CAPITOLUL 14STUDII TOXICOCINETICE IN VITRO

14.1. Introducere

Toxicocinetica analizează evenimentele legate de căile metabolice ale unui

compus administrat in vivo sau in vitro şi modul în care metabolismul acestuia

afectează concentraţia compusului în organul ţintă. Organele, ţesuturile şi celulele

sunt ţintele asupra cărora acţionează substanţa chimică. Toxicocinetica, prin urmare,

se referă la numeroase evenimente, care afectează absorbţia unei doze toxice a unui

compus chimic în tractul gastro-intestinal, prin piele, prin intermediul plămânilor sau

de cealaltă parte a mucoasei membranelor. În cazul extinderii absorbţei compusul

chimic este modificat la un compus înrudit, chiar dacă este mai mult sau mai puţin

toxic. Acest metabolism are loc în primul rând în ficat, dar de asemenea, şi în alte

organe metabolic active, cum ar fi plămânii sau rinichii.

În urma metabolismului şi în funcţie de proprietăţile sale fizicochimice,

compusul chimic circulă sau este apoi distribuit şi sechestrat în diferite organe. În

cele din urmă, substanţa este eliminată fie activ sau pasiv, prin procese de filtrare

ample de la nivelul rinichilor. Alternativ, compusul chimic este selectiv eliminat prin

plămâni, piele sau tract intestinal.

Toxicocinetica contribuie la estimarea riscului substanţei chimice bazată pe

calcularea potenţialului de expunere la om sau animale. Metodele in vitro contribuie

la modelarea toxicocinetică şi evaluarea riscului, prin completarea datelor provenite

de la studii in vivo (Andersen, 2003). Nu este surprinzator, că efectele cele mai

toxicocinetice sunt evaluate în sisteme de culturi celulare ca interacţiuni relativ

simple între substanţele chimice şi funcţiile celulei.

Vom analiza conceptele de distribuţie cinetică şi metabolism ale compuşilor de

testare în sisteme in vitro corelând informaţia disponibilă în prezent cu cercetările ce

vor fi efectuate în perspectivă. Capitolul 3, intitulat "toxicocinetica" descrie în

detaliu principiile generale de absorbţie, distribuţie, metabolizare şi eliminare.

14.2. Studii metabolice în culturi celulare

Ficatul joacă un rol cheie în detoxifierea substanţelor toxice, dar de asemenea,

el poate transforma un produs chimic într-un metabolit mai toxic decât compusul

iniţial. Este posibil ca metabolitul toxic să inducă leziuni ale ficatului şi a altor organe

ţintă. Mecanismele care stau la baza leziunilor ficatului de către mai multe substanţe

chimice ale căror ţinte nu sunt specifice pentru acel organ, pot fi explicate printr-o

distribuţie toxicocinetică (Groneberg şi colab., 2002).

În culturile primare de hepatocite este posibil să cercetăm atât toxicitatea

hepatică metabolit-indusă cât şi aspectul farmacologic al metabolismului ficatului:

detoxifierea sau activarea substanţelor chimice. Celule de la animalele rozătoare şi

om sunt utilizate şi menţinute în culturi, fie în culturi de organe în monostrat sau ca

celule izolate în suspensie (Zucco şi colab., 2004). Celulele de la şoareci şi şobolani

sunt obţinute prin perfuzie de organ a ficatului, folosind colagenaza pentru separarea

rapidă şi uşoară a celulelor. Enzimele citocromului P450 sunt funcţionale şi sunt

menţinute în aceste sisteme de la câteva ore până la mai multe zile. Culturile de

hepatocite umane sunt, de asemenea, realizate prin co-cultura feeder layers (un strat

de celule, de obicei iradiate letal din culturi de celule animale pe care sunt cultivate

tipuri de celule pretenţioase) sau alte linii celulare continue.

Recent, hepatocite umane functionale au fost menţinute într-un status viabil

după congelare, status foarte important pentru că metabolismul hepatic este specific

fiecărei specii (Barile, 2008). O altă direcţie de cercetare o constituie utilizarea unor

linii celulare la care se menţine activitatea P450 în culturi primare de celule hepatice.

În cele din urmă, mai multe sisteme de co-cultivare a hepatocitelor şi a altor celule

ţintă sunt utilizate pentru studii de modelare toxicocinetică.

La diferitele tipuri de celule din culturile de celule descrise mai sus au fost

studiate proprietăţile metabolice şi de transport hepatocelulare cu un număr mare de

substanţe. Exemplele de domenii de cercetare specifice includ: (1) compararea

capacităţilor de metabolizare a celulelor hepatice şi mixturile S9, (2) conservarea

activităţii citocromului P450 în hepatocite (3) metabolism de specie specific, (4)

efectele protective a glutationului redus (GSH), în prezenţa leziunilor ficatului şi (5)

2

compararea capacităţii de metabolizare a ficatului dar şi ale altor organe, cum ar fi

rinichii, plămânii şi intestinul.

14.2.1. Biotransformarea în cultura celulară

14.2.1.1. Metabolismul enzimatic

Cele mai multe celule in vivo au capacitatea de a metaboliza enzimatic

compuşii chimici în substanţe mai puţin toxice, compuşi mai solubili în apă, care sunt

ulterior excretaţi prin urină. Aceasta capacitate este în mod clar cea mai pronunţată în

celule hepatice, dar rinichii, plămânii, intestinul şi pielea au capacitate crescută

pentru metabolismul xenobiotic.

Multe alte organe, cum ar fi celule sanguine, celulele endoteliale, muşchii şi

ţesuturile conjunctive au o capacitate relativ scăzută pentru biotransformare.

Principalul aspect al biotransformării substanţelor chimice de către cele mai active

celule este abilitatea de a adăuga grupuri funcţionale (reacţii de fază I), care ulterior

sunt legate de substanţe endogene, cum ar fi acidul glucuronic sau GSH, ducând la

creşterea solubilităţii în apă a metabolitului (biotranformare de fază II).

Cea mai importantă enzimă de fază I este citocrom P450 oxigenaza indusă de

astfel de produse chimice ca fenobarbitalul. Exemple de alte enzime mai frecvent

găsite sunt epoxid hidrolaza (de fază I) şi transferazele (de fază II). Este important de

notat faptul că biotransformarea descrisă poate conduce la noi metaboliţi mai reactivi

(toxici). Detalii despre aceste reacţii sunt discutate în capitolul 3.

Întreţinerea culturilor de celule specifice cu un grad ridicat de activitate

metabolică arată capacitatea lor de biotransformare, inclusiv o activitate P450

semnificativă pentru câteva ore sau zile. Este discutabil dacă această perioadă scurtă

de timp este suficientă pentru a mima metabolismul relevant din punct de vedere

clinic pentru toate tipurile de produse chimice. Pasajele timpurii de linii limitate, mai

ales a celulelor fetale, poate arăta anumite activităţi metabolice. Diferite culturi ce

provin atât din liniile celulare limitate cât şi continue, demonstrează cu toate acestea

nivele scăzute sau nemăsurabile de P450 care sunt, uneori, cuplate la activitatea

hidrolazei sau glucuronil transferazei. Activitatea P450 găsită în unele linii celulare

3

este crescută de inducţia in vitro. Astfel, câteva linii de celule au unele capacităţi de

biotransformare în comparaţie cu tipurile celulare care nu au această capacitate in

vivo.

Culturile primare de hepatocite de şobolan sunt folosite ca sisteme de activare

metabolică într-o varietate de teste de toxicitate. Aşa cum am menţionat mai sus,

celulele proaspăt izolate sunt utilizate pentru a asigura integritatea metabolică

deoarece culturile continue pierd capacitatea metabolică în timp. Mai mult decât atât,

există unele diferenţe în capacităţile animalului şi ţesuturilor umane de a metaboliza

produse chimice, cu toate că variaţiile printre donatorii individuali pot împiedica

variaţiile intrinseci întâlnite între specii. În consecinţă, culturile primare sunt

modelele in vitro adecvate pentru evaluarea biotransformării in vitro.

14.2.1.2. Utilizarea mixturii S9

În prezent sunt disponibile două metode pentru a creşte capacitatea de

biotransformare a culturilor de celule: (1) celulele ţintă sunt cultivate prin feeder

layers pe un alt strat de celule cu o mai mare capacitate metabolică, de exemplu pe

celule iradiate BHK21 pentru a inhiba diviziunea mitotică şi (2) microzomi întregi se

adaugă în mediu de cultură sau de preferat în fracţia de ultracentrifugare a ficatului

omogenizat de la şoareci sau şobolani pretrataţi cu Arochlor 1254, care astfel conţin

P450 şi alte enzime microzomale importante. Această fracţiune plus co-factorul

NADPH este numită mixtura S9.

Primele tentative de a depăşi obstacolul de capacitate metabolică limitată în

sisteme de testare pe termen scurt, s-au bazat pe observaţia că metabolismul necesar

pentru a activa multe substanţe carcinogene în forma lor activă a fost localizat în

reticulul endoplasmatic al celulelor hepatice, în principal prin amestecarea oxidazelor

funcţionale.

Linia de culturi celulare S9 consolidată oferă avantaje moderate faţă de

culturile primare de hepatocite: (1) sistemul este flexibil, uşor de pregătit şi poate fi

utilizat cu o varietate de modele de culturi celulare, (2) enzimele de metabolizare a

medicamentelor sunt relativ stabile şi sunt caracterizate biochimic înainte de

4

încorporarea în experiment şi (3) sistemul îmbunătăţeşte reacţiile de fază I, cum ar fi

formarea de metaboliţi reactivi, dar induce o scădere relativă a reacţiilor de fază II

biosintetice, deoarece cofactorii de faza II bogaţi în energie nu sunt incluşi în

amestec.

Dezavantaje importante descurajează adesea utilizarea mixturii: (1)

suplimentar, culturile S9 necesită adaosul de co-factori exogeni, cum ar fi NADPH,

(2) suplimentarea este citotoxică pentru cele mai multe sisteme şi rezultatele testelor

şi activităţile enzimei pe miligram de proteină variază considerabil, (3) mixturile

prezintă adesea variaţii în enzime, co-factori, condiţii de expunere, concentraţiile de

S9 în amestec şi inductorii enzimatici şi (4) activitatea enzimei nu poate produce

rezultate care să reflecte specia, sexul şi specificitatea organului de origine.

14.2.1.3. Pregătirea fracţiunilor S9

Sistemul de activare S9 este derivat din supernatantul de la 9000xg rotaţii din

omogenatul de ficat de şobolan Aroclor 1254 indus. După injectarea la şobolani,

Aroclor 1254 * induce un spectru larg de enzime de metabolizare a medicamentelor.

Ficatul este apoi omogenizat şi microzomii conţinând enzimele de fază I cu funcţie de

oxidază sunt izolaţi de fragmentele neîntreruptede de reticul endoplasmatic folosind

centrifugarea diferenţială.

Fracţiunea S9 de supernatant este folosită ca omogenat neprelucrat sau este în

continuare îmbogăţit pentru activitate microzomală prin mărirea suplimentară a

vitezei de centrifugare. Aceasta separă un sediment microzomal puternic îmbogăţit de

fracţiunea supernatantă citosolică. Primul conţine enzime de biotransformare de fază

I, în timp ce supernatantul este bogat în multe dintre enzimele metabolismului de

faza II. Un amestec tampon S9 este apoi constituit cu co-factori, după modelul din

figura 14.1.

* O mixtură de bifenoli policlorinaţi sau o combinaţie de fenobarbital şi β-naftaflavonă este de asemenea utilizată.

5

Figura 14.1. Protocolul pentru prepararea mixturii S9. Soluţia co-factor conţine: MgCl2, glucozo-6-fosfat, NADPH în fosfat tampon, 0.2 mol/L, pH 7,4. (după Flint, şi Orton, 1984.)

14.2.2. Studii in vitro de absorbţie, distribuţie, metabolism şi eliminare

(ADME)

Absorbţia, distribuţia, precum şi eliminarea unui produs chimic in vivo sunt

influenţate de interacţiunea proceselor de biotransformare cu substanţa (Ekins şi

colab., 2000). Factorii care afectează aceste procese includ:

1. capacitatea şi timpul pe care le necesită o substanţă ca să traverseze bariere

celulare cum ar fi membranele mucoase intestinale, bariera hemato-encefalică şi

pielea,

2. capacitatea substanţei de a intra şi de a se lega de situsul ţintă,

3. gradul de legare la proteinele sangvine şi acumularea şi sechestrarea în

compartimentele lipidice,

4. trecerea prin endoteliul capilarelor,

5. raportul de solubilitate în apă/lipide al substanţei şi distribuţia sa prin

intestin, sânge, fluide intracelulare şi extracelulare.

6

Capacitatea de a anticipa mecanismele de toxicitate şi biotransformare a unui

compus chimic de la formula sa structurală devine posibilă pe baza modelelor relaţiei

structură-activitate (Lin, 2006). De asemenea, este posibil să se prevadă absorbţia,

distribuţia, precum şi eliminarea pornind de la structura unei substanţe şi reactivitatea

ei cu proteine de transport specific celulare. O proprietate fizico-chimică a unui

compus chimic cum ar fi solubilitatea în apă şi lipide, ionizarea constantă în pH acid

sau bazic şi capacitatea de legare la proteine sunt de asemenea instrumente în

predicţia caracteristicilor sale toxicocinetice. De exemplu, moleculele mari şi foarte

ionizate au dificultăţi de a intra sau traversa membrana celulară şi prin urmare, sunt

slab absorbite. Alternativ, moleculele mici şi moderat acide sau bazice sunt absorbite

şi distribuite în spaţiile extra- şi intracelulare. Mai mult decât atât, agenţii foarte

lipofili sunt rapid absorbiţi şi rapid distribuiţi în toate compartimentele fiziologice. În

plus, ei sunt deseori legaţi la ţesuturi în concentraţii mari, iar acest lucru poate

explica, de asemenea, gradul ridicat de legare de proteinele intracelulare.

Cele mai multe substanţe cancerigene şi mutagene afectează celulele la

concentraţii relativ scăzute. Aceasta se explică prin biotransformarea substanţei şi

prin urmare, este motivul pentru care cei mai mulţi mutageni sunt clasificaţi ca

acţionând indirect. Substanţele care au în general efecte toxice, mai ales după doze

toxice acute, demonstrează toxicitate la concentraţii înalte care saturează capacitatea

de biotransformare a ficatului. Această concentraţie este estimată în cazul în care

doza şi proprietăţile fizico-chimice ale substanţei sunt cunoscute.

În concluzie, testele in vitro pentru a determina coeficientul de distribuţie,

legarea de proteine, disocierea şi transportul celular sunt uşor de efectuat şi datele

fizico-chimice generate de aceste studii completează alte tipuri de informaţii de

toxicitate in vivo. Astfel, modelele in vitro pentru ADME sunt privite cu atenţie

crescută pentru că ele oferă informaţii pentru screening-ul unui număr mare de

compuşi cu activitate biologică şi farmacologică, în special atunci când se efectuează

automatizări de mare capacitate şi analize.

7