CAPITOLUL 16MONITORIZAREA TERATOGENITĂŢII ŞI REPRODUCERII IN VITRO

16.1. Introducere

Metodele standard in vivo pentru screening-ul substanţelor care sunt potenţial

toxice pentru făt (a se vedea capitolul 9) sunt laborioase, costisitoare şi necesită o

planificare preliminară extinsă a experimentelor pentru a determina obiectivul final

corect în sitemul de reproducere.

Multe produse chimice determină o varietate de anomalii pre- şi post-natale şi

de asemenea interferă cu împerecherea şi concepţia. Substanţele chimice care induc

malformaţii structurale, disfuncţii fiziologice, modificări de comportament şi

deficienţe la produşii de concepţie, la naştere sau în perioada imediată post-natală

sunt denumite ca teratogene. Cele mai multe produse chimice nu sunt îndeajuns

examinate pentru potenţialul lor teratogen, în principal din cauza numeroaselor teste

de toxicitate care sunt necesare. Astfel, majoritatea companiilor farmaceutice şi

chimice nu testează de rutină medicamentele terapeutice şi respectiv, substanţele

chimice industriale pentru embriotoxicitatea potenţială în timpul fazelor preclinice.

Substanţe chimice care nu sunt destinate a fi utilizate clinic, nu sunt în general supuse

unor teste teratogene. Aceasta înseamnă că nu avem date embriotoxice pentru

majoritatea substanţelor utilizate pe piaţă. Prin urmare, există o presiune

semnificativă asupra agenţiilor de reglementare de a accepta modele, cum ar fi

cultura completă de embrioni descrisă mai jos ca sistem de screening pentru evaluări

de siguranţă. Un efort susţinut în dezvoltarea acestora şi a altor metode in vitro în

instrumente standardizate, validate ştiinţific pentru dezvoltarea toxicologică este

importantă şi esenţială. Dezvoltarea metodologică a acestor tehnici de cultură este

descrisă în subcapitolele următoare.

Metodele clasice pentru testarea substanţelor teratogene utilizează rozătoare şi

iepuri, în principal din cauza perioadei lor relativ scurte de gestaţie (21 - 22 şi

1

respectiv 32 de zile). În funcţie de obiectivul experimental, procedurile implică

expunerea femelei la un teratogen potenţial, fie înainte de împerechere, după

concepţie, în timpul gestaţiei sau în perioada imediat post-natală. Alternativ, masculii

sunt expuşi la substanţe chimice în cazul în care obiectivul specific este de a

determina influenţa unui agent chimic asupra capacităţii de reproducere masculină.

Astfel, începutul secvenţei de expunere depinde de problemele toxicologice

care ne interesează. De asemenea, trimestrul în cursul căruia agentul chimic are

efectele toxice cele mai mari este determinat prin expunerea animalelor gravide în

timpul unui anumit moment al perioadei de gestaţie. Utilizarea acestui protocol ne

oferă răspunsuri asupra mecanismelor de acţiune.

Rozătoarele şi iepurii sunt frecvent utilizaţi, din cauza numărului mare al

puiilor, care este de obicei, de aproximativ 8 - 10 embrioni la un animal gravid. Acest

lucru permite utilizarea produselor chimice în funcţie de numărul de fetuşi afectaţi.

De exemplu, în fiecare embrion este evaluat un anumit indicator, valoarea minimă

acceptată a acestuia este privită ca toxică. Cu cât este mai mare numărul de embrioni

care prezintă toxicitate pe baza acestor criterii, cu atât mai ridicat este scorul şi

agentul chimic este mai toxic. Având în vedere numărul potenţial de substanţe

chimice care pot fi analizate la diferite niveluri de dozare pentru diverşi indicatori la

fiecare fetus, numărul de experimente poate fi obositor din punct de vedere tehnic şi

destul de costisitor financiar.

16.2. Metode alternative pentru testarea embriotoxicităţii

Metodele alternative de testare a embriotoxicităţii şi toxicologiei dezvoltării

sunt împărţite în trei tipuri de sisteme: (1) culturi complete de embrioni (WECs), (2),

culturi celulare şi (3) culturi de organe. Metodele de culturi embrionare şi culturi de

organe se bucură de avantajele cunoaşterii mecanismelor dezvoltării şi au ca

obiective o bună cunoaştere a organogenezei şi morfogenezei. Cu toate acestea,

metodele sunt laborioase şi se bazează pe utilizarea animalelor. În contrast, în timp ce

culturile primare şi continue sunt relativ uşor de realizat şi depind puţin sau deloc de

utilizarea animalelor, acestea sunt mai simple din punct de vedere mecanicist. Astfel,

2

nivelurile mai joase de sensibilitate nu pot fi suficiente pentru detectarea teratogenilor

potenţiali care sunt mai susceptibili de a fi descoperiţi prin metode de culturi

complete embrionare. Tabelul 16.1 rezumă avantajele şi dezavantajele celor trei

sisteme care sunt în continuare discutate de mai jos (Piersma, 2004).

Tabelul 16.1 Avantajele şi dezavantajele metodelor alternative pentru testarea embriotoxicităţii

Metoda Avantaje Dezavantaje

Cultura completă de embrioni (WEC)

Mecanicistic mai complex; mai sensibil la detectarea potenţialului teratogen; mimarea diferitelor perioade gestaţionale

Necesită un număr semnificativ de animale; laborioasă, costi-sitoare; concentraţia serului influenţează rezultatele; perioadă limitată de embriogeneză în cultură

Cultura de organe Mecanicistic nu la fel de complexă ca WEC; sensibilă pentru detectarea teratogenilor potenţiali, mimarea diferitelor perioade de gestaţie; detectarea toxicităţii organ specifice

Necesită mai puţine animale decât metodele WEC; costisitoare şi laborioasă

Culturi celulare primare şi continue

Tehnic mai uşoară; necesită câteva animale; contribuie la înţelegerea toxicităţii mecaniciste

Sistem biologic simplificat; mai puţin sensibil la efectele embriotoxice; lipsit de capacitatea de biotransformare

16.2.1. Culturi embrionare complete

Cultura embrionară post-implantare este o metodă clasică pentru detectarea

agenţilor embriotoxici potenţiali. Tehnica presupune prelevarea embrionilor de

rozătoare de 1 - sau de 2 săptămâni vechime, după care aceştia sunt aclimatizaţi în

condiţii de culturi de celule pentru mai multe ore. Fetuşii viabili sunt apoi expuşi la

diferite concentraţii de substanţe chimice suspectate de a modifica statusul de

dezvoltare. Metoda este spectaculoasă: modificările structurale apar rapid şi

teratogenitatea este monitorizată macroscopic in vitro evidenţiind progrese în

creştere, dezvoltare şi diferenţiere (Flick, Klug, 2006).

Beneficiul potenţialal metodei este acela că permite investigaţii suplimentare

ale substanţelor cu activităţi teratogene in vivo. În plus, culturile embrionare in vitro,

oferă posibilitatea de a studia acţiunile directe ale teratogenilor care nu depind de

influenţele maternale neuroendocrine, imunologice şi metabolice, avantaj care este

privit ca un dezavantaj în afara domeniului tehnologiei de culturi celulare. În plus,

3

retardul de creştere legat de doza şi frecvenţa malformaţiilor utilizând culturi de

embrioni întregi depinde de asemenea de perioadele de gestaţie ale embrionilor

explantaţi.

Deşi procedura utilizează creşterea în cultură ca o componentă a protocolului şi

metodele de cultivare completă a embrionilor de şoareci in vitro s-au îmbunătăţit în

mare măsură, în ultimele două decenii, tehnica nu ar trebui să fie confundată cu

metodele de culturi celulare in vitro. Culturile de embrioni necesită încă o pregătire

laborioasă pe numeroase animale şi sacrificarea acestora, dar oferă câteva avantaje

pentru studii de prescreening pe scară mare.

Cu toate acestea, tehnologia permite embrionilor să se dezvolte rapid aproape

de ceea ce este realizat in vivo, de la gastrulaţie la stadiile timpurii ale organogenezei,

în timp ce se are loc acţiunea agentului chimic şi micro-manipularea embrionilor. În

cele din urmă, procedurile implicând pre-implantarea şi post-implantarea precoce a

embrionilor în timpul organogenezei (descrise de mai jos) nu pot fi adecvate pentru

screening-ul substanţelor chimice care au potenţial teratogen pentru că ele

monitorizează procese celulare singulare care nu reflectă caracterul complex al

dezvoltării embrionare.

16.2.2. Metode de culturi celulare din ţesut embrionar

Din cauza problemelor asociate cu testarea tradiţională a embriotoxicităţii, au

fost făcute eforturi pentru a se dezvolta teste de teratogenitate bazate pe culturi de

celule in vitro.

O condiţie prealabilă pentru utilizarea de ţesut embrionar în culturi este ca

organele sau celulele izolate să fie menţinute în cultură timp de cel puţin 48 - 72 ore.

Mai multe metode care încorporează celule sau organe izolate sunt utilizate, ca de

exemplu în metoda "micromass". Tehnica este descrisă pentru cultura de celule

rudimentare disociate din braţul şi piciorul rozătoarelor, care sunt capabile să

sintetizeze o varietate de proteine ale matricei extracelulare. Producţia de proteine

este inhibată de cele mai cunoscute produse chimice teratogene şi măsurată prin

4

analize spectrofotometrice clasice sau prin încorporarea de aminoacizi marcaţi

radioactiv.

16.2.2.1 Tehnici de pre-implantare

De la prima descriere a culturii de embrioni de pre-implantare de către Brachet,

metoda şi-a arătat importanţa sa în experimentale de embriologie şi biologie a

reproducerii. Tehnica este descrisă pentru cultura de pre-implantare embrionară de

şoareci, iepuri şi oameni. În general, embrionii de 3 până la 6 zile (a 4-a zi morulă şi

a 6-a zi blastociste) sunt transferate din animale mature sexual cu superovulaţie (la

care s-a stimulat ovulaţia) şi transplantate în vase de cultură care conţin mediu

suplimentat ser-albumină bovină, ser sau mediu fără ser (Barile, 2008).

Culturile sunt expuse la substanţa de testat, examinate histologic şi

monitorizate pentru creştere şi proliferare folosind proceduri biochimice. Însă, odată

cu apariţia tehnologiei de celule stem embrionare, interesul pentru această procedură

începe să scadă.

16.2.2.2. Culturi de celule continue

Liniile celulare continue limitate/nemuritoare sunt utilizate pentru

monitorizarea teratogenităţii in vitro.

Mai multe studii atestă acum importanţa acestor linii de celule pentru

screening-ul unei varietăţi de produse chimice în vederea testării potenţialului lor

teratogen. Liniile celulare includ celule embrionare umane diferenţiate precoce

(fibroblaste pulmonare de la fetuşi umani HFL1, MRC-5 şi WI38), provenite de la

fetuşi din primul trimestru, exact din perioada de gestaţie în care embrionul este cel

mai sensibil la anomalii de dezvoltare.

Fibroblastele sunt uşor de menţinut în cultura continuă, au durata de viaţă

limitată şi sunt bine caracterizate în studiile despre îmbătrânire. Totuşi este important

de remarcat, că aceste linii celulare continue pot să nu fie modele de culturi celulare

potrivite pentru screening-ul produselor chimice cu toxicitate potenţială în

dezvoltarea fetală pentru că liniile se formează după stadiul de cultură primară. În

5

consecinţă, răspunsurile lor pot reflecta mai degrabă citotoxicitate bazală decât un

anumit efect asupra fetuşilor în creştere.

16.2.2.3. Celule stem embrionare (ES)

Celulele ES sunt derivate din celule pluripotente de embrioni timpurii de

mamifere şi sunt capabile de proliferare nelimitată, nediferenţiată in vitro. În himerele

cu embrioni intacţi, celule ES contribuie la geneza mai multor ţesuturi adulte,

inclusiv celule germinale, oferind o cale de acces importantă pentru apariţia unor

modificări genetice specifice în linia celulară de şoarece. Pluripotenţa permite

celulelor capabile să se diferenţieze în multe tipuri şi ţesuturi, inclusiv în cele trei

straturi germinale embrionare. În plus, sunt disponibile dovezi experimentale pentru

organogeneza celulelor stem embrionare şi adulte în linii neuronale, musculare,

cutanate, epiteliale şi linii de măduvă osoasă (Bremer, Hartung, 2004).

Progresul în domeniul celulelor ES este eficient, deoarece permite înţelegerea

faptului că in vivo celulele epiteliale, epidermale şi mezodermale sunt supuse

reînnoirii în mod continuu pe baza celulelor stem multipotente care rămân ancorate

de membrana bazală. Astfel, o singură celulă stem migrează, se diferenţiază şi

realizează toate liniile celulare descendente.

Studiul celulelor stem embrionare a început modest în anii 1960, cu

manipularea morulelor timpurii şi a blastocistelor de iepure şi şoarece care au aderat

uşor la vasele de culturi celulare din plastic. S-a observat apariţia unor straturi de

celule care erau mult crescute, cu originea în masa interioară de celulele stem.

Culturile complete de blastociste pe suprafaţa acoperită de colagen au produs

agregate celulare care în cele din urmă au migrat şi s-au diferenţiat în tipuri celulare

neuronale, sangvine şi fagocitare. Până când nu a fost eliberată şi cultivată complet

toată masa celulară interioară, comunitatea de cercetare nu a realizat că celulele

embrionare au avut rate bune de clivaj ceea ce ar putea demonstra stabilitate

morfologică şi cromozomială. La şoareci, formaţiunile agregatelor celulare cu

caracteristici de diferenţiere intermediare sunt cunoscute sub numele de corpi

embrioizi (EBs). Markerii pentru diferenţierea pluripotenţei dezvăluie modul în care

6

tipurile de celule neuronale, cardiace, hematologice precum şi altele sunt derivate in

vitro (Genschow şi colab., 2004).

Derivarea celulelor umane ES este un fenomen relativ recent (sfârşitul anilor

1990) şi aceste celule au utilitate clinică din cauza colonizarii lor rapide şi

potenţialului care le permite să dezvolte ţesuturi ţintă prin intermediul căilor fetale.

Astfel, celulele umane ES oferă un potenţial terapeutic larg pentru aplicaţii clinice,

realizarea acestora fiind o chestiune de timp.

Prima descriere a unui test de celule stem ca un test in vitro imaginat pentru a

urmări potenţialul teratogenic schiţează o metodă pentru menţinerea celulelor ES de

şoarece în cultură într-un stadiu nediferenţiat sau diferenţiat. Manipularea condiţiilor

de cultură a permis stabilizarea unei populaţii de celule diferenţiate pe care produsele

chimice ar putea fi testate, fără a fi necesară în mod continuu înfiinţarea de culturi

primare din embrionii de şoarece (Riecke, Stahlmann, 2000).

Mai târziu, testul de celule stem embrionare (EST) a fost utilizat pentru a

detecta potenţialul teratogenic al câtorva compuşi în celulele nediferenţiate. În 2004,

ZEBET, în cooperare cu Centrul European pentru Validarea Metodelor Alternative

(ECVAM), a coordonat pre-validarea şi validarea studiilor cu trei teste de

embriotoxicitate, inclusiv EST. Studiile au ajuns la concluzia existenţei unei corelaţii

între datele EST in vitro şi in vivo şi au stabilit că EST poate fi utilizat pentru

testarea unui grup divers de produse chimice cu diferite potenţiale embriotoxice.

16.2.3. Culturi de organe

O varietate de modele de culturi de organe au fost dezvoltate ca sisteme de

testare toxicologică pentru reproducere şi dezvoltare. Principiile acestor modele sunt

axate pe îmbunătăţirea metodelor alternative in vitro, care ar putea să prezinte

procesul complex al embriogenezei in vivo.

Cu toate acestea, metodele necesită ţesut primar de la animale şi au

caracteristici tehnice specifice, care le fac mai laborioase şi mult mai dificil de

standardizat între laboratoare. Testele din acest grup includ modele organotipice

7

pentru mugurii membrelor, degete, procese palatine laterale, plămâni, intestine şi

organe de reproducere masculine şi feminine.

Organele fetale au fost menţinute în stadiu de culturi de celule primare prin

recoltarea lor şi acoperirea parţială sau totală a ţesuturilor în mediu de cultură. Un

explant de ţesut este plasat pe un microfiltru sau în vase de cultură din plastic pentru

ţesuturi acoperite cu componente ale matricei extracelulare. Această abordare este

utilă în cultura din mugurii membrelor de la mai multe specii de animale în mediu

suplimentat cu ser sau cu compoziţie chimică definită. Dezvoltarea morfologică,

diferenţierea şi parametrii biochimici sunt monitorizaţi. Diferitele culturi primare

organotipice izolate cu succes includ:

1. culturi de rinichi de şoareci pentru studiile de dezvoltare renală şi agenţi

nefrotoxici suspecţi,

2. mugurii membrelor pentru detectarea anomaliilor chimice de dezvoltare,

3. structuri gastro-intestinale pentru potenţialii teratogeni implicaţi în

dezvoltarea stomacului şi intestinului,

4. culturi de testicule şi ovare pentru studii de reproducere,

5. izolarea celulelor epiteliale de tip II din plămân fetal de şobolan.

Celulele epiteliale pulmonare de şobolan reprezintă celule specializate capabile

de sinteză şi stocare a unui surfactant compus din fosfolipide; secreţia sa este

destinată pentru spaţiul alveolar pulmonar.

In vivo, surfactantul acoperă pereţii alveolari şi reduce tensiunea superficială

prezentă la interfaţa aer-celule şi, astfel permite oxigenului să penetreze structurile

alveolare subţiri.

În consecinţă, celulele sunt utilizate în teste de toxicitate pentru a monitoriza

efectele embriotoxice în plămâni, în special în ceea ce priveşte producţia şi secreţia

de surfactant. Astfel, ca şi în alte culturi primare organ specifice, avantajul lor constă

în capacitatea acestora de a acţiona ca modele pentru detectarea toxicităţii organului

ţintă. Studiile de validare inter-laboratoare implicând modele alternative organotipice

de mamifere, pune la dispoziţia comunităţii toxicologice o varietate de metode pentru

8

includerea lor într-o baterie de teste în vederea testării substanţelor chimice cu

potenţial embriotoxic.

16.3. Validarea metodelor alternative pentru studii de reproducere şi teratogenitate

Validarea sistemelor alternative de testare se bazează pe comparaţia

sensibilităţii, specificităţii şi concordanţei cu studii documentate in vivo. Deoarece

numai acele substanţe chimice pentru care sunt disponibile suficiente date in vivo

sunt utilizate pentru comparaţii de toxicitate a dezvoltării, încercările de validare in

vitro vor fi limitate de numărul substanţelor chimice de testare disponibile.

În plus, cei mai relevanţi compuşi pentru evaluarea pericolului sunt cei a căror

toxicitate pentru dezvoltare este în interiorul gamei toxice marginale şi în mod clar nu

la extreme toxice sau capete non-toxice. Astfel, capacitatea metodelor de screening

in vitro, pentru estimarea teratogenilor potenţiali nu este îngreunată de dezvoltarea

metodelor de testare, ci de lipsa de informaţii comparative adecvate in vivo.

În scopul standardizării metodologiilor şi definirii obiectivelor pentru analize

in vitro, ECVAM a definit un model predictiv de abordare care încearcă să

extrapoleze datele obţinute in vitro la studiile in vivo.

Modelul de predicţie conţine obiective cantitative, care se aşteptă că vor

anticipa răspunsurile in vivo. Rezultatelor proiectului evaluează performanţa unui test

şi sunt modificate atunci când baza de date a substanţelor chimice testate în sistemul

in vitro este suficientă, mai ales atunci când sunt efectuate cu ajutorul unor clase

necunoscute de substanţe chimice.

În prezent cel mai elaborat studiu de validare al testelor de embriotoxicitate

efectuat a fost finanţat de către ECVAM şi include EST, micromasa mugurilor

membrelor (MM), precum şi tehnica de WEC. Fiecare test implică 20 compuşi

chimici testaţi în patru laboratoare independente într-un design dublu orb. Datele

preliminare indică faptul că metoda WEC arată cea mai bună concordanţă a

clasificării in vivo, iar rezultatele testelor in vitro sunt 80% clasificare corectă versus

78 şi 71% pentru EST şi respectiv MM.

9

Mai mult decât atât, compuşii embriotoxici puternici au arătat o predictivitate

de 100% în fiecare din sistemele de testare.

16.4. Concluzii şi perspective

Bogăţia de teste alternative potenţial disponibile pentru testarea toxicologică a

dezvoltării este în parte o reflectare a varietăţii mecanismelor biologice implicate în

dezvoltarea embrionară şi fetală. Din moment ce este acceptat pe scară largă faptul că

embriogeneza constituie un proces fiziologic extrem de complex, se poate trage

concluzia că pentru biotehnologiile noastre curente, este necesară o perioadă de timp

înainte de un test alternativ unic care poate înlocui testarea pe animale întregi. Prin

urmare, este mult mai probabil, cel puţin în viitorul imediat, că baterii de teste sau

combinaţii de teste vor fi capabile să abordeze o serie completă de mecanisme ale

dezvoltării embrionare şi ale reproducerii.

Datorită caracteristicilor unice ale acestui proces, testarea alternativă în

toxicologia dezvoltării diferă în mod semnificativ de principiile de testare

toxicologică dermică şi oculară in vitro care s-au bucurat deja de un succes

substanţial în furnizarea de teste alternative în vederea obţinerii acceptului de

reglementare.

Cu toate acestea progresul ştiinţific nu este gradat ostentativ, ci este mult mai

convingător şi abrupt, astfel încât realizarea de modele alternative avansate pentru

toxicologia de reproducere şi embrionară, pot să apară la un orizont imprevizibil, care

este tot mai aproape.

10

11