UNIVERSITATEA DE STAT DIN MOLDOVA

UNIVERSITATEA DE STAT DIN MOLDOVA

FACULTATEA DE BIOLOGIE I PEDOLOGIE

DEPARTAMENTUL DE BIOLOGIE I ECOLOGIE

Tema : Terapia cu celule stem A realizat: Hncu Valentina

An I master, stiinte biologice aplicate

A verificat: Dudnic Eugen

Doctor, conferentiar universitar

Chiinu,2015

Ce sunt celulele stem

Omul, ca organism pluricelular, este compus din multiple celule difereniate. Forma lor, capacitile, proteinele exprimate n fiecare dintre ele sunt diferite, chiar dac au la origine celula mezenchimal primordial (stem). Celulele stem este materialul din care se formeaz toate celulele mature, difereniate. Ele dau natere celulelor neurale, cardiace, pancreatice etc.

Particulariti

Ele dispun de potenialul de a nlocui celulele esutului traumat sau distrus de maladii severe. Se pot autoreplica din nou i din nou pentru timp ndelungat.

- Rediferenierea Revenirea la o etap tranzitorie anterioar, la un fenotip mai puin matur (ex. dediferenierea condrocitelor n fibroblaste la trecerea de la sistemul de cultur 3D la 2D

- Transdiferenierea (fenomen controversat) Trecerea unei celule difereniate de la un fenotip la altul, fr a trece prin etapa de dedifereniere (ex. transformarea celulelor pancreatice n hepatocite)

- Plasticitatea Abilitatea celulelor stem adulte dintr-un esut de a genera celule difereniate specifice altui tip de esut (ex. celulele stem hematopoietice pot forma, n afar de celulele sngelui, keratinocite, hepatocite, neuroni, cardiomiocite)

nelegerea cum celulele stem se dezvolt n celule sntoase sau celule bolnave va favoriza gsirea de tratamente eficiente n diverse maladii.

n perioada de dezvoltare embrionar, sub aciunea semnalelor moleculare, produse de celulele de dirijare, se alege un program genetic bine determinat, care conduce la diferenierea lor n celule specifice (neuroni, osteocite, miocite etc.) Este deja dovedit experimental c o cantitate mic de celule specializate poate compensa funcia organului lezat.

Clasificarea celulelor stem

n funcie de capacitatea lor replicativ i de potenialul de difereniere, celulele stem au fost clasificate n:

Se clasifica n funcie de sursa celulara in:

Celule stem embrionare i fetale

Celule stem adulte, sau celule stem somatice (responsabile pentru creterea, meninerea si regenerarea esuturilor diferentiate)

Se clasifica in functie de potentialul de a genera celule diferentiate in:

Totipotente

Pluripotente

Multipotente

Oligopotente si unipotente

Celule stem totipotente.

- Acestea sunt celulele din care se poate dezvolta orice tip de celule prezente n organismul uman.

- pot forma un organism ntreg (ovocitul fertilizat i celulele formate dup primele diviziuni ale zigotului) Celule stem pluripotente sunt descendente ale celulelor totipotente.

Se pot diferenia n toate tipurile celulare, cu excepia celor totipotente. Sunt capabile s formeze esuturi derivate din toate cele trei foie embrionare (endoderm, mezoderm i ectoderm). Celule pluripotente pot fi obinute nemijlocit din masa celular intern a blastocitului sau de la embrion, din regiunea de unde are loc dezvoltarea gonadelor. Tulpinile celulare obinute prin cultivarea acestor celule sunt identice, se numesc embrionare.

Dou surse pentru celule stem embrionare

Excesul de oocite fertilizate de la fertilizarea in vitro.

2. Clonarea terapeutic (transferul nuclear al celulelor somatice)

O alt metod de obinere a celulelor stem pluripotente poate fi inocularea nucleului unei celule somatice n ovul denucleat, din care se poate dezvolta un embrion. Acest procedeu se numete clonare.

Celule stem multipotente sunt acelea care produc celule dintr-o singur familie, progenitoare ale celulelor din diferite esuturi.

celulele hematopoietice, responsabile de nnoirea continu a celulelor sangvine, din care se dezvolt eritrocitele, limfocitele, leucocitele etc.

Ele au un potenial regenerativ imens i i rennoiesc continuu populaiile celulare. Ca gref poate servi mduva osoas i celulele din sngele ombilico - placentar

Celule stem oligopotente Se pot diferena numai n cteva tipuri de celule aa ca celule limfoide sau celule mieloide.

Pot forma un anumit numar de linii celulare specifice unui tesut (ex. celulele stem neurale pot forma un subset de neuroni cerebrali; celulele stem hematopoietice pot forma subseturile de celule sanguine)

Celule stem unipotente. Aceste celule pot produce un singur tip de celule, dar au proprietatea de a se rennoi, ceea ce le difereniaz de celulele non-stem.

Celulele stem sunt prezente nu numai n esuturile embrionului, dar i n cele ale nou-nscutului i ale organismului matur

Conform provinienei grefele celulare pot fi:

Autologice

Alogene

Xenogene

Syngenice sau isogenice izolate de la organisme genetic identice (gemeni, clone, animale experimentale identice genetic)

- Primare - obinute nemijlocit din organism

Secundare - obinute dintr-o Banc de grefe celulare.

Avantajele utilizrii autocelulelor din mduv osoas lipsete conflictul imun (rejetul grefei);

este redus la minim posibilitatea de contaminare a pacientului cu maladii hematotransmisibile;

metoda este binevenit din punct de vedere moral i etic.

Celulele embrionare cu informaia genetic a recipientului (clonate) pot fi considerate ca autocelule (fiind vorba despre reconstituirea embrionar prin transferul nucleului din celula somatic a individului n oocitul enucleat.)

Celule stem sunt n: periost, esutul conjunctiv muscular, mduva fetal, sange periferic, ficatul, cordonul ombilical, Placent, Amnion .Coastele i corpurile vertebrale sunt mai greu accesibile i mduva lor nu prezint o densitate celular suficient de mare pentru recoltare, n special la adult.

Celulele fetale ca i esuturile embrionare, nu au un sistem imun dezvoltat, ceea ce micoreaz probabilitatea complicaiilor dup transplantare. La acest tip de celule pot fi atribuite i celulele obinute din sngele ombilical.

Celule xenogene de psri, de animale etc. reprezint un aspect mai puin cercetat n ceea ce privete utilizarea lor n terapie. Mai frecvent ele sunt utilizate n procesul de cercetare n virusologie, bacteriologie etc.

n Republica Moldova au fost utilizate celule obinute din embrioni de pasre (gin i prepeli) i utilizate n tratamentul pacienilor cu deficiene ale aparatului locomotor.

Protocolul de producere a autogrefei din mduv osoas

prelevarea grefei;

prelucrarea grefei pentru pstrare (conservare) sau pentru obinerea celulelor progenitoare;

testarea celulelor obinute (cariotipare, teste bacteriologice, n cazul alogrefelor excluderea infeciilor);

4. conservarea i utilizarea lor.

Identificarea fenotipului celular

Citologic celulele stem din mduv osoas nu pot fi identificate vizual cu microscopul optic prin coloraii uzuale. O celul stem are forma unui limfocit cu nucleu rotund, cromatin dens i citoplasm redus. Celulele stem pot fi identificate prin prelucrarea celulelor cu anticorpi specifici lor CD 34, CD 45, CD 90, CD 113.

CD 34 este calculat pentru determinarea calitaii grefei celulare destinat transplantrii.

Grefele celulare alogene

Celulele embrionare,

Celulele fetale

Grefele din mduv osoas,

Sngele ombilical.

Transplantarea celulelor alogene hematopoietice se utilizeaz de mai mult timp n tratamentul unor maladii sangvine anemii congenitale, leucemii, unele maladii cu dereglri de metabolism, insuficien imunitar etc. O condiie dur, este corespunderea ntre sistemul HLA al recipientului i al donatorului. Din cauza polimorfismului sistemului HLA (human leukocyte antigen) au fost create bnci de celule, n care se efectueaz selectarea pacienilor i a donatorilor, ns nu ntotdeauna este posibil gsirea donatorului potrivit.

Stocurile mondiale dispun de mai mult de 145.000 de probe de SCO i deja au fost efectuate mai mult de 3.000 de grefri (n mjoritatea cazurilor n patologiile hematice). n lume exist cteva sute de bnci de SCO, repartizate aproximativ n felul urmtor: 40 % n Europa, 30 % n Statele Unite i n Canada, 20 % n Asia i 10 % n Australia. Nu exist nici o banc de acest tip n Africa. Aproximativ 75 % din aceste bnci sunt bnci publice sau private ce i propun serviciile societii, 25 % sunt bnci comerciale (Germania, Austria, Belgia, Polonia

Cantitatea de snge primit depinde de mai multi factori: greutatea ftului la natere, termenul sarcinii, lungimea cordonului ombilical, timpul secionrii lui; cantitatea lui variind de la 75 la 200 ml.

Pn la colectarea sngelui ombilical se studiiaz anamneza obstetrical i familial pentru determinarea unor afeciuni i anomalii genetice probabile, care se transmit pe cale hematogen. Fiecare gravid este testat pentru HbsAg, prezena anticorpilor hepatitei C, HIV, sifilis, citomegalovirus. n caz de reacii seropozitive, colectarea sngelui nu se efectuiaz.

Pentru depistarea unor maladii infecioase trebue testat gravida i nu sngele ombilical. Testele, de obicei, sunt bazate pe depistarea anticorpilor ctre agenii patogeni n snge, i sangelui ombilical poate avea o reacie fals-negativ, deoarece anticorpii nu trec bariera feto-placentar i nu pot fi gasii n sngele cordonului ombilical .n fiecare prob se determin cantitatea de celule CD34+, respectiv tipajul HLA, determinarea grupei de snge dupa sistemul ABO i factorului rezus. Ali autori recomand cariotiparea pentru depistarea maladiilor genetice . Lund n consideraie volumul mic de snge care poate fi colectat din vasele ombilicale, se necesit o manipulare atent, cu respectarea strict a antisepsiei, pentru a exclude riscul contaminrii bacteriene. Sngele ombilical poate fi colectat dup ce s-a clemat cordonul ombilical sau dup secionarea lui.

Cerine pentru prelevarea sngelui ombilico-placentar: 1. acordul scris al gravidei pentru prelevarea i conservarea sngelui; 2. testarea obligatorie a grefidlor la: HbsAg, antiHCV, anti-HIV, RW, anti-CMV, anti-toxoplasma gondii. Prelevarea sngelui ombilico-placentar este contraindicat: boli infecioase la mam la momentul naterii (HbsAg, Anti-HCV, Anti-HIV); naterea copilului mort sau moartea intrauterin a ftului; defecte congenitale la copil sau infecii la nou-nscut; vrsta mamei mai mic de 18 ani; termenul gestaiei mai mic de 34 sptmni.

Prelucrarea i conservarea SOP

Dup colectare, containerul cu proba de snge se cntrete, se determin numrul de eritrocite, leucocite, trombocite, se apreciaz hemoglobina i se face testarea bacteriologic. Prin intermediul citometriei de flux sunt detectate celulele CD34+. Separarea celulelor nucleate se face pentru a micora volumul grefei, care necesit a fi conservat, eliminarea eritrocitelor de asemenea scade riscul unei reacii hemolitice, incompatibilitii dup antigenii ABO i Rh n cazul transfuziei. Pstrarea de scurt durat a sngelui prelucrat pn la 72 ore, poate fi efectuat al +40C, necesitatea de pstrare pe o durat mai ndelungat (mai mult de 72 de ore) necesit crioconservarea probei n DMSO (dimetilsulfoxid), care protejeaz celulele de cristalizarea apei n citoplasmei celular. Crioconservarea se efectuiaz n cteva etape cu dispozitivul de congelare ghidat de calculator. Stocarea final se face n rezervoare cu azot lichid la o temperatur de -196 0C.

Celulele stem embrionare

Au fost izolate pentru prima data n 1981 de Evans i Kaufman Pot fi recoltate din embrion in stadiul blastomeric sau blastocitar de dezvoltare

Sunt transferate in sistem de cultur pe un strat de celule doic (fibroblaste) Coloniile celulare formate sunt periodic dezintegrate si recultivate in mediu de cultur proasptCelule stem embrionare sunt celule nediferentiate care au particularitati ce le deosebesc fundamental de celulele adulte cu functii specializate.

Capacitatea lor de diviziune este nelimitata in conditiile in care organismul caruia apartin este viu, iar din aceasta caracteristica deriva cea mai importanta functie pe care o au si pentru care sunt atat de folosite, si anume aceea de a actiona precum un sistem de refacere si reparare a oricarei parti constituente a organismului.

La fiecare diviziune a unei celule mama, apar celule fiice cu capacitatea de a ramane in stadiul decelula stem sau de a se dezvolta in celule cu functii specializate, cum ar fi celulele musculare, nervoase sau celulele sangvine.

Totusi, nu toate celulele stem poseda aceeasi capacitate de replicare sau acelasi potential de diferentiere, motiv pentru care cercetatorii le-au impartit in mai multe clase, astfel:

celule stem totipotente, din care se poate forma embrionul;

celule stem pluripotente, care sunt capabile sa genereze orice fel de tesut adult si care sunt inglobate in termenul de celule stem embrionare;

celule stem multipotente, care au proprietati de regenerare a unor tesuturi specifice, cum ar fi pielea, ficatul, tractul intestinal.

Bolile care pot fi tratate transplantand celulele generate din celulele stem embrionice umane:

Parkinson;Diabetul;

Traumatismul de coloana vertebrala;

Boala lui Purkinje;

Distrofia Musculara Duchenne;

Bolile de inima;

Pierderea auzului si a vazului.

Tratamentul unor boli de sange de natura neoplazica (canceroasa) - leucemii, limfoame, amiloidoza, mielom multiplu, hemoglobinurie paroxistica nocturna, aplazii medulare, policitemia vera, trombocitemie esentiala, etc: prin citostatice si iradiere se distrug toate celulele sangelui circulante si aflate in maduva osoasa (care le formeaza), apoi se face transplantul unor celule stem de la un donator sanatos, acestea inmultindu-se, se diferentiaza in celule formatoare de celule sanguine, care sunt sanatoase; in final, sangele bolnavului va fi inlocuit cu sangele produs de celule transplantate in maduva lui osoasa.

Celule stem adulte Sunt celulele nediferentiate (nespecializate) localizate n esuturile difereniate .Au fost descoperite cu aproximativ 50 de ani. n 1961 si 1963 apar primele publicaii care relatau prezenta a doua tipuri de celule stem n mduva hematopoietic Celule stem hematopoietice, cele din care iau nastere elementele figurate ale sangelui Celule medulare stromale (celule stem mezenchimale), o populaie heterogen de celule precursoare, care se pot diferenia n celule osoase, cartilaj, adipocite si celulele tesutului conjunctiv al mduvei hematopoietice .Pn n prezent, celule cu proprietati asemanatoare celulelor stem mezenchimale au fost descoperite n toate esuturile difereniate (cord, ficat, pancreas, creier, pulpa dentara, epiderm etc.)

Surse de celule stem adulte, usor accesibile

Mduva hematopoietic

Sngele periferic, dup mobilizarea celulelor stem din mduva hematopoietic cu ajutorul tratamentelor cu citokine (G-CSF)

Placenta i cordonul ombelical

sursa celulara productiva si uor de recoltat

esut adipos obinut prin liposucie

Caracteristicile moleculare ale celulelor stem adulte

Celulele stem se identific cu markeri de suprafa

Combinaia specific a unor markeri sau absena unor markeri stau la baza identifiicrii i purificrii unui anumit tip de celule dintr-un amestec celular

Majoritatea markerilor specifici sunt proteine membranare din categoria proteinelor CD (Claster of differeniation)

Markerul caracteristic pentru toate celulele stem hematopoietice este CD34, iar n funie de prezenta acestuia impreun cu unul sau mai muli ali markeri, definete i permite izolarea unei subpopulaii foarte pure de celule stem hematopoietice.

Celulele stem mezenhimale, spre deosebire de celulele stem hematopoietice, au ca marker specific proteina STRO-1, iar markerul CD34 este absent.

Capacitatea funcional a celulelor stem mezenchimale umane Demonstratii in vitro (culturi de celule) In vitro celulele stem mezenchimale pot genera adipocite, condrocite si procese de mineralizare specifice osului Primele celule stem mezenchimale au fost izolate de Friedenstein, n 1979, din grasime, prin centrifugarea n gradient de densitate. Doar 0,001-0,01% din celulele zolate s-au doveedit a fi cele stem . Dup o amplificare prin multiplicare in vitro, au fost obtinute culturi de celule difereniate de tipul celor adipoase, condroide i osteoide

Micromediul celulelor stem

Fiecare celul stem adult are o localizare anatomic specific n esut ni celular . Nia reprezint micromediul celular, care adpostete, protejeaz i regleaz balana dintre celulele active i cele n repaos

Nia celular determin meninerea rezervei de celule stem, diferenierea precursorilor i eliberarea celulelor difereniate .

Factorii care acioneaz asupra celulelor stem n ni sunt:

celulele asemntoare din ni i alte tipuri de celule stem

MEC Factorii reglatori solubili i cei asociai MEC

Senescena replicativ a celulelor stem

Celulele stem mezenchimale au o via replicativ mai scurt dect a celulelor stem embrionare 50- 70 diviziuni celulare

Senescena replicativ este determinat de scurtarea telomerelor - regiunea terminal a cromizomului, alctuit din terminaia repetitiv de tipul TTAGGG . La fiecare diviziune celular, se pierde o parte din secvena repetitiv, din cauz replicrii incomplete .Scurtarea treptat a telomerelor duce la alterarea progresiv a ADN i implicit la moartea celular

Imortalizarea celulelor stem

Ceulele stem embrionare exprim un nivel crescut de telomeraz, enzim care adaug secvene repetitive la captul terminal al telomerului . Majoritatea celulelor au expresie foarte mic sau chiar nedetectabil a telomerazei . Imortalizarea prin restabilirea activitii telomerazice cu hTERT (human telomerase revers trenscriptase) hTERT este subunitatea catalitic a telomerazei si poate fi introdus n celul cu ajutorul vectorilor retrovirali Tratarea celulelor stem mezenchimale cu hTERM prelungete si stabilizeaz fenotipul nedifereniat

Bibliografie

http://www.biogenis.ro/despre-celule-stem/ce-sunt-celulele-stem/http://www.umfiasi.ro/masterate/Suporturi%20de%20curs/Facultatea%20de%20Bioinginerie/Culturi%20de%20celule/MR_IT_2_tip%20si%20sursa%20celule.pdfhttp://www.prostemcell.ro/celulele-stem/ce-sunt-celulele-stem-embrionare.htmlhttp://tisular.usmf.md/wp-content/blogs.dir/171/files/sites/171/2013/06/PS-Tipurile-de-celule-stem.pdf