Cap-03

Principiile Virologiei

Serban MOROSAN DVM, PhD

Taxonomia virala

•  Este o disciplina relativ noua •  La inceputul anului 1900 : virusurile erau clasificate

ca fiind agenti filtrabili (filtre de portelan ce retin bacteriile)

•  1930: dezvotarea tehnicilor a permis descrierea

proprietatilor a numeroase virusuri (purificarea si descrierea morfologiei)

•  In anul 1960 s-a format ICTV (International

Committe on the Taxonomy of Viruses) •  In general clasificarea are la baza doua sisteme:

– Un sistem ce se bazeaza pe o singura caracteristica sau pe o serie de caracteristici unice (« monothetic system »)

– Un sistem ce se bazeaza pe partajarea unui numar de caracteristici comune (« polythetic system »)

Proprietatile virusurilor in taxonomie

•  Metoda utilizata in taxonomia virala este cea de a doua (« polythetic system »): orice virus este descris utilizand « colectia » proprietatilor individuale

•  Descriptia virusurilor se realizeaza pe baza:

–  Morfologiei virionului : marimea, simetria capsidei, forma, prezenta sau absenta anvelopei

–  Proprietatile fizice ale virionului: structura genomului, sensibilitatea la actiunea substantelor fizice sau chimice; proprietatile antigenice

–  Proprietatile biologice: strategiile de replicare, tipul de gazda, modul de transmitere si patogenicitatea

•  ICTV a adoptat o schema ce utilizeaza o ierarhizare taxonomica: ordin, familie, subfamilie, gen si specie.

•  Specia este definita ca fiind un virus ce se

multiplica si care ocupa o anumita nisa ecologica particulara

•  Pentru fiecare gen s-a identificat o specie tip •  Specia tip nu este neaparat cea mai

reprezentativa dar defineste sau identifica cel mai bine genul

•  Genul: este un grup de specii ce prezinta anumite caracteristici comune

•  Subfamilia: est un grup de genuri ce prezinta

anumite caracteristici comune •  Familia: grup de subfamilii ce prezinta anumite

caracteristici comune •  Ordinul: grup de familii ce prezinta anumite

caracteristici comune

•  Familia este cel mai mult utilizata in

taxonomia virala •  Majoritatea familiilor sunt caracterizate in

functie de : – morfologia virionului, – structura genomului si – strategia de replicare a acidului nucleic

viral

Reguli de taxonomie

•  ICTV a adoptat o nomenclatura utilizand reguli pentru descrierea virusurilor

•  Genul, subfamilia, familia si ordinul se scriu intr-un

singur cuvant terminandu-se cu sufixul: -virus; -virinae; -viridae si –virales

•  Exemplu: ordinul Mononegavirales, familia

Paramyxoviridae, subfamilia Paramyxovirinae, genul Morbillivirus, specia: virusul rujeolei

Ordinea prezentarii virusurilor

•  Ordinea prezentarii virusurilor este: – Natura genomului viral – Mono sau dublucatenar – Polaritatea genomului – Reverstranscriptia

•  O alta categorie a fost creata pentru agentii subvirali cum ar fi viroizii, satelitii si prionii

Clasificarea virala : o « opera » neterminata

•  Peste 5000 de virusuri – 30000 de suse si subtipuri

•  5 ordine •  84 de familii •  12 sub-familii •  324 genuri •  Peste 2000 de specii

Virusuri ADN monocatenare (ss DNA)

•  Circoviridae : •  Anellovirus •  Parvoviridae : parvoviroza canina

– parvovirinae

Virus ADN bicatenar (dsDNA)

•  Asfarviridae: pesta porcina africana •  Poxviridae : variola •  Iridoviridae •  Adenoviridae : hepatita infectioasa

canina •  Herpesviridae : rinotraheita infectioasa

bovina •  Polyomaviridae •  Papillomaviridae

Virus ARN de polaritate negativa(ssRNA -)

•  Orthomyxoviridae : virusul influentza •  Rhabdoviridae : virusul turbarii •  Delta virus •  Paramyxoviridae : maladia Carré •  Bornaviridae •  Arenaviridae •  Bunyaviridae •  Filoviridae

Virus ARN bicatenar (ds RNA)

•  Birnaviridae •  Reoviridae : febra catarala ovina

Virus ARN monocatenar de polaritate pozitiva ssRNA +

•  Caliciviridae : caliciviroza felina •  Picornaviridae : febra aftoasa •  Astroviridae : astroviroza (enterite) •  Flaviviridae : BVD : boala mucoaselor •  Coronaviridae : peritonita infectioasa felina •  Arteriviridae : arterita infectioasa ecvina •  Togaviridae : encefalitele ecvine americane

Virus cu transcriptie inversa

•  Retroviridae (ssRNA /RT) : leucoza felina •  Hepadnaviridae (dsDNA/RT): hepatita B ,

hepadnavirus (rate , marmote)

Agenti sub-virali

•  Virusurile satelit •  Prionii (agenti transmisibili neconventionali)

Virusuri satelit : deltavirus

•  Exemplu – Virusul hepatitei delta

•  Proprietati – Virus defectiv – Necesita functiile unui alt virus (virus helper) – Virus ARN monocatenar circular – O parte din genom ce seamana unui viroid

Agenti transmisibili neconventionali

•  Exemplu: – Encefalopatia spongiforma bovina (ESB) – Scrapia – Creutzfeldt-Jakob la om

•  Proprietati : – PrP infectioasa – Doua forme : PrPc si PrPsc

– Rezistenta exceptionala la agenti chimici si fizici.

Cultivarea si detectia virusurilor

1.  Detectia initiala si izolarea virusurilor 2.  Cultivarea virusurilor 3.  Recunoasterea cresterii virusurilor in

cultura celulara : detectia cantitativa a virusurilor

Metodele de studiu al virusurilor

•  Metode de studiu al acidului nucleic viral –  Analiza de restrictie –  Southern blot –  PCR –  Microarray –  Secventializare

•  Metode de studiu al proteinelor –  Marcaj radioactiv –  Imunoprecipitare –  Electroforeza –  Western blot

Diagnosticul infectiilor virale

Semnele clinice ê

Diagnostic diferential ê

Confirmarea etiologiei prin: - Punerea in evidenta a agentului patogen (direct) - Punerea in evidenta a raspunsului imun (indirect)


A.  Metode de diagnostic direct (punerea in evidenta a Ag)

A1. Nespecifice : (Determinarea originii virale, fara identificarea agentului etiologic) Efect citopatogen Test de hemadsorbtie


A.  Metode de diagnostic direct (punerea in evidenta a Ag)

A2. Specifice : (punerea in evidenta directa a unui constituent al virusului) Detectia genomului Detectia proteinelor


B. Metode de diagnostic indirect (punerea in evidenta a raspunsului imun , Ac) ELISA direct Imunofluorescenta Seroneutralizare Inhibitia hemaglutinarii

Detectia initiala si izolarea virusurilor

•  Prezenta unui virus este evidentiata de efectele asupra organismului sau asupra culturilor celulare

•  Efectele asupra organismului: leziuni, disfunctii ale sistemului imun, ale organelor (hepatite sau miocardite) sau moartea

•  Efectele asupra culturilor celulare: modificari morfologice ale celulelor infectate (efectele citopatice)


•  Virusurile pot fi izolate de la animalele infectate: din excretii, secretii, sange sau tesuturi

•  Virusurile pot fi izolate plecand de la animalele infectate

experimental sau de la culturile celulare infectate •  Cainii, pisicile, soarecii, sobolanii si pasarile au fost utilizate

drept animale de laborator pentru infectiile experimentale


•  Virusurile cultivate intr-o alta gazda sau pe culturi celulare se pot adapta prin achizitia unor modificari genetice (mutatii de exemplu)

•  Aceste modificari pot fi insotite de o pierdere a virulentei

si a patogenicitatii. •  Aceasta adaptare si atenuare pot fi extrem de utile

pentru intelegerea multiplicarii virusului dar si pentru constructia de vaccinuri atenuate

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda - animalele de laborator si ouale embrionate

•  Inainte de descoperirea culturilor celulare, virusurile se cultivau numai in gazdele naturale sau in animale de laborator

•  In anul 1932 au fost introduse ouale embrionate in studiul

virusurilor •  Dezvoltarea oualelor de gaina la 14 zile dupa fertilizare

contin o serie de tesuturi diferentiate, propice multiplicarii multor virusuri: –  Orthovirusuri, paramyxovirusuri, rhabdovirusuri,

togavirusuri, herpesvirusuri si poxvirusuri

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda - animalele de laborator si ouale embrionate

•  In timp, ouale embrionate au fost inlocuite de culturile celulare

•  Astazi, ouale embrionate sunt inca utilizate pentru obtinerea de titruri inalte pentru unele virusuri sau pentru dezvoltarea de vaccinuri

•  De exemplu, formarea leziunilor inflamatorii de la nivelul membranei corioalantoide ramane metoda de baza in detectia unei variante a poxvirusului.

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda – tipuri celulare

•  Celule aderente : –  Doua tipuri de morfologie : epiteliale (poligonale) si

fibroblastice (alungite) •  Celule neaderente (exemplu : liniile celulare

imortalizate) –  Plutesc in mediul de cultura –  Sferice –  Destinate productiei celulare in masa

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda - culturile de organe si celulare

•  Mentinerea celulelor animale in vitro: –  Cultura organelor –  Cultura primara de explant de organe –  Culturile celuare

•  Cultura organelor: arhitectura tridimensionala a tesutului este mentinuta

•  Cultura primara de explant de organe: piese mici de tesut

sunt cultivate •  Culturile celulare: tesutul este disociat in celule individuale

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda – culturile si tipurile celulare (cultura, susa, linie)

•  Culturile celulare sunt cele mai utilizate in cultivarea virusurilor

•  Culturile celulare sunt de trei tipuri:

–  Culturile celulare primare –  Susele de celule –  Liniile celulare

•  Virusurile se comporta diferit in functie de tipul de culturi celulare (cu avantajele si dezavantajele tehnice)

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda – culturi celulare primare, suse celulare, linii

celulare

•  Les diferitele tipuri celulare –  Culturi de celule primare : celule puse in cultura plecad

de la organe; cresc in monostrat confluent –  Suse celulare : polulatie celulara euploida (nr normal de

cromozomi) ce nu se cultiva la infinit (o subcultura) –  Linii celulare: populatie celulara aneuploida (nr anormal

de cromozomi) ce poate fi cultivata la infinit : liniile celulare se pot transforma (spontan) in linii celulare imortalizate

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda - culturile celulare primare

•  Culturile celulare primare pot fi obtinute plecand de la:

–  Embrioni sau tesuturi selectate de la embrioni –  Animale nou-nascute –  Animale adulte

•  Cele mai utilzate culturi celulare: primate, om, rozatoare (soareci , sobolani, hamsteri), pasari

Suporturile culturilor celulare


•  Culturile celulare sunt obtinute prin disocierea tesutului si eliberarea celulelor (proteaze si colagenaze)

•  Celulele vertebratelor cresc si se divid numai daca se

ataseaza la o suprafata solida (exceptie, celulele sitemului hematopoetic)

•  Celulele sunt plasate in placi ce favorizeaza atasarea

(placi colagenate de exemplu) •  Mediul de cultura : lichid, bogat in acizi aminati, minerale,

tampon pH, sursa de energie, factori de crestere, factori de atasare


•  In aceste conditii, celulele se ataseaza la placa, se divid si migreaza pana ce acopera suprafata placii

•  Odata ce celulele acopera placa (intr-un singur strat) acestea sunt viabile dar nu se mai dezvolta

•  Dupa inlaturea unei portiuni din acest strat celulele se dezvolta pana la refacerea lui

•  Odata ce devin confluente, celulele nu se mai dezvolta: inhibitia de contact

•  Culturile celulare pot contine mai multe tipuri celulare

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda - subculturile celulare

•  Celulele dintr-o cultura primara pot fi subcultivate pentru a obtine un numar mai mare de celule

•  Celulele sunt mai intai detasate cu tripsina è suspensie de

celule •  Suspensia este diluata si o parte este recultivata = cultura

secundara •  Fiecare subcultura reprezinta un pasaj

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda - subculturile celulare

•  Fiecare pasaj este format dintr-un numar de generatii celulare (in functie de dilutia pasajului)

•  Majoritatea celulelor vertebratelor multiplica (se dubleaza)

cu o rata constanta: odata la 24 h •  Daca utilizam un pasaj diluat de opt ori, celulele se

dubleaza odata la 3 zile

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda - susele celulare

•  Cultura se numeste susa celulara incepand de la a doua cultura si pana la imbatranire

•  Alterarea susei celulare poate avea loc: transformare (linie

celulara imortalizata)

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda - susele celulare

•  Celulele vertebratelor nu pot fi pasate la infinit (20-100 de generatii): in functie de varsta si specie

•  Dupa 20-100 generatii, celulele nu se mai multiplica:

fenomenul de criza sau imbatranire

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda - liniile celulare

•  In timpul cultivarii unei linii celulare, acestea pot suferii modificari (transformare) si nu mai trec prin stadiile de criza sau imbatranire : pot fi pasate la infinit

•  Caracteristica principala a transformarii este faptul ca celulele sunt imortalizate

•  Celulele imortalizate se numesc linii celulare sau linii celulare continue

•  Imortalizarea poate aparea spontan in timpul unui pasaj, induse chimic, prin infectia virala sau transfectia cu oncogene

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda - liniile celulare

•  Imortalizarea apare frecvent la culturile celulare la rozatoare, celule renale de maimuta si rar la cele de om sau gaina

•  Importalizarea este insotita de modificari genetice (celule aneuploide : cu un numar anormal de cromozomi)

•  Liniile celulare sunt in general compuse din fibroblaste sau celule epiteliale

•  Liniile celulare rezulta prin selectia unor variante celulare

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda – transformarea

•  Celulele transformate se diferentiaza de celulele normale prin proprietati ce pot fi grupate in trei modificari esentiale: –  Imortalizarea –  Controlul cresterii aberante –  Celule maligne

Imortalizarea : posibilitatea de a fi cultivata la infinit


•  Controlul cresterii aberante (proprietati): –  Pierderea inhibitiei de contact –  Independenta de contact –  Tumoreginicitatea

•  Pierderea inhibitiei de contact: celulele vor creste unele peste altete (si nu in monostrat)

•  Independenta de contact: celulele nu mai au nevoie sa se ataseze pentru a se multiplica (se pot multiplica intr-un lichid in suspensie)


•  Tumorgenicitatea : abilitatea celulelor de a forma o tumora in experimentare animala si de a se raspandi in vivo

•  Caracteristicile celulelor transformate sunt extrem de

importante pentru studiul virusurilor tumorale

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda - avantajele si dezavantajele diferitelor tipuri de culturi celulare

Avantage : •  Liniile celulare sunt relativ usor de mentinut •  Celulele aderente sunt usor de manipulat (pasage

multiple) •  Celulele in suspensie sunt usor de diluat si produc un

numar mare de celule •  Schimbarea mediului de cultura se realizeaza usor

Cultivarea virusurilor in diferite organisme gazda - avantajele si dezavantajele diferitelor tipuri de culturi celulare

Dezavantage : •  Nu toate virusurile se multiplica pe culturi celulare

In acest caz se utilizeaza gazda naturala, animalele de laborator sau culturile de tesuturi

Recunoasterea virusurilor

•  Alegerea metodei de cultivare a virusurilor depinde de mai multi factori: –  Scopul experimentului: cultivarea virusului sau ale unor

variante –  Limitele de cultivare a virusului in vitro: se poate cultiva

pe linii celulare, pe oua embrionate sau in suspensii celulare

–  Tehnici alterantive: daca este posibil •  Metoda aleasa depinde de :

–  Biologia virusului : virusul este eliberat din celula gazda, determina liza celulei sau nu, determina sau nu un efect citopatic etc

Recunoasterea dezvoltarii virusurilor in culturile celulare

•  Recunoasterea unei infectii virale: efectul citopatic si hemadsorbtia

•  Efectul citopatic este compus din doua fenomene diferite:

–  Modificari morfologice induse in celulele sau grupurile de celule de catre infectia virala (usor recunoscute la microscopul optic)

–  Incluziile virale : alterari ale arhitecturii intracelulare


•  Modificarile morfologie induse de infectia virala: –  rotunjire, –  agregarea, –  pierderea aderentei sau liza

•  Modificari morfologice cauzate de un virus sunt extrem de reproductibile si pot fi asociate unei anumite infectii virale.

•  Incluzii virale: anomalii intracelulare specifice la o celula

infectata si detectabile la microscopul optic. •  Incluziile virale sunt specifice unei infectii virale date:

(corpusculii Bases Negri la nivelul nucleocapsidei virusului rabic)


•  Hemadsorbtia se refera la masurarea indirecta a sintezei proteinei virale in celulele infectate detectate prin adsorbtia eritrocitelor la suprafata celulelor infectate.


•  Hemadsorbtia : abilitatea virusurilor de a atasa specific globulele rosii

•  Multe virusuri sintetizeaza proteine de atasare : se ataseaza la o mare varietate de celule (eritrocitele)

•  Adesea, aceste proteine virale sunt exprimate la suprafata celulelor infectate (in timpul maturarii virusurilor cu anvelopa)

•  Astfel, un grup de celule infectate poate fi usor detectat cu ochiul liber dupa expunerea preparatului in contact cu globule rosii

Metodele cantitative de detectie a virusurilor tehnicile fizice – hemaglutinarea (numai pentru virusurile

hemaglutinante)

•  O mare parte dintre virusuri sintetizeaza proteine de atasare celulara: atasarea la celule (eritrocitele)

•  Aceste proteine responsabile de atasarea celulara sunt

prezente la suprafata virionilor: virionii pot atasa direct eritrocitele

•  Amestecul de particule virale (intr-o concentratie suficienta)

cu eritrocite determina aglutinarea acestora

•  Ertrocitele aglutinate se disting usor de cele neaglutinate

Metodele cantitative de detectie a virusurilor tehnicile fizice – hemaglutinarea

•  Dilutii seriate ale virusului sunt amestecate cu o concentratie fixa de eritrocite (placa speciala)

•  Eritrocitele ce nu sunt aglutinate formeaza o grupare de

celule usor de recunoscut •  Eritrocitele aglutinate nu sunt libere in godeurile placii si

formeaz un strat uniform la suprafata godeului •  O unitate hemaglutinanata (HA unit/ml): cantitatea minima

de solutie virala capabila sa determine aglutinarea •  Titrul viral exprimat in HA unit/ml poate fi calculat tinand

seama de dilutia solutiei virale

hemaglutinare

Titrul viral al probei de testat este calculat ca fiind inversul dilutiei ultimului punct ce determina hemaglutinarea : A8 si B1

Metodele cantitative de detectie a virusurilor

•  Exista doua metode majore: fizice si biologice •  Metodele fizice (masoara prezenta particulelor virale si

daca acestea sunt sau nu infectioase): Ex : Numararea particulelor (microscopie electronica) etc.

•  Metodele biologice: masoara prezenta infectiei virale dar nu si numarul particulelor prezente Ex: cultivarea in placa etc.

Metodele cantitative de detectie a virusurilor tehnicile biologice- cultivarea in placa

•  Tehnica de cultivare in placa : este cea mai utila tehnica biologica

•  Descoperita de Herelle (1900) la bacteriofagi ea a fost

adaptata la virusurile animale de Dulbecco in 1953 •  Metoda simpla si cantitativa

Metodele cantitative de detectie a virusurilor – « plaque assay »

•  Principiul tehnicii : abilitatea unei singure particule virale de a da nastere la o suprafata citopatologica macroscopica (« placa infectioasa»)

•  Tehnica poate fi utilizata pentru cuantificarea virusului


•  Efectuarea de dilutii seriate a virusului de testat •  Infectarea placilor Petri cu culturi celulare •  Peste fiecare placa Petri se adauga un mediu semi-solid •  Mediul solid previne formarea placilor de infectie

secundare •  Astfel, fiecare placa insemana rezultatul infectiei unei singure

particule virale •  Dupa incubare, mediul este colorat si placile pot fi astfel

vizualizate

Etapele :


•  Placile de cultura inoculate cu dilutii mari contin cateva placi de infectie

•  Placile ce contin un numar rezonabil de placi de infectie vor

fi numarate si concentratia virusului infectios de origine poate fi calculat in functie de dilutia inoculata

•  Rezultatul sau titrul viral este exprimat in placi formatoare

de unitati pe mililitru (pfu/ml) –  Numai particulele virale capabile sa formeze placi infectioase vor fi

numarate

Virus de o concentratie necunoscuta

Dilutii seriate

Etapa 1

Etapa 2

Fiecare dilutie este depusa intr- o placa Petri ce contine un monostrat de celule

Etapa 3

Fiecare placa de cultura este acoperita cu un mediu semi-solid (previne formarea de « placi secundare »)

Etapa 4

•  Incubarea placilor Petri

si colorarea acestora pentru vizualizarea placilor infectioase


•  Pipette off and discard ONE ML of media from each well. One ml of media should now remain on each monolayer.

•  Add 100 µL or 10 µl of each dilution in duplicate to each well, letting the virus flow gently into the media.

•  [Consider this: If 100µl of a 106 dilution yields 25 plaques, the titer of virus is 2.5x108 PFU/ml. If 10µl of a 106 dilution yields 30 plaques, the titer of virus is 3.0 x109 PFU/ml.]

Metodele cantitative de detectie a virusurilor tehnicile biologice- metoda punctului final

•  Virusurile la care nu pot fi adaptate tehniciile de mai sus (dar care determina patologii detectabile in culturile celulare, ouale embrionate etc) pot fi cuatificate prin tehnica punctului final

•  Virusul este diluat (dilutii seriate) si cultivat pe mediu si prin

metoda adecvata •  Dupa perioada de incubatie adecvata trebuie evaluat

momentul in care s-a produs infectia

Metodele cantitative de detectie a virusurilor tehnicile biologice - metoda punctului final

•  Diferite metode statistice s-au dezvoltat pentru a calcula dilutia de virus ce determina infectia a 50% din mediile de cultura inoculate : titrul viral este exprimat ca ID50 (« infectious dose 50 »)

•  Tehnica poate cuprinde de asemenea : –  observarea efectului citopatic in culturile celulare sau TCID50 (« tissue

culture infective dose 50 ») –  Moartea oulelor embrionate inoculate: EID50 « egg infectious dose

50 » –  Moartea animalelor infectate: LD50 « lethal dose 50 »


•  Datele din tabelul de mai sus au fost recoltate prin infectia cu dilutii seriate a mai multor placi de culturi celulare

•  Dupa incubare s-au observat prezenta efectelor citopatice


•  Dilutia -6 : 66,7 % dintre placi sunt infectate •  Dilutia -7: 14,3% dintre placi sunt infectate •  Dilutia ce determina infectia a 50% dintre placi se afla intre dilutiile -6 si -7


•  Dilutia exacta poate fi calculata utilizand metoda lui Reed-Muench

•  Distanta proportionala 50% = (% peste 50%) - 50%)/(% peste 50%) - (% sub 50%)

•  Sau (66,7% - 50%) / (66,7% - 14,3%) = 0,3 •  Punctul final sau

log TCID50 = (log din dilutia peste 50%) + distanta proportionala x log factorul de dilutie sau

Log TCID50 = (-6) + ( 0,3 x - 1) = - 6,3 Deci TCDI50 = 10-6,3

•  Distanta proportionala 50% = (% peste 50%) - 50%)/(% peste 50%) - (% sub 50%)

•  Sau (66,7% - 50%) / (66,7% - 14,3%) = 0,3 •  Punctul final sau

log TCID50 = (log din dilutia peste 50%) + distanta proportionala x log factorul de dilutie) sau

Log TCID50 = (-6) + ( 0,3 x - 1) = - 6,3 Deci TCDI50 = 10-6,3

Metode de detectie serologice

•  Utilizeaza specifictatea reactiei antigen-anticorp •  Permit detectia antigenelor virale sau a anticorpilor specifici •  Imunofluorescenta •  Imunoprecipitarea •  Immunobloting •  Elisa

Metode de detectie serologice – neutralizarea

•  Inocularea unui virus la un animal determina producerea de anticorpi specifici

•  O parte dintre acesti anticorpi pot neutraliza specific virusul

Metode de detectie serologice – neutralizarea

•  Dilutii de serum sau de anticorpi monoclonali + virus •  Incubare •  Testarea prin diferite metode : culturi celulare, sau animale •  End point = cea mai mare dilutie a anti-serului ce inhiba

dezvoltarea de efecte citopatice (in culturile celulare) sau relicarea virusului (in ouale embrionate sau animale de experienta)

Metode de detectie serologice – inhibarea hemaglutinarii

•  Anticorpii specifici proteinelor virale (cu o activitatea hemaglutinanata) pot bloca abilitatea virusului de a aglutina globulele rosii

•  Dupa incubare, inhibarea hemaglutinarii este citita ca fiind

cea mai mare dilutie a serului ce inhiba hemablutinarea •  Este o metoda rapida, sensibila utilizata pentru detectia

anticopilor oricarui virus ce cauzeaza hemaglutinare

Metode de detectie serologice – inhibarea hemaglutinarii

Metode de detectie serologice – fixarea complementului

•  Determina prezenta anticoprilor antivirali dintr-un ser de cercetat

•  Interactiunea antigeni virali-anticorpi poate cauza fixarea

complementului •  Fixarea complementului va determina liza membranelor

celulare

Metode de detectie serologice – fixarea complementului

Etapele : 1.  Inactivarea complementului endogen din serul de cercetat

(prin incalzire) 2.  Incubarea serului de cercetat cu un complement standard 3.  Daca are loc reactia Ag-AC atunci complementul se

fixeaza 4.  Detectarea complementului fixat: prin adaugarea de

globule rosii de oaie + AC anti globule rosii 5.  Citirea reactiei

Metode de detectie serologice – imunofluorescenta, ELISA

•  Imunofluorescenta directa •  Imunofluorescenta indirecta •  ELISA

Detectia acizilor nucleici - Southern blot, Northern blot

•  Southern blot •  Northern blot •  PCR

Studiul acidului nucleic viral

•  Analiza de restrictie si hibridare moleculara •  Amplificare genica (PCR)

– Conventinala – PCR in timp real

•  Secventializare •  Microarrays •  Metode bazate pe mutatii induse in seceventele

ADN-ului de studiat (mutageneza dirijata)

Cap-03

Documents

Transcript of Cap-03