfinal

Figura 2. Variaţia valorilor MDA

înainte şi după 20 de zile de tratament la pacienţii din lotul tratat cu

piroxicam

Variatia valorilor NO la pacientii tratati cu piroxicam

05

1015202530354045

0 2 4 6 8 10 12

NO (m

icro

mol

/l)

initialfinal

Figura 3. Variaţia valorilor NO

înainte şi după 20 de zile de tratament la pacienţii din lotul tratat cu

piroxicam

Variatia SOD la pacientii tratati cu piroxicam

0

50

100

150

200

250

0 2 4 6 8 10 12

SO

D (U

/ml)

initialfinal

Figura 4. Variaţia valorilor SOD

înainte şi după 20 de zile de tratament la pacienţii din grupul tratat cu

piroxicam

Variatia GPx la pacientii tratati cu piroxicam

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 2 4 6 8 10 12

GP

x (U

/l)

initialfinal

Figura 5. Variaţia valorilor GPx


piroxicam

20

8. 2. 4. Parametrii biochimici şi funcţionali determinaţi la pacienţii trataţi cu tenoxicam Tabelul 3. Parametrii biochimici determinaţi la pacienţii trataţi cu tenoxicam

Parametrul determinat


După tratament(media ± DS)

Valoarea p

MDA (nmol/ml) 0,933±0,388 0,834±0,191 0,51 NO (µmol/l) 30,71±13,88 23,88±7,29 0,21 SOD (U/ml) 169,05±33,19 167,12±19,92 0,85 GPx (U/l) 7239±1907,7 7532±1683,3 0,58

MDA – malondialdehidă; NO – oxid nitric; SOD – superoxid dismutază; GPx – glutation peroxidază.

La pacientii tratati cu tenoxicam, scăderea MDA este nesemnificativă (p>0,05). În acest caz, comparativ cu piroxicamul şi meloxicamul, s-a constat o scădere foarte uşoară, nesemnificativă, a SOD după tratament (169,05±33,19 U/ml înainte de începerea tratamentului vs. 167,12 ± 19,92 U/ml după tratament, p=0,85). Ca şi în cazul piroxicamului şi în cazul tenoxicamului se observă o scădere a nivelului NO, care deşi nesemnificativă statistic, ar putea sugera o interferenţă a acestor medicamente cu căile oxidului nitric (Tabelul 3, Fig. 6-9).

Tabelul 4. Evaluarea calităţii vieţii şi a parametrilor funcţionali la pacienţii trataţi cu tenoxicam Testul de evaluare funcţională Înainte de

tratament (media ± DS)

După tratament

(media ± DS)

Valoarea p

HAQ-DI 1,4±0,26 0,85±0,24 <0,001 Durerea – scala VAS (mm) 84±11,73 65±8,49 <0,001 Scorul Lequesne 7,1±0,87 3,9±0,87 <0,01 Scorul Oswestry (%) 54,33±11,23 36,35±9,69 <0,01 Scorul WOMAC - durere 13,7±3,19 7,4±3,33 <0,001 Scorul WOMAC – rigiditate 4,5±1,95 2,6±1,42 <0,05 Scorul WOMAC – funcţia fizică 47,4±6,93 32,1±6,82 <0,001

Şi în acest caz s-a constatat îmbunătăţirea parametrilor în ceea ce priveşte calitatea vieţii (p<0,05) şi evaluările funcţionale, cu o variaţie mai scăzută, dar semnificativă la secţiunea rigiditate a scorului WOMAC (p<0,05). Ca şi la grupul tratat cu piroxicam, în evaluarea utilizând HAQ-DI, se constată trecerea de la un scor între 1 şi 2 (1,4±0,26), reprezentând o dizabilitate moderată până la severă la un scor între 0 şi 1, reprezentând în general o dificultate uşoară până la moderată (0,85±0,24) (Tabelul 4).

21

Variatia valorilor MDA la pacientii tratati cu

tenoxicam

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

0 2 4 6 8 10 12

MDA

(nm

ol/m

l)

initialfinal



tenoxicam

Variatia valorilor NO la pacientii tratati cu tenoxicam

0

10

20

30

40

50

60

70

0 2 4 6 8 10 12

NO (m

icro

mol

/l)

initialfinal



tenoxicam

Variatia SOD la pacientii tratati cu tenoxicam

0

50

100

150

200

250

0 2 4 6 8 10 12

SOD

(U/m

l)

initialfinal



tenoxicam

Variatia GPx la pacientii tratati cu tenoxicam

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 2 4 6 8 10 12

GPx

(U/l)

initialfinal



tenoxicam

8. 2. 5. Parametrii biochimici şi funcţionali determinaţi la pacienţii trataţi

cu meloxicam Tabelul 5. Parametrii biochimici determinaţi la pacienţii trataţi cu meloxicam

Parametrul determinat


După tratament

(media ± DS)

Valoarea p

MDA (nmol/ml) 0,999±0,44 0,893±0,362 0,57 NO (µmol/l) 22,019±7,89 20,68±8,83 0,72 SOD (U/ml) 153,15±21,82 166,22±27,75 0,11 GPx (U/l) 6662±1772,2 8272±2744,4 0,052

MDA – malondialdehidă; NO – oxid nitric; SOD – superoxid dismutază; GPx – glutation peroxidază.

În cazul lotului de pacienti tratati cu meloxicam, are loc o diminuare nesemnificativă a nivelurilor MDA şi NO (p>0,05). Ca şi în cazul piroxicamului s-a

22

observat o creştere atât a nivelului SOD, cât şi a GPx, dar aceste variaţii nu sunt semnificative statistic (p=0,11, respectiv p=0,052) (Tabelul 5, Fig. 10-13). Tabelul 6. Evaluarea calităţii vieţii şi a parametrilor funcţionali la pacienţii trataţi cu meloxicam

Testul de evaluare funcţională Înainte de tratament

(media ± DS)

După tratament (media ± DS)

Valoarea p

HAQ-DI 1,25±0,34 0,78±11,73 <0,01 Durerea – scala VAS (mm) 83±11,59 54±11,73 <0,001 Scorul Lequesne 6,5±1,26 3,5±1,26 <0,001 Scorul Oswestry (%) 51±9 27,3±6 <0,001 Scorul WOMAC - durere 12,4±2,67 5,7±2,26 <0,001 Scorul WOMAC – rigiditate 4,5±0,97 2,2±1,13 <0,001 Scorul WOMAC – funcţia fizică 44,5±9,98 25,5±6,46 <0,001

Îmbunătăţirea calităţii vieţii şi a parametrilor funcţionali este semnificativă şi în cazul meloxicamului (p<0,01). Ca şi la grupurile anterioare, în evaluarea utilizând HAQ-DI, se constată trecerea de la un scor între 1 şi 2 (1,25±0,34), reprezentând o dizabilitate moderată până la severă la un scor între 0 şi 1, reprezentând în general o dificultate uşoară până la moderată (0,78±11,73) (Tabelul 6).

Variatia valorilor MDA la pacientii tratati cu meloxicam

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 2 4 6 8 10 12

MD

A (n

mol

/ml)

initialfinal



meloxicam

Variatia valorilor NO la pacientii tratati cu meloxicam

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 2 4 6 8 10 12

NO

(mic

rom

ol/l)

initialfinal



meloxicam

Variatia SOD la pacientii tratati cu meloxicam

0

50

100

150

200

250

0 2 4 6 8 10 12

SOD

(U/m

l)

initialfinal



meloxicam

Variatia GPx la pacientii tratati cu meloxicam

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

0 2 4 6 8 10 12

GP

x (U

/l) initialfinal



meloxicam

23

8. 3. Discuţii 8. 3. 1. Efectul oxicamilor asupra nivelului malondialdehidei Nivelurile iniţiale ale MDA obţinute în urma investigaţiilor biochimice la lotul

tratat cu tenoxicam, respectiv meloxicam nu au avut o diferenţă semnificativă comparate între ele. În grupul tratat cu piroxicam, nivelurile iniţiale ale MDA au fost uşor mai ridicate decât în celelalte două grupuri (Tabelul 7). Rezultatele au arătat că nivelurile MDA după tratament au fost uşor mai scăzute în toate cele trei grupuri de pacienţi (Figura 14), dar nici unul dintre cele trei AINS care aparţin grupului oxicamilor nu a avut o influenţă semnificativă statistic asupra MDA (p>0,05). Tabelul 7. Nivelurile plasmatice ale malondialdehidei (MDA) la cele trei loturi Oxicamul cu care a fost tratat lotul

Valorile MDA (nmol/ml) iniţiale (mean ±SD)

Valorile MDA (nmol/ml) finale (mean ±SD)

Nivelul p

Piroxicam 1,169 ± 0,663 1,085 ± 0,591 0,19 Tenoxicam 0,933 ± 0,388 0,834 ± 0,191 0,512 Meloxicam 0,999 ± 0,44 0,893 ± 0,362 0,57

Nivelul p reprezintă comparaţia măsurătorilor de la începutul şi de la finalul tratamentului în fiecare grup (testul t împerecheat).

Variatiile MDA (medii)

1,169

0,933 0,9991,085

0,834 0,893

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Piroxicam Tenoxicam Meloxicam

MDA

(nm

ol/m

l)

initialfinal

Figura 14. Variaţiile MDA (medii) la pacienţii trataţi cu piroxicam, tenoxicam şi meloxicam

Rezultatele obţinute în urma studiului efectuat – o scădere uşoară, dar nesemnificativă statistic a nivelurilor MDA la pacienţii cu artroză, trataţi cu meloxicam (un inhibitor selectiv al COX-2) şi cu piroxicam, respectiv tenoxicam (inhibitori neselectivi ai COX) relevă rezultate asemănătoare datelor din literatură.

După tratamentul cu cei trei membrii ai grupului oxicamilor, nivelurile plasmatice ale MDA au scăzut comparativ cu cele iniţiale, dar niciunul dintre cele trei AINS nu a determinat modificări semnificative statistic, deci niciunul dintre cei trei oxicami nu influenţează semnificativ peroxidarea lipidelor.

24

8. 3. 2. Efectul oxicamilor asupra nivelului oxidului nitric Nivelurile NO determinate la începutul tratamentului la pacienţii din loturile

tratate cu piroxicam şi meloxicam nu au avut o diferenţă semnificativă comparate între ele. În lotul tratat cu tenoxicam, nivelurile iniţiale ale NO au fost uşor mai ridicate decât în celelalte două grupuri (Tabelul 8). Tabelul 8. Nivelurile plasmatice ale oxidului nitric (NO) la cele trei loturi

Oxicamul cu carea fost tratat lotul

Valorile NO (µmol/L) iniţiale (mean ±SD)

Valorile NO (µmol/L) finale (mean ±SD)

Nivelul p

Piroxicam 21,57±6,86 17,68±4,29 0,006 Tenoxicam 30,71±13,88 23,88±7,29 0,213 Meloxicam 22,019±7,89 20,68±8,83 0,72

Nivelul p reprezintă comparaţia măsurătorilor de la începutul şi de la finalul tratamentului în fiecare grup (testul t împerecheat)

La pacienţii din lotul tratat cu piroxicam s-a putut observa o scădere semnificativă a nivelului NO (p=0,006). În cazul loturilor tratate cu tenoxicam, respectiv meloxicam, variaţia NO nu a fost semnificativă statistic (p=0,213, respectiv p=0,72). În urma rezultatelor obţinute se poate observa că valoarea plasmatică a NO a scăzut în cazul celor trei loturi (Figura 15), dar numai piroxicamul a determinat modificări semnificative statistic (p=0,006).

Variatiile NO (medii)

21,57

30,71

22,019

17,68

23,8820,68

0

5

10

15

20

25

30

35


NO

(mic

rom

ol/l)

initialfinal

Figura 15. Variaţiile NO (medii) la pacienţii trataţi cu piroxicam, tenoxicam şi meloxicam

Rezultatele obţinute, un efect de reducere a NO semnificativ pentru piroxicam - un inhibitor neselectiv al COX-2, dar nesemnificativ pentru tenoxicam – de asemenea un inhibitor neselectiv al COX şi pentru meloxicam – un inhibitor selectiv al COX-2, sunt contradictorii, sugerând un mecanism independent de inhibiţia COX.

8. 3. 3. Efectul oxicamilor asupra activităţii superoxid dismutazei Nivelurile SOD determinate la începutul tratamentului la pacienţii din loturile

tratate cu piroxicam şi meloxicam nu au avut o diferenţă semnificativă comparate între ele. În lotul tratat cu tenoxicam, nivelurile iniţiale ale SOD au fost puţin mai mari decât la celelalte două loturi (Tabelul 9). La pacienţii trataţi cu piroxicam şi meloxicam s-a putut

25

observa o creştre a nivelului SOD, pe când în cazul lotului tratat cu tenoxicam are loc o uşoară scădere a SOD (Figura 16). Tabelul 9. Nivelurile superoxid dismutazei (SOD) la cele trei loturi


Valorile SOD (U/ml) iniţiale (mean ±SD)

Valorile SOD (U/ml) finale (mean ±SD)

Nivelul p

Piroxicam 150,15±25,79 172,68±20,24 0,04 Tenoxicam 169,05±33,19 167,12±19,92 0,85 Meloxicam 153,15±21,82 166,22±27,75 0,11

Nivelul p reprezintă comparaţia măsurătorilor de la începutul şi de la finalul tratamentului în fiecare grup (testul t împerecheat).

Variatia nivelului SOD (medii)

135140

145150

155160

165170

175


SOD

(U/m

l)

initialfinal

Figura 16. Variaţiile SOD (medii) la cele trei loturi.

La pacienţii din lotul tratat cu piroxicam s-a putut observa o creştere semnificativă a SOD (p=0,04). În cazul loturilor tratate cu tenoxicam, respectiv meloxicam, variaţia SOD nu a fost semnificativă statistic (p=0,85, respectiv p=0,11).

În urma rezultatelor obţinute în acest studiu se poate observa că valoarea medie a SOD a crescut semnificativ în cazul lotului tratate cu piroxicam şi neseminificativ în cazul meloxicamului şi a scăzut nesemnificativ în cazul lotului tratat cu tenoxicam, deci numai piroxicamul a determinat modificări semnificative statistic (p=0,04).

8. 3. 4. Efectul oxicamilor asupra activităţii glutation peroxidazei Nivelul GPx determinate la începutul tratamentului la pacienţii din lotul tratat cu

piroxicam a fost uşor mai ridicat decât la loturile tratate cu tenoxicam şi meloxicam (Tabelul 10). La toate cel trei loturi s-a constat o creştere a nivelului GPx (Figura 17). Tabelul 10. Nivelurile glutation peroxidazei (GPx) la cele trei loturi


Valorile GPx (U/l) iniţiale (mean ±SD)

Valorile GPx (U/l) finale (mean ±SD)

Nivelul p

Piroxicam 7920±1600,3 8588±1494,6 0,25 Tenoxicam 7239±1907,7 7532±1683,3 0,58 Meloxicam 6662±1772,2 8272±2744,4 0,052

Nivelul p reprezintă comparaţia măsurătorilor de la începutul şi de la finalul tratamentului în fiecare grup (testul t împerecheat)

26

Variatia valorilor GPx (medii)

0100020003000400050006000700080009000

10000


GP

x (U

/l)

initialfinal

Figura 17. Variaţiile GPx (medii) la cele trei loturi

În acest studiu s-a constatat că în cazul tuturor celor trei loturi valorile GPx au

crescut uşor, dar variaţia nu a fost semnificativă statistic (p>0,05). 8. 3. 5. Evaluarea parametrilor funcţionali şi cuantificarea calităţii vieţii la

pacienţii cu artroză Scorul WOMAC În tabelul 11 sunt prezentate variaţiile scorului la cele trei loturi tratate cu

oxicami, putându-se observa o scădere semnificativă (p<0,01) a parametrilor în cadrul celor trei secţiuni ale scorului, ceea ce indică o îmbunătăţire a calităţii vieţii pacienţilor la toate cele trei loturi. Tabelul 11. Evaluarea funcţională utilizând scorul WOMAC LK3.1

Secţiunea Lotul tratat cu piroxicam

Lotul tratat cu tenoxicam

Lotul tratat cu meloxicam

A. Durerea Iniţial, medie ± DS Final, medie ± DS Valoarea p

15±2,49 8,5±2,46 <0.01

13,7±3,19 7,4±3,33 <0.01

12,1±2,94 5,3±2,44 <0.01

B. Rigiditatea Iniţial, medie ± DS Final, medie ± DS Valoarea p

5 ± 1.563 2.5 ± 1.178 <0.01

4.5 ± 1.957 2.6 ± 1.429 <0.01

4.3 ± 0.916 2 ± 1.069 <0.01

C. Funcţia fizică Iniţial, medie ± DS Final, medie ± DS Valoarea p

52.2 ± 8.243 33.7 ± 6.992 <0.01

47.4 ± 6.931 32.1 ± 6.822 <0.01

44.3 ± 10.848 25.2 ± 6.902 <0.01

În figura 18 sunt prezentate variaţiile scorului WOMAC secţiunea durere,

putându-se constata diminuarea lor semnificativă la toate cele trei loturi (p<0,01). La lotul tratat cu piroxicam s-a observat o scădere cu 43,4±16,4%, la lotul tratat cu tenoxicam o diminuare de 45,9±24,3% în timp ce la lotul tratat cu meloxicam scorul s-a

27

îmbunătăţit cu 56,2±20,19%. Astfel, comparând cele trei loturi se poate concluziona că dintre cei trei oxicami, meloxicamul scade cel mai mult durerea.

Variatiile scorului WOMAC - Sectiunea A: Durerea

0

5

10

15

20

PiroxicamTenoxicamMeloxicam

Piroxicam 15 8,5

Tenoxicam 13,7 7,4

Meloxicam 12,1 5,3

initial final

Figura 18. Variaţiile scorului WOMAC – Secţiunea A: durerea

Variaţiile scorului WOMAC secţiunea rigiditate sunt prezentate în figura 19,

observându-se şi în acest caz diminuarea semnificativă a scorului la toate cele trei loturi (p<0,01). La această secţiune s-a constatat o diminuare de 50±23,4% a scorului în cazul lotului tratat cu piroxicam, de 42,23±31,55% în cazul lotului tratat cu tenoxicam şi de 53,48±24,65% în cazul meloxicamului. Se poate concluziona că meloxicamul diminuă cel mai mult rigiditatea, iar tenoxicamul are cea mai mică influenţă asupra acestui parametru.

Variatiile scorului WOMAC - Sectiunea B: Rigiditatea

0123

456


Piroxicam 5 2,5

Tenoxicam 4,5 2,6

Meloxicam 4,3 2

initial final

Figura 19. Variaţiile scorului WOMAC – Secţiunea B: rigiditatea

În ceea ce priveşte secţiunea C a scorului WOMAC – capacitatea de a realiza

activităţile zilnice, s-a putut constata de asemenea diminuarea semnificativă a scorului la toate cele trei loturi (p<0,01). În acest caz, scorul s-a micşorat cu 35,45± 13,39% la piroxicam, cu 32,28±14,38% la tenoxicam şi cu 43,12±15,57 la meloxicam. Şi în acest caz, cel mai bun scor a fost realizat de lotul tratat cu meloxicam, pe când la tenoxicam s-a observat cea mai mică influenţă (Figura 20).

28

Variatille scorului WOMAC - Sectiunea C: Functia fizica

0

20

40

60


Piroxicam 52,2 33,7

Tenoxicam 47,4 32,1

Meloxicam 44,3 25,2

initial final

Figura 20. Variaţiile scorului WOMAC – Secţiunea C: capacitatea de a realiza activităţile zilnice

HAQ (Health Assessment Questionnaire) HAQ-DI include întrebări care privesc mişcările fine ale membrelor superioare,

activităţile locomotorii ale membrelor inferioare, activităţi care implică atât membrele inferioare cât şi pe cele superioare, luând în considerare dispozitivele sau ajutorul dat de altă persoană. Pentru fiecare întrebare există patru nivele de răspuns, cu punctaj de la 0 la 3, punctajul cel mai mare indicând cel mai mare grad de dizabilitate (0 = fără nicio dificultate; 1=cu oarecare dificultate; 2=cu mare dificultate; 3=incapabil de a desfăşura activitatea respectivă). Valorile obţinute folosind scara HAQ-DI sunt prezentate în tabelul 12. Se poate observa o diferenţă nesemnificativă a valorilor iniţiale la toate cele trei loturi, aceste valori plasându-se între 1 şi 2 ceea ce înseamnă o dizabilitate moderată până la severă. După tratament în cazul tuturor celor trei loturi îmbunătăţirea constatată este semnificativă statistic (p<0,01), valorile plasându-se între 0 şi 1, care semnifică o dificultate uşoară până la moderată. Durerea folosind scara vizual analogă prezintă scăderi semnificative statistic la toate cele trei loturi (p<0,01). Tabelul 12. Valorile obţinute folosind chestionarul HAQ-DI

Parametrii evaluaţi Lotul tratat cu piroxicam

Lotul tratat cu tenoxicam

Lotul tratat cu meloxicam

HAQ-DI Iniţial, medie ± DS Final, medie ± DS Valoarea p

1,425±0,27 0,862±0,23 <0.01

1,4±0,26 0,85±0,24 <0.01

1,25±0,34 0,78±0,22 <0.01

Durere-VAS (mm) Iniţial, medie ± DS Final, medie ± DS Valoarea p

85 ± 11.785 66.5 ± 8.181 <0.01

84 ± 11.737 65 ± 8.498 <0.01

85 ± 11.952 56.2 ± 11.877 <0.01

În figura 21 se pot observa modificările aproape identice produse în loturile

tratate cu piroxicam şi tenoxicam. Variaţia procentuală a scorului a fost de 39,51±16,14% la lotul tratat cu piroxicam, de 39,28±17,4% la lotul tratat cu tenoxicam şi de 37,6±17,6%

29

la lotul tratat cu meloxicam, ceea ce determină comparativ un scor mai bun pentru piroxicam şi tenoxicam faţă de meloxicam.

Rezultatele obtinute folosind chestionarul HAQ-DI

0

0,5

1

1,5


Piroxicam 1,425 0,868

Tenoxicam 1,4 0,85

Meloxicam 1,25 0,78

initial final

Figura 21. Rezultatele obţinute folosind chestionarul Oswestry

Evaluarea durerii folosind scala vizual analogă, reprezentată în figura 22 a

confirmat scorul mai bun pentru meloxicam obţinut la secţiunea durere a scorului WOMAC. Diminuarea durerii, exprimată în procente, a fost de 21,77±9,62% pentru piroxicam, 22,62±10,1% pentru tenoxicam şi de 33,89±13,96% pentru meloxicam. Astfel, se poate observa uşor că în timp ce valorile iniţiale sunt aproape identice, la sfârşitul tratamentului piroxicamul şi tenoxicamul diminuă aproape identic durerea, pe când meloxicamul are o acţiune analgezică mai pronunţată.

Evaluarea durerii - scala VAS

0

20

40

60

80

100

mm


Piroxicam 85 66,5

Tenoxicam 84 65

Meloxicam 85 56,2

initial final

Figura 22. Evaluarea durerii – scala VAS

Indexul funcţional Lequesne pentru artroze descrie durerea sau disconfortul

resimţite de pacient în anumite situaţii. Rezultatele evaluării folosind scorul Lequesne sunt reprezenate în tabelul 13,

unde se poate observa o diminuarea semnificativă (p<0,01) la toate cele trei loturi. Tabelul 13. Rezultatele evaluării folosind scorul Lequesne Medicamentul cu care a fost tratat lotul

Valorile raportate la începutul tratamentului

Valorile la sfârsitul tratamentului

Valoarea p

Piroxicam 7,4±0,84 4±0,66 <0,01 Tenoxicam 7,1±0,87 3,9±0,87 <0,01 Meloxicam 6,5±1,26 3,5±1,26 <0,01

30

S-a putut constata o scădere de 45,94±8,91% în cazul piroxicamului, de 45,07±12,25% la tenoxicam şi de 46,16±19,38% pentru meloxicam. Astfel, folosind acest scor, s-au obţinut rezultate mai bune pentru piroxicam decât pentru tenoxicam şi meloxicam (Figura 23).

Variatiile scorului Lequesne

0

2

4

6

8


Piroxicam 7,4 4

Tenoxicam 7,1 3,9

Meloxicam 6,5 3,5

initial final

Figura 23. Variaţiile indicelul Lequesne pentru artroze

Chestionarul Oswestry este formulat pentru a da informaţii despre modul în

care durerea de la nivelul spatelui sau piciorului afectează viaţa cotidiană. La fiecare întrebare există şase variante de răspuns şi se bifează un singur răspuns, care descrie în modul cel mai clar problema respectivă, cu punctaje între 0 şi 5 [13]. Conform acestui chestionar ale cărui date sunt prezentate în tabelul 14, se constată o îmbunătăţire semnificativă (p<0,01) a calităţii vieţii la toate cele trei loturi. Tabelul 14. Rezultatele evaluării folosind chestionarul Oswestry Medicamentul cu care a fost tratat lotul

Valorile raportate la începutul tratamentului

Valorile la sfârsitul tratamentului

Valoarea p

Piroxicam 57±10,42 38,2±7,8 <0,01 Tenoxicam 54,33±11,23 36,35±9,69 <0,01 Meloxicam 51±9 27,3±6 <0,01

Scăderea cea mai importantă s-a produs şi de această dată tot în cazul lotului tratat cu meloxicam, loturile tratate cu piroxicam şi tenoxicam prezentând aproximativ aceleaşi scoruri iniţiale şi finale (Figura 24).

57 54,3351

38,2 36,35

27,3

0

10

20

30

40

50

60

initial final

Variatiile conform chestionarului Oswestry


Figura 24. Variaţiile conform chestionarului Oswestry

31

8. 4. Concluzii 1. După tratamentul cu cei trei membrii ai grupului oxicamilor, nivelurile

plasmatice ale MDA au scăzut comparativ cu cele iniţiale, dar niciunul dintre cei trei oxicami nu au determinat modificări semnificative statistic.

2. Studiul a arătat că cele trei AINS aparţinând grupului oxicamilor nu influenţează semnificativ peroxidarea lipidelor.

3. La pacienţii din lotul tratat cu piroxicam s-a putut observa o scădere semnificativă a nivelului NO (p=0,006).

4. În cazul loturilor tratate cu tenoxicam, respectiv meloxicam, variaţia NO nu a fost semnificativă statistic (p=0,213, respectiv p=0,72).

5. După tratamentul timp de 20 de zile cu piroxicam, tenoxicam şi meloxicam la pacienţii cu gonartroză s-a putut observa că tenoxicamul şi meloxicamul nu influenţează semnificativ nivelul seric al NO, în timp ce piroxicamul reduce semnificativ nivelul NO, ceea ce indică o interferenţă cu căile oxidului nitric.

7. Aceste rezultate, un efect de reducere a NO semnificativ pentru piroxicam - un inhibitor neselectiv al COX-2, dar nesemnificativ pentru tenoxicam – de asemenea un inhibitor neselectiv al COX şi pentru meloxicam – un inhibitor selectiv al COX-2, sunt contradictorii, sugerând un mecanism independent de inhibiţia COX.

8. La pacienţii din lotul tratat cu piroxicam s-a putut observa o creştere semnificativă a SOD (p=0,04).

9. În cazul loturilor tratate cu tenoxicam, respectiv meloxicam, variaţia SOD nu a fost semnificativă statistic (p=0,85, respectiv p=0,11).

11. Nivelul GPx determinate la începutul tratamentului la pacienţii din lotul tratat cu piroxicam a fost uşor mai ridicat decât la loturile tratate cu tenoxicam şi meloxicam şi la toate cel trei loturi s-a constat o creştere a nivelului GPx.

12. În cazul tuturor celor trei loturi valorile GPx au crescut uşor, dar variaţia nu a fost semnificativă statistic (p>0,05).

13. Scorul WOMAC secţiunea durere, arată o diminuare semnificativă la toate cele trei loturi (p<0,01).

14. Comparând cele trei loturi se poate observa că dintre cei trei oxicami, meloxicamul scade cel mai mult durerea.

15. Scorul WOMAC secţiunea rigiditate arată o diminuarea semnificativă a scorului la toate cele trei loturi (p<0,01).

16. Dintre cei trei oxicami, meloxicamul diminuă cel mai mult rigiditatea, iar tenoxicamul are cea mai mică influenţă asupra acestui parametru.

17. În ceea ce priveşte secţiunea C a scorului WOMAC – capacitatea de a realiza activităţile zilnice, s-a putut constata de asemenea diminuarea semnificativă a scorului la toate cele trei loturi (p<0,01), cel mai bun scor fiind realizat de lotul tratat cu meloxicam, pe când la tenoxicam s-a observat cea mai mică influenţă.

18. La valorile obţinute folosind scara HAQ-DI se poate observa o diferenţă nesemnificativă a valorilor iniţiale la toate cele trei loturi, aceste valori plasându-se între 1 şi 2 ceea ce înseamnă o dizabilitate moderată până la severă.

19. După tratament în cazul tuturor celor trei loturi îmbunătăţirea constatată utilizând scara HAQ-DI este semnificativă statistic (p<0,01), valorile plasându-se între 0 şi 1, care semnifică o dificultate uşoară până la moderată.

32

20. Comparativ, în scara HAQ-DI, se observă un scor mai bun pentru piroxicam şi tenoxicam faţă de meloxicam.

21. Durerea folosind scala vizual analogă prezintă scăderi semnificative statistic la toate cele trei loturi (p<0,01), putându-se observa modificări aproape identice produse în loturile tratate cu piroxicam şi tenoxicam.

22. Folosind scala vizual anlogă, comparativ se observă un scor mai bun pentru meloxicam faţă de tenoxicam şi piroxicam.

23. Evaluarea durerii folosind scara vizual analogă a confirmat scorul mai bun pentru meloxicam obţinut la secţiunea durere a scorului WOMAC, la sfârşitul tratamentului piroxicamul şi tenoxicamul diminuă aproape identic durerea, pe când meloxicamul are o acţiune analgezică mai pronunţată.

24. Folosind scorul Lequesne se poate observa o diminuarea semnificativă (p<0,01) la toate cele trei loturi, obţinându-se rezultate mai bune pentru piroxicam decât pentru tenoxicam şi meloxicam.

25. Conform chestionarului Oswestry se constată o îmbunătăţire semnificativă (p<0,01) a calităţii vieţii la toate cele trei loturi, scăderea cea mai importantă producându-se şi de această dată tot în cazul lotului tratat cu meloxicam, loturile tratate cu piroxicam şi tenoxicam prezentând aproximativ aceleaşi scoruri iniţiale şi finale

26. O îmbunătăţire semnificativă a fost observată în ceea ce priveşte evaluarea parametrilor funcţionali la toate loturile tratate (p <0,01).

9. Modele virtuale predictive. Studii de modelare moleculară 9. 1. Material şi metodă 9.1.1. Studiul QSPR al coeficientului de partiţie apă/octanol Pentru a obţine mai multe informaţii asupra interacţiei oxicamilor cu receptorii

biologici am corelat coeficientul de partiţie cu diferite date structurale (descriptori). Coeficientul de partiţie descrie hidrofobicitatea sau, mai bine zis, lipofilia substanţelor care joacă un rol important în adsorbţia şi absorbţia acestora de către membranele biologice.

Geometriile moleculare obţinute pentru compuşii analizaţi au fost utilizate, pentru acest studiu avansat, ca date de input în pachetul de programe MOPAC 7.0 [56,57] care pornind de la aceste geometrii efectuează calcule cuanto-moleculare semiempirice. Datele de output conţin nivele electronice moleculare, populaţie electronică, sarcini nete pe atomi, ordine de legătură şi valenţe libere, momente de dipol, momente de inerţie, polarizabilităţi şi diferite partiţii energetice după tip de interacţii şi legături chimice. Corelarea coeficientului de partiţie cu aceşti parametri (descriptori) care reliefează diferitele aspecte structurale precum şi comportamentul fizic şi chimic al substanţelor studiate a fost realizată utilizând programul CODESSA 1.0 (Comprehensive Descriptors for Structural and Statistical Analysis, University of Florida) [58]. Acest program calculează din datele MOPAC de output diferiţi descriptori structurali topologici, electrostatici, geometrici şi cuantomoleculari, efectuând prin procedeul de crossvalidare selecţia acestora şi apoi corelarea prin regresie multiliniară cu proprietatea dorită. Marea varietate de descriptori oferită de programul CODESSA permite investigarea interacţiilor medicament – receptor.

33

Cu ajutorul programului CODESSA am calculat şi sarcinile nete pe atomii din moleculele studiate, mărimi definite ca diferenţe între numărul de electroni cu care fiecare atom participă la formarea legăturilor (Zi) şi densitatea de sarcină qi:

Densitatea de sarcină şi, implicit, sarcinile nete pe atomii din moleculă oferă informaţii privind structura electronică a moleculei, a distribuţiei electronilor pe atomi şi reprezintă indici de reactivitate ai moleculei cu receptorul biologic.

9. 1. 2. Docking molecular Tehnica “Molecular Docking” a fost folosită pentru testarea unor oxicami

(piroxicam, tenoxicam şi meloxicam), ca potenţiali inhibitori ai mieloperoxidazei (MPO, cod 1CXP-Protein Data Bank [59,60]), o enzimă produsă prin activarea leucocitelor [61] şi, de asemenea, ca inhibitori ai ciclooxigenazei, izoformele COX 1 şi COX 2 [62,63]. Atât structurile enzimelor, cât şi structurile oxicamilor au fost pregătite pentru procesul de andocare cu ajutorul programului Hex 5.0 [64], fiind modelate utilizând funcţii parametrice 3D care codifică deopotrivă forma suprafeţei, sarcina electrostatică cât şi distribuţia de potenţial. Aceste funcţii parametrice se bazează pe funcţii de bază ortogonal sferice sau polare.

Pentru obţinerea unei ,,docări’’ cât mai eficiente a fost utilizat pe de o parte algoritmul Fourier care permite accelerarea căutării celor mai favorabile orientări de ,,docare’’ în molecula receptorului cu translatarea ligandului, iar pe de altă parte a fost utilizată aproximaţia polar sferică care permite deopotrivă translatarea şi rotirea ligandului pentru generarea şi evaluarea orientărilor optime.

9.2. Rezultate 9.2.1. Studiul QSPR al coeficientului de partiţie apă/octanol Substanţele chimice studiate sunt 14 compuşi din clasa oxicamilor, compuşi cu

acţiune analgezică, antipiretică şi antiinflamatoare (Tabelele 15a şi 15b).

S

O O

O O

CH 3N

NH

R1

R2

Tabelul 15a. Clasa de oxicami studiată

Substanţa R1 R2 1 H N

2 H S

N

CH 3

3 H S

N

34

Substanţa R1 R2 4 H

ON

CH 3 5 -CH(CH3)OCOOCH2CH3 N

6 -COCH=CHC6H5 N

7 H -(CH2)3N(CH3)2 8 H N

CH 3

9 -CH(CH3)2 N

10 -CH3 N

11 -COC6H5 N

Tabelul 15b. Clasa de oxicami studiată (continuare)

Substanta Structura 12

S

O O

OH O

CH 3N

NH

NS

13

S

O O

O

O

CH 3N

N

NO

14

HS

S

O O

OH

CH 3N

N N

O

Cl

1. piroxicam, 2. meloxicam, 3. sudoxicam, 4. isoxicam, 5. ampiroxicam, 6. cinoxicam, 7. propoxicam, 8. N-6M2P-Piroxicam (N-(6-metil-2-piridil)-4-hidroxi-2-metil-2H-1,2-

35

benzothiazine-3-carboxamide 1,1-dioxide), 9. 4-IPO-Piroxicam (4-Isopropiloxi-2-metil-N-2-piridinil-2H-1,2-benzothiazine-3-carboxamide 1,1-dioxide), 10. 4-MO-Piroxicam (4-Metoxi-2-metil-N-(2-piridil)-2H-1,2-benzothiazine-3-carboxamide 1,1-dioxide, 11. 4-BO-Piroxicam (4-Benzoiloxi-2-metil-N-(2-piridil)-2H-1,2- benzothiazine-3-carboxamide 1,1-dioxide), 12. tenoxicam, 13. droxicam, 14. lornoxicam [61].

Descriptorii structurali, mărimi care caracterizează forma moleculară a substanţelor chimice, calculaţi pentru aceşti compuşi şi valorile lor sunt prezentaţi în tabelul 16. Tabelul 16. Valori ale descriptorilor structurali Subst. CSAA,

Å2 CSEV, Å3

OV RM, cm3/mol

µ, D Et, kcal/mol

1 477,627 235,396 1,4034 85,04 5,857 -88055,6 2 504,143 248,064 1,4286 90,91 5,259 -89634,6 3 468,985 232,254 1,3877 85,09 4,684 -86183,8 4 489,076 233,496 1,4329 85,80 4,048 -92053,9 5 642,430 343,564 1,5350 111,21 3,957 -124880 6 589,542 363,715 1,4001 124,61 6,090 -121500,6 7 552,443 269,530 1,4892 89,99 4,830 -90954,5 8 494,828 249,573 1,4145 90,08 5,952 -91388,67 9 528,910 286,950 1,4160 98,96 2,516 -98175,5 10 486,050 253,813 1,3763 89,79 3,624 -91273,05 11 602,177 319,212 1,5024 114,37 3,368 -115159,5 12 459,013 227,915 1,3689 83,91 5,746 -86119,4 13 510,471 239,158 1,4739 87,92 3,580 -96847,6 14 484,901 241,179 1,4013 88,68 5,930 -93062,5

CSAA – Connolly surface accessible area, CSEV – Connolly solvent – excluded volume, OV – ovality, RM – molar refractivity, µ - dipole moment, Et – total energy

9.2.2. Docarea piroxicamului, tenoxicamului şi meloxicamului în situsul activ al mieloperoxidazei şi al ciclooxigenazelor

Cunoscând activitatea antiinflamatorie, analgezică şi antipiretică a oxicamilor [61], trei dintre aceştia (meloxicam, piroxicam şi tenoxicam) au fost testaţi şi ca potenţiali inhibitori ai mieloperoxidazei (MPO, Figura 25).

Figura 25. Structura mieloperoxidazei MPO (cod 1CXP - Protein Data Bank)

36

In Figura 26 sunt prezentate structurile optimizate cu ajutorul programului

ArgusLab [66] ale celor trei oxicami: meloxicam, piroxicam şi tenoxicam.

a b c Figura 26. Structurile optimizate pentru meloxicam (a), piroxicam (b) şi tenoxicam (c)

Deoarece prin translatarea şi rotirea ligandului procesul de docare este mai complet, în Tabelul 17 vor fi prezentate valorile energiilor de legare (afinităţi) (kJ/mol) ale complecşilor oxicam - MPO. Tabelul 17. Valorile energiilor de legare ale complecşilor oxicam - MPO

Oxicami Meloxicam Piroxicam Tenoxicam-409.6 -392.2 -286.1

De asemenea, am studiat şi activitatea inhibitorie a celor trei compuşi asupra

ciclooxigenazelor (COX-1 şi COX-2) (figura 27). In tabelul 18 sunt prezentate valorile energiilor de legare ale complecşilor oxicam – COX.

Figura 27. Structura enzimei COX 2 (cod 1CX2 - Protein Data Bank)

37

Tabelul 18. Valorile energiilor de legare ale complecşilor oxicam - COX Oxicami Meloxicam (kJ/mol) Piroxicam (kJ/mol) Tenoxicam (kJ/mol) COX-1 COX-2 COX-1 COX-2 COX-1 COX-2 -28.02 -36.14 -29.00 -34.12 -41.41 -31.08

In ceea ce priveşte sarcinile nete atomice în moleculă, avem pentru fiecare din cei trei compuşi următoarea distribuţie electronică (figura 28):

Meloxicam

Piroxicam

Tenoxicam Figura 28: Valorile sarcinilor nete pe atomii din cei trei oxicami

38

9. 3. Discuţii 9. 3. 1. Studiul QSPR al coeficientului de partiţie apă/octanol In corelarea de tip QSPR a coeficientului de partiţie cu diferiţi descriptori

structurali, din cei 335 descriptori pe care programul CODESSA 1.0 poate să-i calculeze din datele de output MOPAC 7.0, relevanţi în acest caz par să fie descriptorii cuantomoleculari prezentaţi în tabelul 22 (R2 – coeficient de corelare).

Tabelul 22. Corelarea log P = a0 + ∑=

6

1iii Xa

, unde Xi = descriptori 3 descriptors: best correlations (F): 1: R2=0.9694 F=105.6348 (3 descriptors) 331 79 141 2: R2=0.9616 F= 83.3638 (3 descriptors) 331 79 122 3: R2=0.9611 F= 82.2747 (3 descriptors) 331 79 59 2 descriptors: best correlations (F): 1: R2=0.9486 F=101.4772 (2 descriptors) 331 79 2: R2=0.9246 F= 67.4424 (2 descriptors) 331 81 3: R2=0.9156 F= 59.6897 (2 descriptors) 331 141 1 descriptor: best correlations (F): 1: R2=0.8776 F= 86.0022 (1 descriptors) 331 2: R2=0.7663 F= 39.3455 (1 descriptors) 48 descriptors involved: 331 - ALFA polarizability (DIP) 79 - Total point-charge component of the molecular dipole 141 - Min valency of a N atom 122 - Min atomic orbital electronic population 59 - Max atomic one-electron react. index for a C atom 81 - Total dipole of the molecule 48 - Average atomic electroph. react. index for a C atom

După cum se poate observa, descriptorii de formă moleculară sunt importanţi în procesul de partiţie între faza apoasă şi faza lipidică (membrana biologică) caracterizată de coeficienţii de partiţie log P, adică o astfel de corelare arată rolul potenţial al unor descriptori dependenţi de structurile chimice ale substanţelor.

Acest lucru devine din ce în ce mai evident în cazul în care sunt consideraţi mai puţini descriptori. Astfel, corelarea coeficientului de partiţie cu 1 descriptor arată că valorile acestui coeficient depind de polarizabilitate şi de indicele de reactivitate care, în ultimă instanţă, depind de forma în spaţiu a fiecărei molecule şi au dirirect de-a face cu interacţia ligand - receptor.

Cu ajutorul acestor descriptori poate fi obţinută o ecuaţie de tip Hansch: log P = a0 + a1 X1 + a2 X2 + a3 X3,

39

care leagă descriptorii semnificativi consideraţi în Tabela 4 (X1 - ALFA polarizability, X2 - Total point-charge component of the molecular dipole, X3 - Min valency of a N atom), de coeficientul de partiţie al substanţelor studiate, coeficientul de corelare regresională fiind în acest caz apropiat de unitate (R2 = 0.9694, eroarea standard a valorilor prezise fiind de 0.0408).

Valorile coeficienţilor de regresie din ecuaţiile Hansch, estimate prin metoda regresiei liniare multiple (CODESSA), sunt următoarele:

a0 = -2.1337 · 10+1 (intercepţia sau termenul liber); a1 = 3.2353 · 10-2; a2 = -3.0078 · 10-1; a3 = 5.6162. Gradul de încredere între valorile observate şi cele prezise cu această ecuaţie

este reprezentat în figura 29.

Figura 29. Gradul de încredere pentru ecuaţia Hansch

După cum se poate observa din graficul privind gradul de confidenţă al valorilor observate şi prezise, se poate considera că ecuaţia de tip Hansch stabilită în acest studiu poate fi utilizată pentru prezicerea activităţii biologice a unor noi derivaţi din serie.

9. 3. 2. Docarea piroxicamului, tenoxicamului şi meloxicamului în situsul

activ al mieloperoxidazei şi al ciclooxigenazelor Din datele prezentate în tabelul 17 se poate concluziona că edificiul molecular

Meloxicam–MPO (Figura 30), având valoarea energetică cea mai mică, reprezintă un potenţial agent de inhibare a mieloperoxidazei.

Figura 30. Structura complexului Meloxicam-MPO

40

După cum se poate observa în tabelul 18, cel mai bun inhibitor al enzimei COX 1 este tenoxicamul, iar cel al enzimei COX 2 este meloxicamul, având energiile de legare cu valorile -41.41 şi respectiv -36.14.

In interacţia de tip electrofil dintre substanţa medicamentoasă (oxicam) şi receptorul biologic (ciclooxigenază) poziţiile cele mai reactive sunt cele cu densitate de sarcină maximă, adică cu sarcină netă negativă maximă în valoare absolută. Astfel, în acest tip de interacţie ligand – receptor, responsabil pentru manifestarea activităţii de inhibare pare a fi atomul de oxigen, cu sarcinile nete -0.93690 (meloxicam), -0.93700 (piroxicam) şi -0.93260 (tenoxicam).

In interacţia de tip nucleofil dintre ligand (oxicam) şi receptorul biologic poziţiile cele mai reactive sunt cele cu densitate de sarcină minimă, adică cu sarcină netă pozitivă maximă. Astfel, în acest tip de interacţie, responsabil pentru manifestarea activităţii biologice pare a fi atomul de sulf, cu sarcinile nete 2.85610 (meloxicam), 2.86060 (piroxicam) şi 2.89100 (tenoxicam).

9. 4. Concluzii 1. Tehnica ,,Molecular docking’’ este o unealtă eficientă în selectarea

potenţialilor agenţi terapeutici. Tehnica permite aprecierea modului potrivit de legare a unei molecule de ligand în situsul activ al receptorului biologic şi, de asemenea, permite evaluarea energiei de legare minimă. Atunci când sintezele de compuşi chimici (potenţiali agenţi terapeutici) presupun costuri financiare ridicate, pentru ca cercetătorii să aibă un verdict în continuarea sau nu a sintezelor, se apelează la această tehnică. Pentru a o putea aplica trebuie cunoscute diverse date despre ţinta biologică.

2. In cazul prezentului studiu rezultatele obţinute au arătat că Meloxicam-MPO, având valoarea energetică cea mai mică, reprezintă cel mai bun agent de inhibare a mieloperoxidazei, iar cel mai bun inhibitor al enzimei ciclooxigenază 1 este tenoxicamul şi cel al enzimei ciclooxigenază 2 este meloxicamul.

3. Sarcinile nete repatizate pe atomii din moleculele studiate, apărute în urma formării legăturilor chimice, descriu natura şi reactivitatea atomilor din molecule şi indică atomii care contribuie la formarea răspunsului biologic al clasei de substanţe studiată. Astfel, la formarea activităţii de inhibare manifestată de compuşii din clasa oxicamilor contribuie cel mai mult atomii de oxigen (sp2) şi sulf (sp2).

4. Contrar tehnicii de docare, tehnica QSAR/QSPR nu necesită informaţii despre receptorul biologic, dar permite corelarea activităţii biologice manifestată de compuşii din clasa oxicamilor cu diverşi parametrii structurali (descriptori). Deoarece nu necesită nici alinierea ligandului şi nici găsirea conformaţiei potrivite interacţiei, această tehnică este rapidă şi se poate folosi ca screening virtual pentru baze de date moleculare foarte mari.

5. Corelarea structură chimică – proprietate pentru această serie de substanţe a arătat rolul potenţial al unor descriptori dependenţi de structurile chimice ale substanţelor, adică participarea acestor descriptori la partiţia fază apoasă / fază lipidică (membrană biologică) caracterizată de coeficienţii de partiţie log P.

6. Ecuaţia Hansch stabilită în acest studiu permite calcularea coeficientului de partiţie al unui derivat nou, înainte ca acesta să fie testat şi activitatea lui biologică să fie determinată experimental, prin modulare chimică cu ajutorul calculatorului. Altfel spus,

41

activitatea de inhibare a enzimelor MPO şi COX caracteristică unor noi compuşi ar putea fi prezisă cu ajutorul ecuaţiei Hansch formulată în acest studiu.

10. CONCLUZII FINALE Din cercetarea clinico-biologică asupra mecanismelor de acţiune adiacente

inhibiţiei ciclooxigenazei şi a eficienţei terapeutice în artroze ale unor compuşi chimici din grupa oxicamilor (piroxicam, tenoxicam, meloxicam) se extrag următoarele concluzii:

1. Cei trei compuşi demonstrează efecte antioxidante în grade diferite în boala artrozică, influenţând stresul oxidativ în ordinea piroxicam> meloxicam> tenoxicam.

2. După tratamentul cu oxicami în doze terapeutice timp de 20 de zile nivelurile plasmatice ale malondialdehidei, marker al stresului oxidativ, au scăzut faţă de nivelurile iniţiale, dar într-o manieră nesemnificativă. Ordinea de scădere a acestui parametru biochimic a fost: piroxicam> meloxicam>tenoxicam.

3. Studiul arată că cele trei antiinflamatoare nesteroidiene nu influenţează semnificativ peroxidarea lipidelor la pacienţii cu artroză.

4. Slaba acţiune a tenoxicamului asupra malondialdehidei este în concordanţă cu rezultatele unor studii recente din literatura de specialitate.

5. Oxidul nitric, un marker important în boala artrozică, a fost scăzut intens semnificativ de către piroxicam şi nesemnificativ de către meloxicam şi tenoxicam, ceea ce demonstrează o intricare a oxicamilor în căile metabolice ale NO. Ordinea de scădere a NO este piroxicam>>>meloxicam>tenoxicam.

6. Prin modificările produse de oxicami asupra NO, care este implicat în promovarea catabolismului cartilajului artrozic şi reducerea proceselor anabolice majore la nivelul articulaţiei, se poate afirma că aceste AINS au ca mecanism adiţional blocării ciclooxigenazei acţiuni de diminuare a stresului oxidativ.

7. Rezultatele obţinute asupra oxidului nitric sunt în concordanţă cu cele obţinute în determinările superoxid dismutazei, o enzimă a sistemelor antioxidante, cu o activitate scăzută în artroze. Creşterea activităţii superoxidismutazei a fost semnificativă în cazul piroxicamului şi nesemnificativă statistic la administrarea de meloxicam. Tenoxicamul nu a modificat activitatea superoxid dismutazei. Ordinea de modificare a superoxid dismutazei a fost piroxicam>>>meloxicam>> tenoxicam.

8. Activitatea glutation peroxidazei, un alt membru al sistemelor antioxidante, a crescut în mod nesemnificativ după cele 20 de zile de tratament cu oxicami în ordinea meloxicam>piroxicam>tenoxicam.

9. Comparând acţiunile tratamentului cu oxicami în artroze se poate afirma că acţiunea cea mai mare asupra stresului oxidativ o are piroxicamul, iar cea mai redusă tenoxicamul.

10. Deşi în timpul sintezei prostaglandinelor din acidul arahidonic sub influenţa COX sunt generaţi radicali liberi, doar inhibiţia COX nu pare a explica în totalitate efectele antioxidante demonstrate de oxicami, acest studiu susţinând ipoteza unui mecanism adiţional asupra stresului oxidativ, independent de blocarea COX.

11. Din analiza acţiunii terapeutice a celor trei oxicami am constatat că meloxicamul scade cel mai mult durerea şi rigiditatea şi creşte capacitatea de a realiza activităţi zilnice, iar tenoxicamul are cele mai slabe efecte în cadrul scorului WOMAC.

42

12. Evaluarea durerii folosind scala vizual analogă a confirmat scorul mai bun pentru meloxicam obţinut la secţiunea durere a scorului WOMAC. La sfârşitul tratamentului piroxicamul şi tenoxicamul diminuă aproape identic durerea, pe când meloxicamul are o acţiune analgezică mai pronunţată.

13. Folosind scorul Lequesne se poate observa o diminuare semnificativă la toate cele trei loturi a indicilor de scor, obţinându-se rezultate mai bune pentru piroxicam decât pentru tenoxicam şi meloxicam.

14. La valorile obţinute folosind chestionarul HAQ-DI, se poate observa iniţial o diferenţă nesemnificativă la toate cele trei loturi, aceste valori plasându-se între 1 şi 2, ceea ce înseamnă o dizabilitate moderată până la severă. După tratament în cazul tuturor celor trei loturi îmbunătăţirea constatată prin aceeaşi scală HAQ-DI este semnificativă statistic, valorile plasându-se între 0 şi 1, care semnifică o dificultate uşoară până la moderată.

15. Comparativ, în testul HAQ-DI, se observă un scor mai bun pentru piroxicam şi tenoxicam faţă de meloxicam.

16. Conform chestionarului Oswestry se constată o îmbunătăţire semnificativă a calităţii vieţii la toate cele trei loturi, ameliorarea cea mai importantă producându-se şi de această dată tot în cazul lotului tratat cu meloxicam, loturile tratate cu piroxicam şi tenoxicam prezentând aproximativ aceleaşi scoruri iniţiale şi finale.

17. Tehnica ,,Molecular docking’’ este o unealtă eficientă în selectarea potenţialilor agenţi terapeutici. Tehnica permite aprecierea modului potrivit de legare a unei molecule de ligand în situsul activ al receptorului biologic şi, de asemenea, permite evaluarea energiei de legare minimă. Atunci când sintezele de compuşi chimici (potenţiali agenţi terapeutici) presupun costuri financiare ridicate, pentru ca cercetătorii să aibă un verdict în continuarea sau nu a sintezelor, se apelează la această tehnică. Pentru a o putea aplica trebuie cunoscute diverse date despre ţinta biologică.

18. In cazul prezentului studiu rezultatele obţinute au arătat că deoarece Meloxicam–MPO are valoarea energetică cea mai mică, meloxicamul reprezintă cel mai bun agent de inhibare a mieloperoxidazei, iar cel mai bun inhibitor al enzimei ciclooxigenază 1 este tenoxicamul şi cel al enzimei ciclooxigenază 2 este meloxicamul.

19. Sarcinile nete repatizate pe atomii din moleculele studiate, apărute în urma formării legăturilor chimice, descriu natura şi reactivitatea atomilor din molecule şi indică atomii care contribuie la formarea răspunsului biologic al clasei de substanţe studiate. Astfel, la formarea activităţii de inhibare manifestată de compuşii din clasa oxicamilor contribuie cel mai mult atomii de oxigen (sp2) şi sulf (sp2).

20. Contrar tehnicii de docare, tehnica QSAR/QSPR nu necesită informaţii despre receptorul biologic, dar permite corelarea activităţii biologice manifestată de compuşii din clasa oxicamilor cu diverşi parametrii structurali (descriptori). Deoarece nu necesită nici alinierea ligandului şi nici găsirea conformaţiei potrivite interacţiei, această tehnică este rapidă şi se poate folosi ca screening virtual pentru baze de date moleculare foarte mari.

21. Corelarea structură chimică – proprietate pentru această serie de substanţe a arătat rolul potenţial al unor descriptori dependenţi de structurile chimice ale substanţelor, adică participarea acestor descriptori la partiţia fază apoasă / fază lipidică (membrană biologică) caracterizată de coeficienţii de partiţie log P.

43

22. Ecuaţia Hansch stabilită în acest studiu permite calcularea coeficientului de partiţie al unui derivat nou, înainte ca acesta să fie testat şi activitatea lui biologică să fie determinată experimental, prin modulare chimică cu ajutorul calculatorului. Altfel spus, activitatea de inhibare a enzimelor MPO şi COX caracteristică unor noi compuşi ar putea fi prezisă cu ajutorul ecuaţiei Hansch formulată în acest studiu.

23. În final, atât prin studiul clinic realizat, cât şi prin tehnicile de docare şi QSAR/QSPR, teza de doctorat aduce argumente asupra mecanismului adiţional al AINS de tip oxicami de diminuare a stresului oxidativ în artroze.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Roşu A, Vreju F., Artroza. În Reumatologie, p.387-414, 2007. Sub redacţia P. Ciurea, Ed. Medicală Universitară, Craiova. 2. Maneesh M, Jayalekshmi H, Suma T, Chatterjee S, Chakrabarti A, Singh TA., Evidence for oxidative stress in osteoarthritis, Indian J Clin Biochem, 2005, 20, 1:129-130. 3. Zhang W, Moskowitz RW, Nuki G, Abramson S, Altman RD, et al., OARSI recommendations for the management of hip and knee osteoarthritis, Part II: OARSI evidence-based, expert consensus guidelines, Osteoarthritis Cartilage, 2008, 16:137-162. 4. Sarzi-Puttini P, Cimino MA, Scarpa R, Caporali R, Parazzini F, Zaninelli A, Atzeni F, Canesi B – Osteoarthritis: an overview of the disease and its treatment strategies, Semin Arthritis Rheum, 2005, 35 (suppl 1):1-10. 5. Flugge LA, Miller-Deist LA, Petillo PA., Towards a molecular understanding of arthritis, Chem Biol,1999, 6, 6:R157-R166. 6. Driban, JB, Sitler, MR, Barbe, FM, Easwaran B., Is osteoarthritis a heterogeneous disease that can be stratified into subsets?, Clin Rheumatol, 2010, 29: 123–131. 7. Hart DJ, Spector TD, Brown P, Wilson P, Doyle DV, Silman AJ., Clinical signs of early osteoarthritis: reproducibility and relation to X ray changes in 541 women in the general population, Ann Rheum Dis, 1991, 50:467–470. 8. Cimino M.A., Parodi M., Risk Factors for osteoarthritis, Seminars in Arthritis and Rheumatism, 2005, 29-34. 9. Kumar Das S., Farooqi A., Osteoarthritis, Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 2008, 22, 4:657-675. 10. Yang KGA, Saris DBF, Dhert WJA, Verbout AJ., Osteoarthritis of the knee: current treatment options and future directions, Current Orthopaedics, 2004, 18:311-320. 11. Bruce B, Fries JF – The Health Assesment Questionnaire (HAQ), Clin Exp Rheumatol, 2005, 23 (Suppl. 39): S14-S18. 12. Bellamy N – The WOMAC Knee and Hip Osteoarthritis Indices: Development, validation, globalization and influence on the development of the AUSCAN Hand Osteoarthritis Indices, Clin Exp Rheumatol, 2005, 23 (Suppl. 39): 148-153. 13. http://www.tac.vic.gov.au/upload/Oswestry.pdf. 14. Lequesne MG., The algofunctional indices for hip and knee osteoarthritis, J Rheumatol. 1997, 24:779-781. 15. Miao L, St. Clair DK., Regulation of superoxide dismutase gene: Implications in disease, Free Radical Biology &Medicine, 2009, 47:344-356.

44

16. Dröge W., Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function, Physiological Reviews, 2002, 82:47-95. 17. Dejica D, Comes L, Duma L, Mureşan A, Pop S, Porr P J, Szanto P, Tache S., Stresul oxidative în bolile interne, Ed. Casa Cărţii de Ştiinţă, Cluj-Napoca, 2000. 18. Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin M, Mazur M, Telser J., Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2007, 39:44–84. 19. Miwa S, Beckman KB, Muller FL., Aging Medicine: Oxidative Stress in Aging, From Model Systems to Human Diseases, Humana Press, Totowa, NJ, 2008, p. 3-20. 20. Biteau B, Labarre J, Toledano MB., ATP-dependent reduction of cysteine-sulphinic acid by S. cerevisiae sulphiredoxin, Nature, 2003, 425(6961):980–984. 21. Sablina AA, Budanov AV, Ilyinskaya GV, Agapova LS, Kravchenko JE, Chumakov PM., The antioxidant function of the p53 tumor suppressor, Nat Med, 2005, 11(12):1306–13. 22. Sarkar D, Fisher PB – Molecular mechanisms of aging-associated inflammation, Cancer Letters, 236, (2006), 13–23. 23. Aurelia Nicoleta Cristea, Farmacologie generală, Ed. Didactică şi Pedagogică, Bucureşti, 1999, p.367-368. 24. Herrero-Beaumont G, Roman-Blas JA, Castaneda S, Jimenez SA., Primary osteoarthritis no longer primary: tree subsets with distinct etiological, clinical, and therapeutic caracteristics, Osteoarthritis, 2009, 39(2):71-80. 25. Aigner T, Sachse A, Gebhard PM, Roach HI – Osteoarthritis: Pathobiology – targets and ways for therapeutic intervention, Advanced Drug Delivery Reviews, 2006, 58:128-149. 26. Martel-Pelletier J, Boileau C, Pelletier JP, Roughley PJ., Cartilage in normal and osteoarthritis conditions, Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 2008, 22(2): 351-384. 27. Poole AR., An introduction to the pathophysiology of osteoarthritis, Frontiers in Bioscience, 1999, 4:662-670. 28. Hulejová H, Barešová V, Klézl Z, Polanská M, Adam M, Šenolt L., Increased level of cytokines and matrix metalloproteinases in osteoarthritic subchondral bone, Cytokine, 2007, 38:151–156. 29. Ziskoven C, Jäger M, Zilkens C, Bloch W, Brixius K, Krauspe R., Oxidative stress in secondary osteoarthritis: from cartilage destruction to clinical presentation?, Orthopedic Reviews,2010, 2:e23. 30. Rees MD, Kennett EC, Whitelock JM, Davies MJ., Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies, Free Radical Biology & Medicine, 2008, 44:1973–2001. 31. Altindag O, Erel O, Aksoy N, Selek S, Celik H, Karaoglanoglu M – Increased oxidative stress and its relation with collagen metabolism in knee osteoarthritis, Rheumatol Int, 2007, 27:339–344. 32. Fermor B, Christensen SE, Youn I, Cernanec JM, Davies CM, Weinberg JB., Oxygen, nitric oxide and articular cartilage, European Cells and Materials, 2007, 13:56-65. 33. Scher JU, Pillinger MH, Abramson SB., Nitric oxide synthases and osteoarthritis, Current Rheumatology Reports, 2007, 9:9-15.

45

34. Henrotin Y, Kurz B, Aigner T., Oxygen and reactive oxygen species in cartilage degradation: friends or foes?, OsteoArthritis and Cartilage, 2005, 13, 643-654. 35. Starodubtseva MN., Mechanical properties of cells and ageing, Ageing Res. Rev., 2011, 10(1):16-25. 36. Grishko VI, Ho R, Wilson GL, Pearsall AW., Diminished mitochondrial DNA integrity and repair capacity in OA chondrocytes, Osteoarthritis and Cartilage, 2009, 17, 107-113. 37. Chevalier X., Progrès dans l’arthrose, Revue du Rhumatisme, 2007, 74:59-64. 38. Afonso V, Champy R, Mitrovic D, Collin P, Lomri A., Reactive oxygen species and superoxide dismutases: Role in joint diseases, Joint Bone Spine, 2007, 74:324-329. 39. Pavelescu M., Medicamente anti-inflamatoare nesteroidiene (AINS) şi antireumatice specifice. În Tratat de farmacologie, cap.9, p.617-638, 2005. Sub redacţia A.N. Cristea, Ed. Medicală, Bucureşti. 40. Pelletier JP, Martell-Pelletier J, Abramson SB., Osteoarthritis, an inflammatory disease: Potential implication for the selection of new therapeutic targets, Arthritis & Rheumatism, 2001, 44(6):1237-1247. 41. Al-Waili NS, Saloom KY, Al-Waili T, Al-Waili A, Al-Waili., Modulation of Prostaglandin Activity, Part 1: Prostaglandin Inhibition in the Management of Nonrheumatologic Diseases: Immunologic and Hematologic Aspects, Advances in Therapy, 2007, 24(1):189-222. 42. Scott DL, Kingsley GH., Inflammatory Arthritis in Clinical Practice, Springer-Verlag London Limited, 2008, p.48-54. 43. Xie WL, Chipman JG, Robertson DL, Erikson RL, Simmons DL., Expression of a mitogen-responsive gene encoding prostaglandin synthase is regulated by mRNA splicing, Proc Natl Acad Sci U S A, 1991; 88: 2692–6. 44. Kujubu DA, Fletcher BS, Varnum BC, Lim RW, Herschman HR., TIS10, a phorbol ester tumor promoterinducible mRNA from Swiss 3T3 cells, encodes a novel prostaglandin synthase/cyclooxygenase homologue, J Biol Chem, 1991, 266: 12866–72. 45. Vane JR, Botting RM. Mechanism of action of anti-inflammatory drugs, Scand J Rheumatol Suppl, 1996, 102: 9–21. 46. Nijkamp FP, Parnham MJ., Principles of immunopharmacology, ediţia a 2-a, Ed. Birkhäuser Basel, 2005, p. 81-103. 47. Jones DA, Carlton DP, McIntyre TM, Zimmerman GA, Prescott SM., Molecular cloning of human prostaglandin endoperoxide synthase type II and demonstration of expression in response to cytokines. J Biol Chem, 1993, 268: 9049–54. 48. Valentin Stroescu, Bazele farmacologice ale practicii medicale, Ed. Medicală, Bucureşti, 2001, p.1093-1097. 49. *** Agenda Medicală 2006-2007, Ed. Medicală, Bucureşti, 2006, p.933-935, 958-959, 1205-1210, 1410-1412. 50. Chiriac A., Ciubotariu D., Simon Z., Relaţii cantitative structură chimică – activitate biologică (QSAR), Ed. Mirton, Timişoara, 1996. 51. Karelson M., Molecular Descriptors in QSAR/QSPR, Ed. J. Wiley & Sons, New York, 2000. 52. Lengauer T,. Rarey M., Computational methods for biomolecular docking, Curr. Opin. Struct. Biol., 1996, 6(3):402-406.

46

53. Dias R, Filgueira de Azevedo W., Molecular docking algorithms, Current Drug Targets, 2008, 9:1040-1047. 54. Jorgensen LW., Rusting of the lock and key model for protein-ligand binding, Science, 1991, 254:954-955 55. Kitchen DB, Decornez H, Furr JR, Bajorath J., Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: methods and applications, Nature reviews, Drug discovery, 2004, 3(11):935-949. 56. Simon Z., Comparative molecular field analysis. Critical comments, Rev. Roum. Chim., 1992, 37:323-325. 57. MOPAC 7.0 for UNIX, Quantum Chemistry Program Exchange. Project 688. 58. Katritzki AR, Petrukhin R, Yang H, Karelson M., Comprehensive Descriptors For Structural and Statistical Analysis Codessa Pro (reference manual), University of Florida, 2003. 59. Protein Data Bank, http://www.pdb.org/pdb/home/home.do. 60. Fiedler TJ, Fenna RE., X-ray crystal structure and characterization of halide-binding sites of human myeloperoxidase at 1.8 A resolution, J. Biol. Chem., 2000, 275:11964-11971. 61. Mathy-Hartert M, Bourgeois E, Grülke S, Deby-Dupont G, Caudron I, Deby C, Lamy M, Serteyn D., Purification of myeloperoxidase from equine polymorphonuclear leucocytes, Can. J. Vet. Res., 1998, 62(2):127-132. 62. Sidhu RS, Lee JY, Yuan C, Smith WL., Cox1: Comparison of cyclooxygenase-1 crystal structures: cross-talk between monomers comprising cyclooxygenase-1 homodimers, Biochemistry, 2010, 49(33):7069-7079. 63. Kurumbail RG, Stevens AM, Gierse JK, McDonald JJ, Stegeman RA, Pak JY, Gildehaus D, Miyashiro JM, Penning TD, Seibert K, Isakson PC, Stallings W., Cox-2: Structural basis for selective inhibition of cyclooxygenase-2 by anti-inflammatory agents, Nature, 1996, 384:644-648. 64. Ritchie D, Hex Protein Docking, http://www.csd.abdn.ac.uk/hex/ 65. Molecular Modeling Pro Plus, http://www.chemsw.com/13071.htm 66. www.arguslab.com.

cercetări farmacologice şi modele virtuale predictive asupra ...

Documents

Transcript of cercetări farmacologice şi modele virtuale predictive asupra ...