UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului Domeniul de licen: Inginerie Chimic Programul de studii universitare de masterat METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C.

L2 Cromatografia de Excluziune Sterica

Metodele cromatografie de permeaie pe gel i cromatografia de excluziune steric au fost

dezvoltate ca variante ale cromatografiei n faz lichid, ambele metode cptnd n ultima perioad o

importan deosebit ca metode de studiu a polidispersitii polimerilor i de determinare a curbelor de

distribuie molecular.

1. Masa molecular medie numeric (aritmetic ), definit prin relaia (1):

== ii

i

iin Mnn

MnM (1),

n care ni este fracia numeric a macromoleculelor de mas Mi;

Masa molecular medie gravimetric (ponderat), definit prin relaia (2):

== ii

ii

iiw MwMn

MnM

2

(2),

n care wi este fracia ponderat a moleculelor de mas Mi;

n

w

MM

IPD = (3)

merMMGP = (4).

Principiul metodei. Cromatografia pe gel permeabil i cea de excluziune steric au la baz

fenomenele care apar la trecerea soluiei unui polimer polidispers printr-un strat de umplutur cu pori de

anumite dimensiuni, n pori fiind reinute macromoleculele de dimensiuni adecvate (mai mici dect

diametrul mediu al porilor) iar cele de dimensiuni mai mari ies din coloan odat cu solventul - figura 1.

Detecia poate fi realizat cu ajutorul unui detector de tip UV-VIS, RI, fluorescen sau

conductometric. n cazul ambelor tipuri de metode, mecanismul principal de reinere este acela de

excluziunea steric, dar n cazul cromatografiei de permeaie pe gel, n literatura de specialitate se

menioneaz faptul c, concomitent cu reinerea steric (datorat dimensiunilor macromoleculelor) au loc

i interaciuni de natur electric, mai ales pentru c n general cromatografia pe gel permeabil este

practicat cu utilizarea unor soluii apoase ale unor acizi, baze, sruri sau soluii tampon de diferite trii

ionice.

1

UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului Domeniul de licen: Inginerie Chimic Programul de studii universitare de masterat METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C.

Figura 1. Ilustrarea principiului de separare a polimerilor prin CPG i CES

http://www.separations.eu.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/ByMode/SizeExclusion/

http://www.viscotek.com/the-gpc-sep.htm

http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/protein_purification~gel_filtration#

http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/SizeExclusion/Organic

SolublePolymers/Hhr/TSKgelGMHhr-Mmixedbed.htm

http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/protein_purification~gel_filtrat

n cazul cromatografiei de excluziune steric reinerea are loc pur datorit excluziunii sterice,

aceasta fiind practicat cu utilizarea unor solveni aprotici: dioxan, tetrahidrofuran etc..

Sistem de injecie

Rezervor solvent de

eluie (faz mobil)

Sistem de detecie

Colector de fraciuni

2

UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului Domeniul de licen: Inginerie Chimic Programul de studii universitare de masterat METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C.

Figura 2. Componena unui sistem de CPG sau CES

Cu ct dimensiunea particulelor este mai redus cu att va fi necesar un volum mai mare de

solvent pentru eluia de pe coloan numit i volum de retenie VR. Curba tipic sau de distribuie a

polimerilor obinut prin CPG sau CES se caracterizeaz prin: volumul de eluent care a trecut prin

coloan din momentul injectrii probei (VR) i lrgimea curbei msurat la jumtatea ei W1/2.

Factorii care influeneaz separarea prin cromatografie pe gel permeabil i respectiv forma curbei

obinute sunt: natura i caracterisiticile fazei staionare, natura polimerului, caracteristicile fazei mobile i

condiiile de operare.

Natura i caracterisiticile fazei staionare joac un rol important n obinerea unor

cromatograme corespunztoare, n principal prin mrimea i distribuia porilor, aspecte care dicteaz i

intervalul de separare. n plus faza staionar trebuie s fie stabil i s i menin stabile proprietile pe

o durat ct mai ridicat de timp, s nu interacioneze cu faza mobil sau cu componenii probei.

Natura polimerului. n condiiile n care dimensiunile porilor fazei staionare rmn

neschimbate (constante) cu ct dimensiunea macromoleculelor este mai redus cu att va fi necesar un

volum mai mare de solvent pentru eluia de pe coloan numit i volum de retenie VR. Volumul de

retenie variaz liniar i cu concentraia polimerului. Caracteristicile fazei mobile determin volumul

hidrodinamic al macromoleculelor n timp ce condiiile de operare determin n unele cazuri limea

cromatogramei.

Etalonarea coloanelor de cromatografie pe gel permeabil/excluziune steric. Cromatografia

pe gel permeabil/excluziune steric nu este o metod absolut (este realativ), fiind necesar calibrararea

(etalonarea) cu etaloane de mas molecular cunoscut. Procedeul uzual implic utilizarea unor soluii de

polimeri cu mas molecular cunoscut i distribuie ngust IPD=1, n domeniul de mase moleculare de

interes. Practic, calibrarea implic trasarea unei drepte lgM=f(VRi). Determinarea volumelor VRi de eluie

se realizeaz prin injecia n coloan a unor polimeri sau amestecuri de polimeri de mas cunoscut.

Deoarece materialul de umplutur utilizat este unul poros pentru nceput este necesar

determinarea volumul liber al sistemului V0 = V0P (volumului liber al porilor) V0t(care se adaug i

volumul este necesar introducerea unei corecii prin raportarea volumelor de eluie VRi la volumul V0. n

acest caz, ecuaia dreptei de etalonare va fi o funcie lgM=f(VRi/V0). Pentru determinarea V0 este necesar

s se realizeze o eluie a unui compus (polimer) cu masa molecular peste limita superioar de separare a

umpluturii coloanei.

3

UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului Domeniul de licen: Inginerie Chimic Programul de studii universitare de masterat METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C.

Figura 3. Cromatograma HPSEC GPC a unui amestec de proteine

Determinarea distribuie de mas molecular prin cromatografie de excluziune steric de nalt

performan (high performance size exclusion chromatography) necesit, de cele mai multe ori n cazul

polimerilor naturali modificarea chimic a probei prin derivatizare.

Modul de lucru

Se pornete sistemul de cromatografie HPSEC i se ateapt o perioad de cel puin 30 minute

pentru stabilizarea acestuia. Eluentul utilizat n cazul de fa este tetrahidrofuranul (THF) Se utilizeaz o

coloan cu umplutur din polistiren-divinil-benzen (domeniu de separare 103-105 ) nseriate. Deoarece n

cazul polimerilor naturali (lignina) n structura acestor regsim un numr mare de grupe hidroxilice este

necesar blocarea acestora prin modificare chimic. Scopul modificrilor este reducerea sau nlturarea

complet a interaciunilor dintre grupelor funcionale prezente n structura polimerilor naturali (grupele -

OH) i umplutura din care este realizat coloana. Un efect secundar pozitiv al derivatizrii este creterea

solubilitii n solveni organici aprotici. Principalele metode de derivatizare: acetilarea, metilarea,

sililarea.

Trasarea curbei de etalonare-exemplu

Se traseaz curba log M = f (Ve) utiliznd datele din cromatograma de mai jos i tabelul 2.

Pentru etalonarea coloanelor de HP SEC se utilizeaz un amestec de polimeri (standard), de mase

moleculare cunoscute, la alegerea cruia trebuie s se in seama de domeniul de separare al coloanei. Se

reprezint grafic distribuia da mas molecular n coordonate Abs (prob) funcie de lg.

Se realizeaz calculul masei moleculare medii Mw sau Mn se poate, prin integrarerea curbei de

distribuie i nsumarea valorilor fiMwi.

4

UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului Domeniul de licen: Inginerie Chimic Programul de studii universitare de masterat METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C.

n cazul sistemului de CPG se utilizeaz standarde (etaloane) de polistiren-sulfonat de sodiu cu

mase cuprinse n intervalul 1000- 100000 Da. Valorile Mw, Mp i Mw/Mn sunt prezentate n tabelul 1.

3 4 5 6 7 8 90.00

0.05

0.10

0.15

0.20

4.312

5.12667

5.93867

6.87267Ab

sorb

ata

Volum de elutie, mL

PSS3_B Base1_basey

Tabel 2 Valorile obinute pentru standardul utilizat pentru calibrare

Mp Mw Mn IPD Lg Mp

Lg MW

Lg Mn

Ve (mL)

te

5

UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului Domeniul de licen: Inginerie Chimic Programul de studii universitare de masterat METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C.

6