VI. ORGANITELE GENERATOARE DE ENERGIE

6.1. Mitocondriile

6.1.1. Consideraţii generale. Repere istorice, aspect morfologice şi ultrastructurale, origine

6.1.2. Principii metodologice pentru studiul mitocondriei

6.1.3. Funcţiile mitocondriei

6.1.3.1. Funcţiile membranei mitocondriale externe

6.1.3.2. Funcţiile compartimentului intermembranar

6.1.3.3. Funcţiile matricei mitocondriale

6.1.3.4. Funcţiile membranei mitocondriale interne

6.1.4. Teoria chemiosmotică

6.1.5. Mitocondria şi apoptoza

6.1.6. Maladii mitocondriale – Distonia, Sindromul Leigh

6.2. Cloroplastele

Mitocondria este:

– un organit celular

– delimitat de un sistem de două membrane

– având ca funcţie de bază producerea de ATP.

• Carl Benda (1903) - mitos: fir, aţă; khondrion: granulă.

• Microscopia optică

– Albert von Kölliker a descris încă din 1857 organitul în muşchi, se consideră că mitocondria a fost evidenţiată pentru prima dată de Richard Altmann (1890);

- Altman a semnalat prezenţa mitocondriei în limfocite, sub forma unor structuri fuxinofilice, poziţionate lângă nucleu.

– coloraţii uzuale:

Verde Janus B – colorant

Vital - capacitatea sa de a patrunde şi de a fi oxidat în mitocondrie

Hematoxilină ferică Regaud

– granule negre

Microscopie în fluorescenţă

- Plasticitatea mitocondriilor, adică posibilitatea acestora de a-şi schimba forma, de a fuziona şi a fost evidenţiată mobilitatea intracelulară a mitocondriilor.

Originea mitocondrieiù

Teoria endosimbiotică;

• Argumente:

– Prezenţa porinelor în membrana externă;

– ADN propriu, circular;

– Ribozomi 70S, sinteză proteică sensibilă la cloramfenicol, insensibilă la cicloheximidă;

– Capacitate proprie de a se divide.

- Membrană mitocondrială externă

- Membrană mitocondrială internă – falduri –(criste)

Forma cristelor

- de regulă, aceea de falduri, orientate perpendicular pe axul lung al organitului

- pot avea şi aspect tubular (cu secţiunea circulară, sau triunghiulară) aşa cum este cazul la celulele secretoare de hormoni steroidici.

- criste orientate paralel cu axul lung al organitului.

Cele două membrane definesc două compartimente mitocondriale:

1. compartimentul mitocondrial extern, numit şi spaţiu intermembranar, reprezentând spaţiul dintre cele două membrane mitocondriale şi din axul

cristelor

2. compartimentul mitocondrial intern, denumit şi matrice mitocondrială, care este constituit de spaţiul din interiorul membranei mitocondriale interne, adică acel spaţiu delimitat de membrana mitocondrială internă.

Matricea mitocondrială reprezintă cel mai complex compartiment, la nivelul său găsindu-se:

- un ADN propriu - ADN circular, chiar dacă forma sa nu este de cerc.

- ribosomii mitocondriali

Structura chimică (membr. externă) - 60% proteine

- 40% lipide, ponderea cea mai mare – colesterolul şi fosfolipidele

Structura chimică (membr. internă)- 80% proteine

- 20 % lipide ponderea cea mai mare – cardiolipina datorită căreia membrana internă este mai puţin permeabilă

Distribuţie:

• Număr şi formă foarte variabile în aceeaşi celulă, datorită plasticităţii, în mod obişnuit sunt alungite, dar pot avea şi forme sferice

• Volum relativ:

– 5% - uzual

– 20% - hepatocite

– 30% - miocardocite

Număr – diferit de la un tip celular la altul, de gradul de activitate al acestora

- nr./cel. de la 5x105

Dimensiuni – 3-5 microni L, 1 micron diam., în stări patologice au dimensiuni uriaşe, megamitocondrii.

O mitocondrie marcată fluorescent (săgeată) se deplasează într-o celulă vie pe o distanţă de 6,6 μm în 33 sec. (B Trinczek et al., J Cell Sci 112:2355, 1999)

Metodologia studierii mitocondriei

Principii metodologice pentru studiul mitocondriei

- izolarea şi purificarea

mitocondriile se pot uşor separa după omogenizarea celulelor, prin centrifugare diferenţială, ca fracţiune de sine-stătătoare, fracţiunea mitocondrială.

Mitocondriile astfel obţinute, supuse unui şoc hipoton se umflă, astfel încât membrana internă se poate destined considerabil (mulţumită faldurării sale), în timp ce membrana externă se fragmentează veziculându-se – astfel, componentele compartimentului mitocondrial extern sunt deversate în mediu şi rămân în supernatantul obţinut prin depunerea la centrifugare a mioplastului (matricea învelită de membrana mitocondrială internă) şi veziculelor de membrană externă. Analiza acestui supernatant ne aduce indicii asupra bagajului molecular şi/sau macromolecular al acestui compartiment mitocondrial şi sugestii asupra funcţiilor sale.

Resuspendarea sedimentului obţinut din această primă centrifugare într-un mediu hiperton, va duce la condensarea mioplastului şi la realizarea unei diferenţe semnificative între densitatea lui şi a veziculelor de membrană mitocondrială externă.

Această diferenţă este exploatată pentru separarea printr-o a doua centrifugare, în condiţii adecvate, a mioplastului care sedimentează, de membrana mitocondrială externă, care rămâne în supernatant.

Pentru obţinerea separată a componentelor mioplastului, sedimentul obţinut la centrifugarea anterioară este supus unui al doilea şoc hipoton, sau unei dezintegrări prin ultrasonicare, prin care

- membrana mitocondrială internă este fragmentată sub forma unor vezicule,

- componentele matricei sunt deversate în mediu

prin centrifugarea în condiţii corespunzătoare a materialului astfel obţinut se obţin în sediment veziculele membranei interne, iar în supernatant materialul matricei

Subfracţiunile mitocondriale ale membranei externe şi membranei interne se pot purifica prin spălare (resuspendări şi recentrifugări) pentru reducerea contaminărilor cu componente ale compartimentului mitocondrial extern, respectiv ale matricei mitocondriale.

Prin procedeul descris mai sus, putem obţine separat, cu înalt grad de puritate, cele patru elemente ultrastructurale ale mitocondriei.

Funcţiile mitocondriei

Postulatele teoriei chemiosmotoice (P. Mitchell, 1961)

Premiul Nobel în chimie, 1978

Patru sunt enunţurile acestor postulate:

1. Lanţul respirator este transportor de protoni, generând la nivelul membranei mitocondriale interne un gradient electrochimic;

2. ATP sintaza produce ATP prin disiparea gradientului protonic;

3. Membrana mitocondrială internă conţine transportorii ce asigură traficul metaboliţilor ;

4. Pe căi nespecifice membrana mitocondrială internă este practic impermeabilă la protoni şi, în general, la ioni.

Funcţiile membranei mitocondriale externe

1. Permeabilitate controlată (porine) - permit schimbul moleculelor de până la 5000 daltoni între citosol şi compartimentul mitocondrial extern.

2. Preluarea de acizi graşi din citosol şi esterificarea lor la Acil-CoA sintaza

3. Acil-CoA este translocată pe versantul intermembranar unde este transformată sub acţiunea carnitin-acil-transferazei în acilcarnitină, care, după aceea, este preluată de membrana mitocondrială internă, pentru a o transloca în matricea mitocondrială.

4. Inactivarea aminelor biogene prin acţiunea monoaminoxidazei.

. Funcţiile compartimentului intermembranar

1. Compartiment tampon între citosol şi mioplast (microclimat adecvat funcţionării mitocondriei)

2. La nivelul acestui compartiment există enzime care pregătesc o serie de metaboliţi energetici esenţiali funcţionării mitocondriei. Importantă este prezenţa Adenilat kinazei (ATP + AMP = 2ADP)

3. Prezenţa Nucleozid fosfokinazei - care transformă nucleozidele în nucleotide, creând premizele obţinerii unei diversităţi de compuşi mocroergici.

Funcţiile matricei mitocondriale

1. Ciclul acidului citric (ciclul acizilor tricarboxilici, ciclul Krebs)

2. β-oxidarea acizilor graşi

3. Biosinteza proteinelor

4. Replicarea şi transcrierea ADN mitocondrial

Analizele proteomice (proteomia – “proteomics” – se defineşte ca disciplină comună biochimiei şi biologiei celulare care se ocupă cu studiul proteinelor dintr-un tip celular, sau dintr-o structură celulară au evidenţiat faptul că celulele umane conţin în mitocondrii cam 1500 de proteine diferite. Dintre acestea, doar maxim 1% sunt codificate de sistemul genetic propriu al mitocondriei. Celelalte proteine sunt codificate de ADNul din nucleul celulelor, sunt sintetizate ca precursori în citosol şi sunt importate prin mecanisme specifice, care se desfăşoară în principal post-traducere.

Funcţiile membranei mitocondriale interne

1. Transportul de metaboliţi

2. Lanţul transportor de electroni (lanţul respirator)

3. Producerea de ATP

4. Cooperarea dintre lanţul respirator şi ATP sintază

1. Mitocondria musculara se schimba la varstnici

2. Mitocondria la adultii tineri sanatosi raspunde diferit la cerinta de energie decit cei mai in varsta

3. Mitocondria la adultii tineri sanatosi se adapteaza si creste rapid cerintele de energie

4. Ca rezultat mitocondrii multiple produc mai mult Adenozin-trifosfat (ATP) pentru energie

5. Cu inaintarea varstei se reduce numarul de mitocondrii pentru a produce energie

Disfunctia mitocondriala si deteriorarea mitocondriala ADN-ului de radicalii liberi la varstnici

- Scaderea eficientei cilului krebs datorita modificari ca raspuns la cererile de energie pe termen lung,

participarea mitocondriei la procesele apoptotice, prin participarea pe calea cascadei caspazelor. Caspazele sunt principalii efectori în moartea celulară programată.

Cele mai frecvente anomalii constau în reducerea dimensiunilor, cu sporirea densităţii matricei, modificare denumită picnoză mitocondrială.

Dacă în celulele normale mitocondriile sunt dispersate în toată celula, în celulele apoptotice ele se redistribuie, aglomerându-se perinuclear.

Rezultatul este dezorganizarea membranelor mitocondriale cu eliberarea în citosol de

componente intramitocondriale (citocrom c, endonucleaze G, AIF – “Apoptosis-Inducing Factor”). Prezenţa citocromului c în citosol este un semnal de evoluţie apoptotică a celulei.

. Maladii mitocondriale – Distonia, Sindromul Leight

Disfuncţiile mitocondriale au fost semnalate

- în unele maladii degenerative,

- în diferite forme de cancer

- în procesul de îmbătrânire

Distonia

- Afecţiune ereditară determinată de o mutaţie punctiformă în structura genei ND6 – procent ridicat de copii mutante.

Simptome – apar la vârste timpurii

- persoanele afectate prezintă - tulburări generalizate ale mişcărilor

- dificultăţi de vorbire

- retardare mintală

- statură mică

- degenerarea ganglionilor bazali ai creierului

Sindromul Leight

- Cauzat de o mutaţie punctiformă în structura genei ATP6

- Dacă procentul de copii mutante este mai mic de 75% apar

- Tulburări musculare

- Pigmentare retiniană

Dacă procentul de copii mutante este mai mare de 95% boala poartă numele de sindrom Leight – se instalează timpuriu, frecvent letală

Simptome - întârzierea dezvoltării, atrofie optică

- oftalmoplegie (paralizia musculaturii extraoculare a ochiului)

Cloroplastele

ORIGINE

Cloroplastele, de altfel ca şi toate plastidele au apărut acum 1,5 miliarde de ani ca bacterii autotrofe, cel mai probabil au fost cianobacterii, care au intrat în simbioză cu organisme unicelulare eucariote, asemănându-se astfel mitocondriilor, care au apărut la fel în urma unei simbioze cu o celulă eucariotă. Membrana internă a cloroplastelor reprezintă membrana a vechilor cianobacterii, iar membrana externa a apărut în urma simbiozei cu celula eucariotă.

LOCALIZARE

Cloroplastele pot fi întâlnite la toate celulele vegetale, reponsabile cu fotosinteza. O celula tipică parenchimatică conţine în jur de 10-100 cloroplaste. Cloroplastele pot fi unite între dânsele prin mici punţi, numite stromule.

Cloroplastele sunt observabile morfologic ca nişte discuri plate, cu un diametru de 2-10 micrometri şi o grosime de 1 micrometru. Cloroplastul este învelit de o membrană dublă fosfolipidică, între care există spaţiu intermembranar. Înăuntru există un mediu apos, numit stromă, care este sediul reacţiilor în timpul fazei de întuneric. În cadrul stromei există saci aplatizaţi, numiţi tilacoizi, unde este localizată clorofilă, mai mulţi tilacoizi formând un granum.