Funciile caspazelor

III.2.4.1.Funciile caspazelor 1, 11 i 5

Nivelul cunotinelor actuale sugereaz c extinderea clasei caspazelor la organismele superioare poate s reflecte nevoia de cretere a specializrii semnalizrii celulare n apoptoz.Studiile fcute pe oareci au furnizat informaii eseniale cu privire la structura i functile specifice a diferitelor caspaze.

Studiile oarecilor cu deficien n caspaza 1 i 11 au condus la o bun nelegere a funciilor lor specifice.Deleia caspazei 1 nu a artat efecte negative asupra dezvoltrii normale a organismului iar fibroblastele embrionare i timocitele izolate la aceti indivizi au prezentat sensibilitate maxim la diferii stimuli apoptozici.Indivizii fr caspaza 1 totui prezint diferite defecte n sinteza i secreia citokinelor inflamatorii IL-1 i IL-18 precum i rezistent la ocul septic, fapt ce este n concordant cu rolul atribuit iniial caspazei 1 de enzim procesoare a IL-1. De asemenea, din motive necunoscute i secreia (dar nu i sinteza) de IL-1 este inhibata in absena caspazei 1.Cel mai probabil caspaza 1 reprezint o inta din aval a caspazei 11.Expresia unei caspaze 1 mutante la un oarece transgenic, a inhibat secreia de IL-1 iar neuronii acestor oareci sunt parial rezisteni la moarte celular indus prin privarea de factori trofici in vitro i daune cerebrale ischemice in vivo.

Caspaza 11 murinic este foarte asemntoare cu caspaza 1.Indivizii deficieni n caspaza 11 au o dezvoltare normal dar prezint rezisten la oc endotoxic, lipsa activrii caspazei 1 i a secreiei de IL-1 dei caspaza 11 nu intervine n mod direct n procesarea pro-IL-1. Aceste date demonstreaz clar rolul crucial al caspazei 11 n activarea caspazei 1.Caspaza 11 i omoloaga sa la om, caspaza 5 formeaza un complex cu caspaza 1 i care reprezinta o etap important n procesul de mediere a activrii caspazei 1.Dar totui nu exist dovezi concrete n vivo sau in vitro care s ateste faptul c caspaza 5 sau caspaza 11 ar activa caspaza 1 n mod direct prin clivare proteolitic.n mod contrar, s-a artat c caspaza 11 activeaz caspaza 3 direct prin clivare proteolitic.

III.2.4.2.Functiile caspazei 2

Caspaza 2 dei face parte din grupul caspazelor de iniiere, aceasta prezint i o serie de caracteristici comune cu cele ale caspazelor efectoare, fiind una dintre cele mai inelatoare caspaze din aceast clas de enzime.

Aceasta prezint un prodomeniu lung, se activeaz timpuriu ca rspuns la o varietate de stimuli apoptozici precum i interaciunea sa cu Fas mediat de RAIDD sugereaz rolul su de caspaz de iniiere.Pe de alt parte ea poate fi activat de caspaze de execuie din aval precum caspaza 3, dar i preferina sa pentru substrat este de asemenea caracteristic caspazelor efectoare.

O caracteristic interesant a sa este localizarea intracelular la nivelul nucleului i a aparatului Golgi.Transferul su n nucleu este mediat de dou semnale de localizare nuclear prezente n prodomeniu.Rolul acestei rezerve nucleare de caspaz 2 nu este cunoscut.n aparatul Golgi ns aceasta are rol n fragmentarea acestui organit n timpul apoptozei prin clivarea proteinei structurale golgina-160.Prin urmare aceasta contribuie la realizarea unor fenomene apoptozice specifice organitelor.

Prin utilizarea diferitelor metode de inhibare a expresiei caspazei 2 in vitro sau evidentiat cteva roluri ale acesteia n procesul de moarte celular cum ar fi: privarea de factori neurotrofici a neuronilor simpatici, apoptoza indus de A n neuronii hipocampici i moartea celular mediat de Fas n limfocite.

Organismele private de caspaza 2 sunt totui viabile iar celulele fr caspaza 2 prezint o iniiere normal a procesului de apoptoz ca raspuns la diferii stimuli.

Singurele dereglri apoptozice observate n lipsa acestei caspaze sunt excesul de celule germinative n ovarele femelelor mutante, rezistena oocitelor la inducerea apoptozei prin substante chemoterapeutice i o mortalitate sczut a limfocitelor tratate cu granzima B.

Absena defectelor apoptozice specifice neuronilor n lipsa caspazei 2 poate fi explicat prin existena mecanismelor compensatorii n care funciile caspazei 2 pot fi preluate de caspaza 9 la neuronii simpatici cu deficien n caspaza 2.

O abordare nou care ar putea permite analiza funciilor celulare a proteinelor fr limitrile genetice impuse de eventuale declanri a compensaiilor genetice n abordrile transgenice const n utilizarea moleculelor de ARN de interferen scurte care s regleze nivelele de expresie a proteinelor endogene.Aceast metod a fost utilizat cu succes recent n cazul caspazei 2 aratnd rolul acesteia n moartea celulaa mediat de presiunea genotoxica n culturile de celule.Prin urmare ARNi (de interferen) poate ajuta la elucidarea rolului pe care caspaza 2 l are n diferite sisteme apoptozice.

Studiile efectuate pe oareci au artat c lipsa caspazei 2 poate determina existena unui numr sczut de motoneuroni faciali la natere.Acest defect poate s reflecte funcia antiapoptozic in vivo pe care o au variantele cu imbinri scurte a caspazei 2 i care anterior se dovediser c pot inhiba apoptoza in vitro (Wang et al., 1994).

n afar de activarea reelelor caspazice din aval ca de exemplu alte caspaze de iniiere, caspaza 2 poate actiona n mod primar asupra substratelor necaspazice pentru medierea morii celulare.n aceast privin s-a observat c caspaza 2 provoac n mod direct eliberarea factorilor apoptogenici din mitocondrie, proces care este mediat n parte de clivarea Bid de ctre caspaza 2.

n final se poate observa c caspaza 2 are multe proprieti distincte de alte caspaze dar exist puine date cu privire la totalitatea rolurilor pe care aceasta le are n procesul de moarte celular in vivo.

III.2.4.3.Funciile caspazelor 3, 6 i 7

Aceste 3 caspaze foarte asemntoare formeaz subclasa caspazelor efectoare.Analiza apoptozei n celulele MFC-7 crora le lipsete caspaza 3 a

artat c aceasta este indispensabil pentru activarea degradrii ADN-ului intranucleosomal mediat de CAD sau DFF40.

De asemenea oarecii cu deficien de caspaz 3 sunt mai mici dect cei normali iar majoriatea mor n faza prenatal datorit lipsei apoptozei.

Analiza morii celulare la nivelul mai multor celule izolate de la diferite specii de animale cu deficien n caspaza 3 au artat inhibiia complet a unora din caracteristicile apoptozei cum ar fi bicarea membranei, degradarea ADNului, fragmentare nuclear,etc.Experimente asupra unor sisteme apoptozice fr celule efectuate in vitro au artat c lipsa caspazei 3 a inhibat majoritatea reaciilor din aval, incluznd clivarea diferitelor substrate, fragmentarea ADN-ului, marginalizarea cromatinei,etc n timp ce eliminarea caspazelor 6 sau 7 nu a provocat nici-un efect.Acesta este o dovad c caspaza 3 este important pentru execuia anumitor evenimente din apoptoz dar nu toate.n contrast cu caspaza 3, caspazele 6 i 7 nu au funcii specializate importante.Acest lucru arat c nici una din caspazele efectoare nu deine un control total asupra execuiei tuturor aspectelor ale apoptozei.Explicaia const n faptul c caspazele de execuie ndeplinesc roluri distincte n anumite ci cum este rolul caspazei 7 n calea R.E. dar n acelai timp ele au i roluri majore n evenimentele apoptozice generale astfel ncat ar fi necesar eliminarea a toate trei pentru a se putea observa o inhibiie total a proceselor apoptozice.

Dintre caspazele efectoare caspaza 3 joac un rol principal datorita abundenei mecanismelor compensatorii existente care intr n funciune n cazul lipsei caspazei "primare", permiand astfel evenimentelor succesive s aib loc.

Asemenea mecanisme compensatorii sunt numeroase i sunt prezente pentru majoritatea caspazelor:

activitatea caspazei 3 poate fi preluat de caspaza 8

inactivarea caspazei 9 poate duce la inactivarea caspazei 3 i 6 dar nu i a caspazei 7

caspaza 9 poate inlocui caspaza 2

deleia caspazelor 3 i 9 duce la activarea compensatorie a caspazelor 7 i 6, etc.

III.2.4.4.Funiile caspazei 8

Proprietile caspazei 8 sunt foarte bine caracterizate iar rolul su de vrf n moartea celular a fost bine stabilit prin studii de biochimie i de biologie celular.De exemplu celulele de Jurkat cu deficien de caspaz 8 sunt complet rezistente la apoptoza indus de Fas i TRAIL-R2 i parial rezistente la apoptoza indus de TNF.Inactivarea caspazei 8 n celulele de Jurkat e posibil s nu previn moartea celular indus de receptori ai morii dar poate schimba balana ctre ci neapoptozice de moarte celular programat (Kawahara et al., 1998; Holler et al., 2000; Matsumura et al., 2000).

La oareci deficiena de caspaz 8 produce moartea n a 11-a zi embrionar prezentnd o dezvoltare incomplet a muchilor cardiaci i hemoragie abdominal.De asemenea oarecii cu deficien de FADD prezint fenotip asemntor ceea ce sugereaza c cile de semnalizare a receptorilor morii au un rol esenial n dezvoltarea musculaturii inimii i n hematopoeza.Deficiena de FADD mai blocheaz i activarea celulelor T i dezvoltarea celulelor B dar studii asemntoare nu au fost posibile n cazul caspazei 8 datorit letalitii embrionare timpurie.La oameni a fost descoperit o deficien de caspaza 8 la persoane cu sindrom imunodeficitar.Indivizii cu mutaii homozigote ale caspazei 8 nu prezentau doar defecte ale apoptozei limfocitare, caracteristic sindromului autoimun limfoproliferativ dar i defecte n activarea celulelor T i B ceea ce duce la imuno deficien.

Toate acestea sugereaz dublul rol al caspazei 8 n reglri pozitive i negative a rspunsului imun in vivo.

Activarea caspazei 8 este realizat de caspaze din aval ca de ex. caspaza 6

printr-o bucl de feedback pozitiv (Cowling and Downward, 2002). De asemenea n cazul deficienei n caspaza 3, funciile acesteia pot fi preluate de ctre caspaza 8, artnd astfel multiplele roluri pe care aceasta le indeplinete n celul n adiie cu funciile sale apoptozice.

III.2.4.5.Funciile caspazei 9

Caspaza 9 este un important amplificator intracelular al semnalului apoptozic de dup etapa mitocondrial.Deficiea n caspaza 9 are ca rezultat mortalitatea embrionar i neonatal cu debutul anomaliilor n ziua a 12-a embrionar (Hake m et al., 1998; Kuida et al.,1998).

Embrionii deficieni n caspaza 9 prezint un cerebel hipertrofiat i malformat datorit deficienei activrii apoptozei i a caspazei 3.nc nu s-a stabilit cu certitudine dac cauza letalitii indivizilor cu deficien de caspaza 9 este ntr-adevr datorat apoptozei defectuoase sau a vreunei alte funcii neapoptozice necunoscute a acestei enzime.

De asemenea numeroase tipuri de celule deficiente n caspaza 9 cum ar fi timocitele, celulele stem embrionare i splenocitele prezint apoptoz deficient ca rspuns la o serie de stimuli (raze gamma, radiaii ultraviolete, droguri citotoxice, dexametazona, etc.) n timp ce cile receptorilor morii sunt neafectate.Indivizii cu deficien de Apaf-1 prezint simptome asemntoare ceea ce confirm faptul c caspaza 9 i Apaf-1 fac parte din aceeai cale. ntreruperea semnalului caspazei 9 sau a Apaf-1 are ca efect activarea mecanismului apoptozic independent al apoptosomului i deci utilizarea de ctre celul a unor mecanisme necaspazice de executie a procesului de moarte celular,fapt ce atest importana acestei enzime n apoptoz.

III.2.4.6.Funciile caspazei 10

Caspaza 10 este foarte asemnatoare cu caspaza 8 i este de asemenea activat de ctre receptori ai morii.S-a observat c mutaii ale caspazei 10 umane sunt asociate din punct de vedere genetic cu sindromul autoimun ALPS, tipul II caracterizat prin homeostazie anormal a limfocitelor i a

celulelor dendritice cauzat de semnalizarea defectuoas a FasL/Fas.Deoarece asemenea alele mutante ale caspazei 10 codific proteine cu activitate enzimatic scazut, caspaza 10 probabil c ndeplinete un rol important n semnalizarea apoptozei la nivelul receptorilor cel puin n anumite celule in vivo, dei pn n prezent studiile in vitro nu au confirmat acest lucru.Caspaza 10 are efect inhibitor asupra tumorilor, observandu-se numeroase mutaii ale acestei enzime n anumite tumori.

III.2.4.7.Funciile caspazei 12

Rolul i funciile sale sunt foarte puin cunoscute.Este localizat la nivelul reticulului endoplasmatic, un lucru unic printre caspaze.Dezvoltarea indivizilor deficieni n caspaza 12 este normal dar absena acesteia confer celulelor rezisten la inducerea morii celulare la nivelul reticulului endoplasmatic att in vivo ct i in vitro.Aceasta atest faptul c caspaza 12 este un senzor specific al perturbrii R.E.Citotoxicitatea este de asemenea atenuat la nivelul neuronilor corticali deficieni n caspaza 12, artnd rolul R.E. n boala Alzheimer (Nakagawa et al.,2000).

n ceea ce privete activarea sa, pn acum s-au propus caspaza 7 i calpaina ca avnd acest rol n timp ce caspaza 12 se presupune c catalizeaz activarea caspazei 9 independent de citocromul c.

O caspaz uman codificat n clusterul cromosomal 11q23 i care prezint o mare asemnare cu caspaza 12 se consider c ar fi omoloaga uman a acesteia.Dei ARNm a acestei caspaze este exprimat,regiunea de codificare a acumulat mutaii n anumite populaii umane.Se vehiculeaz posibilitatea preluarii functilor sale de o alt caspaz.

III.2.4.8.Funciile caspazei 14

Aceasta nu are nici un rol n procesul de moarte celular.Se gsese doar n epitelii simple i complexe, spre deosebire de celelalte care sunt rspndite n tot organismul.Cercetrile au artat c caspaza 14 este indus transcripional la sfritul diferenierii keratinocitelor dar i datorit unei densiti mari a celulelor precum i datorit desprinderii din matrixul extracelular.Toate

studiile efectuate pn n prezent au artat c funciile sale nu au nici o legtur cu apoptoza.