Replicarea ADN

CE ESTE REPLICAREA ADN?Biosinteza ADNAre loc astfel nct s fie asigurat stabilitatea genetic n organism i n cadrul speciei (este o modalitate specific de biosintez care permite conservarea i transmiterea informaiei genetice de la o generaie la alta).

Cnd i unde are loc replicarea ADN?

Faza S a cicluluicelularNucleuLa eucariote replicare are loc doar n faza S, de sintez, a cicluluicelular, faza separat de faza mitotic M prin perioadele de gol (gap) sintetic G1 i G2.

REPLICAREA ADN PE SCURTDublul helix al ADN se desface i se construiesc pe fiecare dintre cele dou catene parentale (numite catene matri sau template) cte o caten complementar replica celor parentale.

Replicarea cu ceva mai multe detalii1. Dublul helix se desface.2. La jonciunea dintre cele dou catene parentale desfcute ianatere bifurcaia de replicare.

3. O nou caten se formeaz prinmperecherea nucleotidelor liberecu bazele complementare de pecatena veche.

4. Rezult dou molecule-fiice de ADN care conin cte o catenParental i o caten nou.

semi-conservativ completbi-direcional (dei are loc ntotdeauna n direcia 5 3 !!!)semi-discontinu CARACTERISTICILE REPLICARII ADN

1. Replicarea ADN este semi-conservativ (Meselson-Stahl, 1958).Fiecare molecul fiic de ADN conine o caten parental intact asociat cu o caten nou sintetizat.

Meselson & Stahls Famous Experiment (1958)

2. Replication este completReplicarea ADN antreneaz ntregul cromozom, rezultand doi cromozomi identici.Cromozom circular (procariote)

3. Replicarea ADN este bi-direcional (Cairns, 1963).

Replicarea ncepe ntr-un punct bine determinat numit origine de replicare (ori) i pornind din acest punct se deruleaz simultan n ambele direcii.bidirecional

4. Replicarea este semi-discontinu

Reiji Okazaki a propus i demonstrat n 1968 c n timp ce sinteza unei catene (catena leading) este continu, sinteza celei de-a doua catene (catena lagging ) este discontinu (n runde de 150-250 nt).

ntrebare:Urmtoarele afirmaii n ceea ce privete replicarea ADN sunt corecte:Replicarea se realizeaz pe anumite poriuni din cromozom.Sinteza ADN pe catena lagging este continu.Fiecare moleucl fiic de ADN conine dou catene nou sintetizate.Fiecare caten a ADNdc acioneaz ca matri/template pentru o nou caten de ADN.

Elementele eseniale necesare replicrii Sunt necesare cinci elemente esniale :

ADN parental- matria (fiecare caten de ADN servete ca matri)cele 4 dezoxiribonucleozid trifosfai dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)cele 4 ribonucleozid trifosfai NTP (ATP, GTP, UTP, CTP); aceasta sugereaz necesitatea sintezei de ARN n cursul sintezei de ADN!!!Proteine specifice, majoritatea enzimeMg2+

Proteine specifice implicate n replicare

Enzimele implicate n replicarea ADN

Helicaza desface dublul helixProteina DnaB Hexamer Catalizeaz un fel de denaturare in vivo a ADN (catenele dezrsucite pot fi citite de ctre enzimele replicrii)necesit energie; consum 2 molecule de ATP per 2 legturi de hidrogen desfcute.

Single stranded proteins (SSBs) TetramerSe leag de cele dou catene ADN i le menine separate prevenind renaturarea lorTrebuie s fie ndepartate nainte ca noua caten de ADN s poat fi sintetizat

Topoisomerazeleenzime care rezolv tensiunile sterice (torsiuni +, de dreapta) aprute n cursul dezrsucirii (cu o vitez de 100 revoluii/sec !!!) duplexului ADN, i care ar putea bloca replicarea

Clase de topoizomeraze: topoizomeraza I acioneaz ca o endonucleaz reversibil, printr-un mecanism de tiere-coasere care permite rotaia liber a ADNmc (aciune de suveic) .economic (nu necesit aport energetic): hidrolizeaz o legtur fosfat diesteric a crei energie o conserv ntr-o legtur fosfat esteric implicnd Tyr din centrul activ al enzimei i ulterior o folosete la refacerea catenei incizate

tiererelaxarecoasere

Clase de topoizomeraze: topoizomeraza II ADN-girazaDimerIntroduce n molecula de ADN supertorsiuni (-), spre stnga, n sens contrar celor create de naintarea bifurcaiei de replicare; astfel compeseaz n avans constrngerile impuse de desrsucirea duplexului de ADNNecesit energie (consum de ATP)

ADN polimerazele-ADN dependente: Copiaz catena matri n direcia 3 5

Sintetizeaz catena nou n direcia 5 3: formeaz legturi fosfat diesterice ntre dou dNTP vecine dictate de template, prin atacul nucleofil realizat de ctre gruparea 3-OH al primului nucleotid asupra gruprii fosfat din dNTP urmtor)

Necesit un primer deoerece nu poate initia sinteza unei catene noi (ARN-ul sintetizat de primaz servete drept primer)

AUTO-CONTROL: Au activitate 3' -> 5' exonucleazic, care st la baza capacitii de autocontrol sau de PROOF-READING: desface nucleotidele greit mperecheiate de la captul 3 al catenei n cretere.

PROCESIVITATE (Procesivitatea este capacitatea polimerazei de a se menine legat de matri; este o expresie a numrului de nucleotide adugate la lanul ADN n cretere nainte ca polimeraza s se disocieze de matir)

PPPPPPPPPPCH2CH2CH2OHOHOOOBaseBaseBaseCH2CH2CH2OHOOOBaseBaseBaseCap 5' Cap 3 (n cretere)3'5'3'H20+REACTIA CATALIZAT DE ADN POLIMERAZPiro-fosfat

Clase ADN polimeraze -ADN dependente: procariote: ADN pol I, II, III, IV, V

eucariote: - ADN pol , , , ,

Proprietile ADN polimerazelor la procariote

Este ADN polimeraza I polimeraza replicativ principal?

DNA polimeraza I nu este polimeraza replicativ principal!Enzima este prea lent! ADN polimeraza I catalieaz ncorporarea dNTP cu o vitez maxim de 20 nt/sec: ar avea nevoie de 53 zile pentru a replica integral cromozomul E.coli, care n realitate se divide la fiecare 20 min. Enzima nu este suficient de procesiv. Enzima este prea abundent. Exist aproxiamtiv 400 molecule de ADN polimeraza I per celul E.coli i doar 2 bifurcaii de replicare per celul. Celulele prezentnd mutaii polA1 sunt viabile.

DNA polimeraza III este polimeraza replicativ

Proprietile ADN pol III sunt potrivite pentru o enzim care deine un rol central n replicarea ADN: are o procesivitate foarte mare i catalizeaz polimerizarea la o vitez foarte nalt (250-1000 nt/sec).Sinteza catenei leading.

Care este rolul ADN polimerazei I ?La ce folosete activitatea 5-3exonucleozic, specific acestei polimeraze?

La ce folosete activitatea polimerazic a ADN pol I ?

ndeprtarea primerului de la captul 5 al lanului n cretere

Sinteza catenei lagging, nlocuirea cu dNTP a locului lsat liber de primer i repararea leziunilor ADN (ex. leag dNTP pe locul liber aprut dup ndeprtarea baze greit mperechiate)

ADN polimerazele la procariote (continuare)ADN pol II este implicat n reparea leziunilor ADN (are activitate 3'->5 exonucleazic.

ADN pol IV- Pol IV este o ADN polimeraz predispus la erori de mperechere (nu are activitate de proof-reading ca la pol III, pol II i pol I) - Pol IV este responsibil de 50% din mutaiile adaptative.

ADN pol V- Pol V aparine unei ci speciale de reparare (un fel de ultima barier) denumit calea SOS de reparare a ADN.- Pol V este sintetizat cnd celula este expus la doze mari de radiaii sau de mutageni, cnd pot s apar lez. majore ADN.

Proprietile ADN polimerazelor la eucariote

Primaza: Sintetizeaz oligoribonucleotidul (ARN primer) iniial pe care se ataeaz ADN polimeraza.

ARN primer este format din 4-12 ribonucleotide.

Noua caten de ADN se constuiete prin adugarea de nucelotide la captul 3 al ARN primer.

- ARN primer e nlocuit n final cu ADN.

ntrebare:ADN polimeraza:A. Initiaz sinteza lanului polinucleotidicB. Sintetizeaz un lan polinucleotidic n diercia 3- 5 C. Citete matria de ADN n direcia 5- 3D. Produce cte o molecul de pirofosfat la adugarea fiecrei nucleotide la catena n cretere.

ETAPELE REPLICRII ADN(i elementele-cheie ale fiecrei etape)Iniierea: primozomul- un complex de proteine i originea replicrii ori Elongarea: replizomul- un complex de proteine, asociate cu ADN cu rol n sinteza catenelor noi de ADNTerminarea: proteina Tus- situsul de terminare ter

REPLICAREA ADN LA PROCARIOTE

1. INIIEREA

controleaz ntregul proces de replicare!

Iniierea replicrii Identificarea originii de replicare

Dezrsucirea mediat de ctre helicaz (denaturarea) duplexului ADN cu fomarea ADNmc i a bifurcaiilor de replicare

Legarea SSB la ADNmc

Formarea primozomului (conine i primaza)

Sinteza ARN primer

Originea replicriiOriginea replicrii (oriC) este o regiune de 245 perechi baze bogat n ATOriC este recunoscut de ctre proteina dnaA care se leag la oriC, i care mpreun cu proteina dnaB (helicaza) desface ADNdc (folosind ATP).

Primozomul- elementul cheie al iniierii-Primozomul este un complex de proteine care este format din:- dnaB (helicaz)- dnaC (aperon al dnaB: asist plicaturarea dnaB)- primaza- alte proteinePrimozomul se deplaseaz mpreun cu bifurcauia de replicare, consumnd ATPPrimozomul este responsabil pentru sinteza ARN primer.

2. ETAPA DE ELONGARE

Etapa de elongare Sinteza de ADN prin adugarea de dezoxiribonucleotide (una cte una) iniial la captul 3 al ARN primer, ulterior la captul 3 end al catenei n cretere.

Etapa de elongare Catena parental 3- 5 (care este citit n aceei direcie cu deplasarea bifurcaiei de replicare) este copiat continu.Catena nou astfel sintetizat este catena leading.

Etapa de elongare -Catena parental 5- 3 (care este citit n direcie opus fa de deplasarea bifurcaiei de replicare) este copiat discontinu.Catena nou astfel sintetizat este catena lagging i este sintetizat n fragmente mici (1fragment per rund sintez)-fragmentele Okazaki

Replizomul- elementul cheie al elongarii-complex de proteins care cuprinde toate enzimele i factorii necesari replicrii ADN. Probabil ataat de membrana nuclear, iar ADN ar strbate replizomul.este responsibil pentru sinteza a dou catene noi de ADN.

Schema etapelor de iniiere i elongareOkazaki fragment

3. ETAPA DE TERMINARE

Terminarea replicriiRegiunea de terminare : - situat la 180 grade fa de ori; conine capcane petur bifurcaia de replicare- la acest nivel bifurcaiile de replicare se ntlnesc i dezleag catenele de ADN nc asociate.

Situsurile de terminaresunt pori care permit trecereabifurcaiei de replicare ntr-unsingur sens; - conin 23 perechi de bazeTerDTerCTerBTerA

Situsurile Ter foreaz cele dou bifurcaii de replicare s se ntlneasc ntr-un punct specific.

ReplicareaHelicaza se leag la originea de replicare i dezrsucete dublu helixul ADN.

ReplicareaDNA pol adaug nucleotide la ARN primer.

ReplicareaDNA pol verific bazele mperecheate i le nlocuiete pe cele greit mperecheate.

ReplicareaSinteza catenei leading continu n direcia 5 to 3.

Replicarea Sinteza discontinu produce segmente ADN numite fragmente Okazaki.

Replicarea 5 5 5 35 3 3 5 3Direcia de avansare a bifurcaiei de replicare 3Alungirea fragmentului Okazaki.Okazaki fragment

Replicarea 5 5 3 5 3 35 3 3 5 5 3Alungirea catenei leading i sinteza de noi fragmente pe Okazaki msur de bifurcaia mai avanseaz.

Replicarea 3 5 3Alungirea noului fragment Okazaki, n paralel cu alungirea catenei leading .

ReplicareaActivitatea exonucleazic a ADN pol I ndeprteaz ARN primer.

ReplicareaActivitatea polimerazic a ADN pol I umple golurile.Ligaza formeaz legturi fosfatdiesterice ntre gruparea 3 OH de la captul unui fragment Okazaki cu gruparea 5 fosfat de la captul altui fragment Okazaki. .

Topoisomerase nicks DNA to relieve tension from unwinding2314567Pol III synthesises leading strandHelicase opens helixPrimase synthesises RNA primerPol III elongates primer; produces Okazaki fragmentPol I excises RNA primer; fills gapDNA ligase links Okazaki fragments to form continuous strandREPLICAREA ADN

ntrebare:Fragmentele Okazaky sunt:Produsul aciunii helicazeiLanuri ADN sintetizate n cadrul catenei leading n cursul replicrii Regiuni ale ADN care nu codific informaie pentru sinteza de ADN.Fragmente relativ scurte de polidezoxiribonucleotide cu cteva ribonucleotide la captul 5.

Replicarea simultan prin formarea de bucle ale matriei catenei lagging.

Replicarea simultan: molecula ADN pol III este responsabil de sinteza ambelor catene de ADN.

Caracteristici ale replicrii la eucarioteMultiple origini de replicareReplicarea este bidirectionalAre mai multe origini de replicare deoarece molecula de ADN este foarte lung i viteza de aciune a replizomului este micHistonele vechi se asociaz cu duplexul nou care conine catena leading.

Multiple regiuni ori la eucariote

Tabel comparativ:

Phosphodiester bonds