Biotehnologii in Agricultura Note de Curs

8/9/2019 Biotehnologii in Agricultura Note de Curs

1/118

Primarevolutie verde, initiata dupa cel de al doilea razboi mondial

de Norman Borlaug pentru a incerca sa rezolve o parte dinprobleme grave ale nutritiei omenirii .Cercetari dezvoltate in Mexic, India si Filipine la

Grau, orez, porumb, sorg, mei etc.

A doua revolutie verde = Biotehnologiile moderne


2/118


3/118

Ultima oar cnd s-a murit de foame n Europa Occidental a

fost la sfritul anilor 1840. Dezastrul a fost disproporionatde mare n Irlanda, unde au murit de foame n jur de un milionde oameni i nc un milion au emigrat n America. EuropaContinental nu a scpat nici ea, unii istorici considernd caceast foamete, care a afectat n special pturile srace alepopulaiei i din cauza creia au murit n jur de o sut de miide oameni, a fost pictura care a declanat revoluiile de la1848.


4/118

Ultima oar cnd s-a murit de foame n Europa de Est a fost

dup al doilea rzboi mondial, cnd guvernele comuniste, nplin perioad de secet, n lupta lor contra lcomiei celorcare ncercau s fac profituri vnznd mncare, au introduscontroale ale preurilor la produsele agricole, efectul fiinddispariia de pe pia a produselor agricole. Din cauzapoliticii economice comuniste, ncepnd din 1945 produciaagricol a Romniei a sczut brusc la 38%, iar n 1947dezastrul a lovit din nou Romnia, aproximativ 30.000 depersoane murind de foame, dup o relativ prosperitate deun secol.


5/118

Ultima oar cnd s-a murit de foame n China a fost n

1958-1961, cnd au murit ntre 30 i 40 de milioane deoameni, victime colaterale ale Marelui Salt nainteUltima oar cnd s-a murit de foame n Africa a fost ieri.

Aproximativ 25 de mii de oameni mor de foame n fiecarezi n zonele srace ale lumii .


6/118

Dac n 1943 Mexicul importa jumtate din cerealele folosite, n 1956 a devenit autosuficient, iar din 1963 a devenitexportator. n 1961, Borlaug s-a mutat mpreun cu familia nIndia, care la momentul respectiv era n pragul foametei. Caurmare a muncii lui Borlaug, ntre 1965 i 1970 producia degru a Indiei i a Pakistanului aproape s-a dublat, iar cea deorez a crescut i ea n mod considerabil, fermele desubzisten de orez fiind nlocuite cu tehnici moderne.


7/118


8/118

8000BC

1900Landraces

1930Purelineselection

1950Crossbreds

2010Biotech-nology

1995Indica/ Indica

hybrids

2005Indica/

Tropical japonica

hybrids

1965 1990 2000Newplanttype

Semidwarfs(IR8) (IR72)

14

12

10

8

6

4

2

0

Potential yield (t/ha )

From Green to Gene Revolution in Rice

Public Sector Public-Private Sector


9/118


10/118

Ce sunt biotehnologiile?

Biotehnologie provine din doi termenibio deriv din grec.bios = viaa

tehnologia studiul mainilor i uneltelor(termen utilizat inca de Plutarh si Cicero)


11/118

Definitie

Biotehnologia este o tiin inginereasc, pluridisciplinar,ce utilizeaz materia vie pentru degradarea, sinteza iproducerea de materiale noi utilizate n activitile umane.

Foloseste microorganisme, enzime, structuri celulare si subcelulare,biocatalizatori, tehnici de inginerie genetica etc.


12/118

Biotehnologiile clasice

Babilonienii cunosteau din sec. VI iHr. modul de preparare a beriisi transformarea alcoolului etilic in acid acetic (otet)

Sumerienii (sec III iHr.) cunosteau tehnica fabricarii a peste 20 de

tipuri de bereMajoritatea popoarelor antice foloseau drojdiile pentru fabricareaunor produse alimentare (paine, vin, bere) si bacterii pentruobtinerea derivatelor lactate


13/118

Scurt istoric8000 Hr nceputurile agriculturii (cartoful prima plant

cultivat)

4000-2000 Hr Primele aplicaii ale biotehnologiilor(fabricarea pinii i berii) Mesopotamia i Egipt

500 Hr - n China, este descoperit efectul antibiotic al culturilorde mucegai, acesta fiind utilizat ulterior n scop terapeutic


14/118

Scurt istoric1595 - Hans Janssen construiete primul microscop.

1663 - Robert Hooke a descoperit o structur rectangular pecare a numit-o celul.

1665 - Antoni van Leeuwenhoek devine prima persoan din lumecare a observat celule bacteriene.


15/118

Scurt istoric

1859 - Charles Darwin a publicat teoria revoluionar aevoluiei1866186618661866 Gregor Mendel a descoperit regulile careguverneaz mo tenirea genetic

1913 StudiindDrosophila melanogaster , Thomas Hunt Morgana descoperit o serie de legi ale ereditii.1909 sau 1919 s-a utilizat pentru prima oar termenulbiotehnologie.


16/118

Scurt istoric1953 Pe baza analizei cristalografice cu raze X a luiRosalind Franklin, JamesWatson i FrancisCrick descriumodelul ADN1958 Este sintetizat pentru prima oar ADN n eprubet.

1961 USDA nregistrez primul biopesticid - Bt1963 Prima revoluie verde1970 Norman Borlaug - Premiul Nobel pentru Pace.1971 Prima sinteza a unei gene1976 Primul act normativ privitoare la ADN recombinant


17/118

Scurt istoric1976 - Genentech, prima companie modern de biotehnologie

1982 Insulina uman recombinanta devine primul medicamentobtinut prin biotehnologie1983 Kary Mullis i colaboratorii si dezvolt PCR(polymerase chain reaction)1986 Prima aprobare pentru testarea n cmp a PMG1990 Porumbul Bt1994

Prima aprobare pentru consumul uman - FDA


18/118


19/118

Prioriti pentru biotehnologiile moderne

Prioriti

- asigurarea necesarului de hran- producerea de medicamente- tratament pentru cele 3000 de boli ereditare- combaterea efectelor polurii etc.


20/118

Evolutia populaiei240.000 ani 10.000 locuitori

4000 iHr. - 30 milioane1 dHr. - 210 milioane1900 - 1.650 milioane2009 - 6.8 miliarde2014 - peste 7 miliarde


21/118


22/118


23/118

rank country area sq.km. population (16.09) yearly growth daily increase population today

World 510,072,000 7,257,175,868 1.10% 215,060 7,257,390,928

1. China 9,596,960 1,395,717,615 0.61% 22,966 1,395,740,581

2. India 3,287,590 1,270,865,772 1.24% 42,367 1,270,908,1393. USA 9,826,630 323,182,268 0.81% 7,085 323,189,3534. Indonesia 1,919,440 253,532,864 1.21% 8,297 253,541,1615. Brazil 8,511,965 202,417,002 0.85% 4,649 202,421,6516. Pakistan 803,940 185,806,215 1.66% 8,289 185,814,5047. Nigeria 923,768 179,460,046 2.78% 13,223 179,473,2698. Bangladesh 144,000 158,857,249 1.19% 5,118 158,862,3679. Russia 17,075,200 142,465,272 -0.21% -834 142,464,43810. Japan 377,835 127,014,246 -0.08% -293 127,013,953

11. Mexico 1,972,550 124,124,887 1.21% 4,055 124,128,94212. Philippines 300,000 100,434,623 1.71% 4,618 100,439,241

Num rul de locuitori (16.09.2014)

http://www.geohive.com/earth/population_now.aspx

56565656 RomaniaRomaniaRomaniaRomania 237,500237,500237,500237,500 21,630,26721,630,26721,630,26721,630,267 - ---0.26%0.26%0.26%0.26% ----155155155155 21,630,11321,630,11321,630,11321,630,113


24/118

Source: C.S. Prakash, Center for Plant Biotechnology Research, Tuskegee University, Alabama

Declinul cresterii productiei agricole

Developing countries World Developed countries0

1

2

3

P e r c e n

t a g e p e r y e a r

196719821982199419952020

Benefits of biotechnology More food


25/118

Ponderea populatiei pe continente


26/118

Distribuia contribuiei la creterea populaieipn n 2020

South America 8%Africa 35%

Asia 51%

Former Soviet Union 0%

Europe 0%NorthAmerica 5%

Benefits of biotechnology More food


27/118

Consumul de calorii n lume


28/118


29/118


30/118

Tendinte actuale in agricultura

Masuri diversificarea cultivarelor si a speciilor

cultivateIntroducerea biotehnologiilor(10% din necesarul de forta de munca din agriculturapentru producerea aceleiasi cantitati de proteine)

Fixarea azotului atmosferic


31/118

Valorificarea solurilor saraturoase

Prevenirea efectelor toxice ale pesticidelor(anual la cele 200 mii de produse chimice se adauga 1-2 mii noi, 1 mil

intoxicatii acute- 20 mii morti)

Folosirea biotehnologiilor in ameliorarea plantelorSchimbarea treptata a tuturor modelelor de productiePromovarea conceptului de dezvoltare durabilaModificarea legislatiei privitoare la OMG


32/118


33/118


34/118


35/118

Raportul dintre plantele transgenice si cele non-transgenice


36/118

M Acres

346

247

198

99

148

49

0

297

396

91

64%0

20

40

6080

100

120

140

160

Soybean Cotton Maize Canola

Conventional

Biotech

35

43%

148

24%

27

20%

Source: Clive James, 2008

Global Adoption Rates (%) for Principal

Biotech Crops (Million Hectares) 2007


37/118

Raportul dintre plantele transgenice si cele non-transgenice


38/118

Suprafee cultivate cu OMG (mil. ha)

ar 2011 2012 2013 Plantele cultivateSUA 69,0 69.5 70,1 Porumb, soia, bumbac, rapita, papaya,

lucerna, sf. de zahr

Brazilia 30,3 36,6 40,3 Porumb, soia, bumbac

Argentina 23,7 23,9 24,4 Porumb, soia, bumbac

India 10.6 10,8 11.0 Bumbac

Canada 10.4 11.6 10,8 Porumb, soia, rapi , sfecl de zahrChina 3.9 4 4.2 Bumbac, plop, rosii, petunii, ardei, papaya

rile UE 2011 2012 2013 Plantele cultivateSpania 0.1 0.1 0.1 Porumb

Portugalia


39/118


40/118


41/118


42/118

Ingineria genetica


43/118

Porumb actualTeosinte

What is plant biotechnology?


44/118


45/118


46/118


47/118


48/118


49/118


50/118

EUROPA Sectorul agroalimentar al Comunitatii Europene ocupa un loc major pe piataglobala, fiind, in acelasi timp, un producator, exportator si importator de alimente.Comunitatea Europeana prezinta un interes vital pentru asigurarea unor produsealimentare de calitate ridicata, larg acceptate de consumatori, a caror sanatate esteprotejata in acest mod.

Pe baza modelului USFDA, a fost stabilit un cadru de lucru pentru regimul desiguranta al alimentelor in Europa. Legea pentru infiintarea autoritatii in domeniu,

European Food Authority (EFA), a fost aprobata de catre Ministerele Consiliului siParlamentului European.

Summit-ul European de la Nissa (decembrie 2000) a impus ca EFA sa fieoperationala din 2002. Autoritatea este o entitate legala separata, independenta de alteinstitutii ale Comunitatii.

SARCINILE EFA EFA are 6 sarcini principale:


51/118

SARCINILE EFA - EFA are 6 sarcini principale: Furnizeaza opinii stiintifice independente (pentru aspectele de sigurantaalimentara, nutritie, sanatate/bunastare a animalelor, sanatatea plantelor,organisme modificate genetic) la cererea Comisiei, Parlamentului European(PE), Statelor Membre sau organismelor nationale pentru alimentatie in scopulacordarii suportului pentru managementul riscului; Furnizeaza opinii asupra aspectelor de tehnologie alimentara pentru asprijini dezvoltarea reglementarilor si legislatiei problemelor de siguranta influxul alimentar; Colecteaza si analizeaza datele asupra modelelor dietetice , expune articoledin programele monitorizate si orice alte date relevante pentru orice riscpotential in vederea monitorizarii sigurantei de-a lungul lantului alimentar inUE; Identificarea si avertizarea timpurie a riscurilor potentiale; Functionarea unui sistem de alertare rapid care acopera atat alimentele, catsi furajele; Comunica publicului general toate sarcinile care i-au fost alocate .


52/118

This is the official website of the "CommunityReference Laboratory for GM Food and Feed" that hasbeen established in the context of Regulation No (EC)1829/2003 on GM Food and Feed.The core task of the CRL is the scientific assessmentand validation of detection methods for GM Food andFeed as part of the European Commission authorisation

procedure. The Joint Research Centre (JRC) of theEuropean Commission and - more precisely - theBiotechnology and GMOs Unit within the Institute forHealth and Consumer Protection, has been given themandate for the operation of the CRL.

It does so in collaboration with a European Network ofNational Control Laboratories, assembled in theEuropean Network of GMO Laboratories (ENGL).The Community Reference Laboratory for GM Foodand Feed operates according to a quality managementsystem fulfilling the requirements of standard ISO9001:2000 and ISO 17025:2005. http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/default.htm


53/118

ROMANIA este prima tara din Balcani care a stabilit legea organismelor modificategenetic. Ordonanta Guvernului nr. 49/2000 a stabilit infiintarea Comisiei Nationalepentru Securitate Biologica (CNSB), care a fost abilitata sa puna in aplicare dispozitiilelegislatiei nationale si internationale referitoare la regimul activitatilor care implicautilizarea organismelor modificate genetic prin tehnicile biotehnologiei moderne, numaidupa avizarea scrisa, emisa de Punctul Focal National.

UNGARIA detine cea mai restrictiva lege, care reflecta toate pozitiile principale aledirectivelor UE in domeniul organismelor modificate genetic.


54/118

Avizeaz i controleaz Agen ia Na ional pentru Protec iaConsumatorilor

Avizeaz i controleaz Ministerul S ntii

Avizeaz i controleaz Ministerul Agriculturii i Dezvolt riiRurale

Emite o concluzie tiin ific

Avizeaz

Comisia Na ional pentru Securitate

Biologic (autoritate tiin ific)

Emite autoriza ii/acorduri, controleaz ,informeaz i consult publicul, solicit avize celorlalte autorit i.

Ministerul Mediului

Atribu iiOrganismele implicate n reglementare n

Romnia (Legea 214/2002)


55/118

Citoplasma

Nucleu

ADN

Dogma centrala a geneticii

ARN

Proteina

Replicatie

Transcriere

Translatie

ADN-ARN-proteine


56/118


57/118

Caracteristicile codului genetic


58/118

.

Caracteristicile codului genetic

1. UNIVERSAL - in toate organismele aceeasi codonicodifica aceeasi aminoacizi.

2. NEACOPERIT / NESUPRAPUS - 2 codoni vecini nu aunucleotide comune.

3. FARA VIRGULE - nu exista spatii libere intre nucleotide sinici alte semne de punctuatie.

4. DEGENERAT - un acelasi aminoacid poate fi codificat demai multi codoni.

5. AMBIGUU - un anumit codon poate sa includa mai multetipuri de aminoacizi intr-o proteina in functie de pozitia lui

in catena.


59/118


60/118

PlasmidPlasmidBacterianBacterian


61/118

Pentru modificarea genetica a plantelor este nevoie de:

- gene de interes;- metode care sa permita patrunderea si integrarea transgenelor in nucleulcelulei care va fi la originea unei noi plante;- selectia plantelor in care transgena se exprima la un nivel adecvatscopului urmarit (toleranta la erbicid, rezistenta la atacul unui daunatoretc.).

Structura unei gene


62/118

Secventa codificatoareINTRON poly A signalPROMOTOR

Structura unei gene

intrerupator Sinteza proteinei Semnal stop


63/118


64/118

Transcriptia


65/118

TranscriptiaPrin intermediul ARN polimerazei se sintetizeaza o molecula de ARN m

complementara

DNA coding strand

DNA template strand

DNA5

3

5

3

G T C A T T C G G

C A G T A A G C C

G

RNA

5

GG U C A U U C3

Translatia


66/118

Procesul citirii ARN mesager si transformarea informatiei in proteinese numeste translatie

Transcriptie

Codon Codon Codon

Translatie

ADNT T C A G T C A G

ADN

ARNm

A A G U C A G U C ARNMesenger

Proteine Lizina Serina ValinaPolipeptide(amino acid

sequence)


67/118

Constructia unei transgene


68/118

Secventa codificatoareINTRON poly A signalPROMOTOR

Gena de interes

Gene bacterieneantibiotic markerreplication origin

Gena marker pentru

selectia plantei

Plasmid ADNConstruct

intrerupator Sinteza proteinei Semnal stop


69/118

Transgeneza presupune parcurgerea a trei etape:- pentru identificarea, izolarea si clonarea genelor de interes;- transferul genelor de interes la plantele de cultura ;- selectia plantelor care exprima, la un nivel optim, caracterul transferat

si testarea acestora in camp pentru evaluarea stabilitatii expresieitransgenei in timp, in conditii naturale.

Identificarea si izolarea genei de interes


70/118

Etapele realizarii unui construct


71/118

p


72/118


73/118


74/118


75/118


76/118

Principalele metode utilizate pentru transferul genelor de interes

METODE INDIRECTE TRANSFORMAREA MEDIATA1. Transformarea mediat de bacterii:

Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes 2 2. Transformarea mediat de virusuri

METODE DIRECTE 1. Metoda biolistics mpu carea direct a ADN n celule

2.Transformarea protoplastelora.Microinjectarea

b.Electroporareac.Sonicarea

3. Electroforeza 4. Utilizarea fibrelor de carbur de siliciu


77/118


78/118

A. rhizogenes

A. tumefaciens


79/118


80/118

Eficiena transformrii variaz foarte mult de la o specie la alta n funcie de:- identificarea metodei optime de cultur a esutului int- condiiile de cultur a materialului surs

- sua bacterian utilizat.Aceti factori afecteaz inumrul de copii de ADN-Tcare se integreaz n

genomul vegetal receptor. Predominant s-a constatat, la diferite specii deplante, integrarea unei singure copii de ADN-T. Mai recent, cercetrile au vizatdescifrarea mecanismelor implicate n colonizarea esuturilor vegetale de ctrebacterii, relevndu-se noi detalii privind controlul genetic al viruleneibacteriene .


81/118

Agrobacterium rhizogenes a fost utilizat pentru prima oar pentru transformareaplantelor de tutun n anul 1977.- transfernd ADN-T de pe plamida Ri determin formarea r dcinilor firoase pediferite organe ale plantelor, r dcini care pot purta gene de interes, dac acesteaau fost integrate n ADN-T, respectiv pot regenera plante transformate genetic.- O etap intermediar , n procesul de transformare mediat de A. rhizogenes , estecultura r dcinilor firoase care au capacitatea de a se alungi i ramifica. Astfel,prin cultura r dcinilor firoase se pot ob ine metaboli i secundari sau pot firealizate studii fundamentale privind cre terea i dezvoltarea r dcinilor. Acest

sistem experimental este foarte potrivit i pentru analize biochimice, r dcinileprezentnd c i biochimice mai simple i, deci, mai u or de analizat. R dcinilefiroase pot fi cultivate u or, folosind un echipament simplu i ieftin iar, comparativcu suspensiile celulare, celulele radiculare sunt stabile din punct de vederegenetic.


82/118

A. rhizogenes poate co-tranfera ADN-T de pe plasmida Rii un vector binar, de obicei o plasmid mai mic.Aceasta din urm poate purta n ADN-T o gen marker, deexemplu o gen care confer rezisten la un antibiotic, ogen raportoare - sau marker pentru vizualizare fenotipici o gen cu importan economic. Avantajul acestuisistem este acela c cele dou tipuri de ADN-T, cel caredetermin dezvoltarea rdcinilor firoase, i ADN-T de pevectorul binar, se integreaz de obicei pe cromozomidiferii n plantele transformate i deci, vor segregaindependent n descenden. Un avantaj aparte alsistemului de transformare Ri este faptul c toate celulelevegetale care integreaz ADN-T de pe plasmida Ri pot fiuor identificate i selectate prin prezena fenotipului derdcin firoas.


83/118

Sistemul a fost aplicat unui mare numr de specii de plante (n jur de 200 nc n 1989),rspunsul optim variaz n funcie de specie, genotip sau suabacterian . Organele vegetale potrivite pentru transformarea cu A. rhizogenes

sunt:fragmente de tulpin de la plante tinere, fragmente de peiol, fragmentefoliare, segmente de hipocotile sau cotiledoane, sau fragmente ale unororgane de rezerv cum ar fi rdcinile de morcov sau tuberculii de cartof.Uneori astfel de explante prezint un rspuns polar, formnd rdcini firoasenumai la una din extremele explantului, rdcini capabile s ignore foragravitaional. Mai mult, exist date experimentale care sugereaz efectul depiticire a plantelor indus de una dintre genele de virulen, rolA, de la A.rhizogenes, efect cu importan practic mai ales pentru unele plante horticole


84/118


85/118


86/118

Metoda discurilor pentru transformarea mediata de Agrobacterium


87/118

Photographs by Dr. Paul Bottino

Pregatirea discurilor Co-cultivarea cu Agrobacterium Selectia transformantilor

Regenerarea Aclimatizarea in sera


88/118

Transformarea mediat de virusuri

Utilizarea vectorilor virali pentru transformarea plantelor, n ciuda

numeroaselor eforturi experimentale, nu a adus rezultate spectaculoase . De i, n1984 a fost posibil transferul unei gene de rezisten a la antibiotic cu ajutorul unuivirus ADN cercet rile ulterioare au demonstrat c genomul viral nu poateaccepta i transfera fragmente mai lungi de ADN str in. Descoperirea faptului c virusurile ARN pot genera ADN prin transcrip ie invers a generat speran a c,mult mai numeroasele virusuri ARN ar putea fi utilizate ca vectori de genepentru celula vegetal . Din p cate, ns , s-au ntmpinat alte dificult i. ADNviral nu se integreaz n genomul vegetal iar meristemele, principala surs decelule totipotente, nu sunt infectate de virusuri. De aceea, vectorii virali sunt mai

rar utiliza i n experimentele de transformare genetic a plantelor.

METODE DIRECTE DE TRANSFORMARE


89/118

1. Metoda biolistics mpu carea direct a ADN n celule

Metoda biolistic (biolistics) sau particle gun, de mpu care direct aADN n esuturi int este cea mai spectaculoas metod de transformaregenetic a plantelor. Metoda const n accelerarea unor particule foarte mici(1m diametru) din tungsten, wolfram sau aur coloidal, pe care a fost

precipitat ADN, n esuturi vegetale int.


90/118

Aceast tehnic are numeroaseavantaje- este o metod uor de aplicat,- printr-o mpuctur pot fi intite mai multe celule,- celulele supravieuiesc dup mpucare,- genele purtate de particule i pstreaz activitatea biologic,- particulele pot fi mpucate n straturile superficiale sau n profunzimea unuiorgan vegetal.Celulele intpot fi foarte diferite: polen, celule n suspensie, embrioni imaturi,

celule din esuturi difereniate sau chiar meristeme.A permis transformarea cu succes a unor plante pentru care alte metode nu

au dat rezultate cum ar fi:soia, porumbul, ovzul, orezul, sorgul, trestia dezahr, grul, plante forestiere etc.

O aplicaie aparte a fost utilizarea mpucrii de microproiectile pentrurnirea apexurilor la floarea soarelui, eficientiznd astfel transformareamediat deAgrobacterium tumefaciens . Mai mult, s-a reuit mpucareadirect n esuturi vegetale a celulelor bacteriene ntregi


91/118


92/118

BioRad Particle Gun

Helios Gene Gun


93/118

2. Utilizarea protoplastelor pentru transferul direct de ADN Protoplastele, celulele vegetale lipsite de perete celular, reprezint limita de

expresie a totipoten ialit ii. De la primele plante de tutun regenerate din protoplastei l i l l l di l d i


94/118

izolate pn astzi num rul plantelor pentru care regenerarea din protoplaste a devenitposibil a crescut permanent, ajungnd actualmente la aproximativ 400 de specii deplante.

Protoplastele sunt sistemele celulare ideale pentru transferul de ADN i selec iatransforman ilor. Indep rtarea peretelui celular elimin principala barier n caleaptrunderii ADN str in n celula vegetal . Izolarea enzimatic a protoplastelorac ioneaz ca un factor de stress care induce reac ii de r spuns la r nire reac iipresupuse a declan a starea de competen att de important pentru transformarea

eficient . Mai mult, suspensia de protoplaste se aseam n cu o suspensie bacterian avand avantaje similare prin posibilitatea de a cultiva popula ii mari de celuleindividuale n medii de cultur bine definite. Tesuturile derivate din protoplaste au ngeneral origine clonal provenind din celule individuale. Eficien a selec ieitransforman ilor este deci maxim n cazul protoplastelor deoarece se evit formareade himere , destul de frecvente la nivelul sistemelor multicelulare. Pentru transferulADN, de obicei plasmidial, n protoplastele izolate se pot utiliza diferite metode, ianume:


95/118

a. Microinjectarea const n introducerea cu ajutorul unei micropipete a

ADN direct n protoplaste , acestea fiind fixate cu o alt micropipet .Microinjectarea celulei vegetale ntregi sau a esuturilor este, de asemeneaposibil , dar se realizeaz mai greu din punct de vedere tehnic. Un sistemeficient a fost utilizat mai recent i const n imobilizarea protoplastelorrecipiente de tutun ntr-un strat foarte sub ire de mediu solidificat cu agaroz sau alginat. Protoplastele au fost imobilizate deasupra unei grile care a permislocalizarea i monitorizarea prin fotografiere a protoplastelor microinjectate,respectiv a celulelor sau calusurilor derivate din acestea.

Microinjectarea


96/118

b. Electroporarea implic

permeabilizarea reversibil

a membranei plasmatice nprezen a unor pulsuri de curent continuu avnd amplitudine crescut i durat foarte


97/118

implic permeabilizarea reversibil a membranei plasmatice nprezen a unor pulsuri de curent continuu avnd amplitudine crescut i durat foartescurt , porii forma i n membran permi nd intrarea ADN str in n citoplasm .Electroporarea a devenit o metod de rutin pentru transformarea protoplastelorvegetale, dar i pentru celulele de mamifere sau bacteriene.La plante, electroporarea protoplastelor se folose te eficient pentru transformareapermanent la numeroase specii de plante incluznd cerealele. Mai mult, prinelectroporarea protoplastelor se elimin necesitatea utiliz rii unor gene marker, ceeace reprezint un avantaj deosebit n condi iile oponen ei acerbe a opiniei publice

fat de eliberarea n cmp a unor plante purtnd gene marker.Avantajele electropor rii constau n-eficien a crescut a incorpor rii ADN str in,-reproductibilitatea ,-simplitatea acestei metode.Singura limitare a aplic rii electropor rii o reprezint capacitatea de regenerare a

protoplastelor, dar i acest dezavantaj a fost dep it prin extinderea aplic riielectropor rii celulelor sau chiar esuturilor ntregi

Electroporarea


98/118


99/118

c. Sonicarea permeabilizarea membranei protoplastelor n prezen a

ultrasunetelor s-a dovedit, de asemenea o metod eficient pentru transferulADN n protoplaste vegetale. Ulterior metoda a fost aplicat i celulelor sauesuturilor ntregi, dar este utilizat pe scar mai redus comparativ cuelectroporarea

l b


100/118

Rezultate obtinute prin sonicare


101/118

3. Utilizarea fibrelor de carbur de siliciu (silicon carbide technology)Fibrele de carbur de siliciu se utilizeaz n industrie. Transformarea

genetic prin aceast tehnologie este relativ simpl , constnd n vortexarea


102/118

g p g p ,(agitarea) esuturilor mpreun cu ADN i fibre de carbur de siliciu. Astfel, fibrelepenetreaz pere ii celulari permi nd ADN s ptrund n citoplasm .

Metoda a fost aplicat ini ial transform rii embrionilor de insecte, iar

ulterior s-a dovedit eficient i n transformarea celulelor vegetale. Cercet rile demicroscopie electronic au relevat penetrarea peretelui celular de c tre astfel defibre, sugernd c ADN ader de suprafa a fibrelor i este introdus odat cu acestea

n celul . Avnd propriet i fizice asem ntoare azbestului fibrele de carbur de

siliciu sunt probabil carcinogene . Transformarea genetic a fost raportat folosindaceast tehnologie pentru suspensii celulare de porumb, ov z, tutun i Agrostis alba . Transformarea stabil a fost, de asemenea posibil folosind suspensii celularede porumb i tutun. Datele ob inute au indicat transformarea preponderent aaglomeratelor celulare neembriogene la porumb, de aceea se impun cercet riulterioare pentru optimizarea acestei metode. Metoda prezint avantajul de a fifoarte simpl i ieftin , dar datorit riscurilor poten iale pentru s ntatea uman secaut materiale alternative, eventual biodegradabile .


103/118

Alte metode de transfer direct al ADN n celulele vegetale :- mbibarea ADN n esuturi utiliznd semin e uscate sau embrioni,- transformarea polenului sau a tubului polinic,- macroinjectarea ADN n esuturi s- utilizarea microlaserului pentru a perfora peretele celular iplasmalema.

Astfel de metode se afl , actualmente, n diferite faze de experimentare.De un interes deosebit, se vor bucura metodele alternative care nunecesit faze de cultur in vitro . O astfel de metod , cu poten ial deosebiteste transformarea gr uncioarelor de polen, dar deocamdat rezultatele

n acest domeniu sunt relativ modeste

Agent de selec ie Gena marker Marker de selec ie

kanamicin , neomicin geneticin (GA18)

nptII (APH3II) neomicinfosfotransferaza II

gentamicin aacC3 , aacC4 gentamicin-3-N-acetiltransferazahigromicin hph, hpt (APH4) higromicin-fosfotransferaza


104/118

g p , p ( ) g

metotrexat dhfr dihidrofolatreductaza

spectinomicin ADNr16S aadA

ARNr 16Saminoglicozid -3-adeniltransferaza

streptomicin SPT

ADNr 16SaadA

streptomicinfosfotransferazaARNr 16Saminoglicozid -3-adeniltransferaza

bleomicin , fleomicin ble -

blasticidin bsr blasticidin S deaminaza

sulfonamid sul dihidropteratsintaza

fosfinotricin bar fosfinotricinacetiltransferaza

clorsulfuron als, csr-1 acetolactatsintetaz

bromoxinil bxn bromoxinilnitrilaza

glifozat EPSPS 5-enolpiruvil-3-fosfatsintetaza

2,4-D tfdA 2,4-diclorfenoxiacetat monooxigenaza

atrazin psbA proteina Q B

2,2-DCPA dehalogenaza

4-metil-triptofan tdc triptofandecarboxilaza

nitrat NR nitratreductaza

S-amonoetil-L-cistein DHPS dihidropicolinatsintetaza

lizin /treonin AK aspartatchinaza

aminoetil-cistein ocs octopinsintetaza

Dintre genele marker cel mai mult a fost utilizat gena nptII sau neo gen izolat din


105/118

Dintre genele marker cel mai mult a fost utilizat gena nptII , sau neo , gen izolat dintranspozonul Tn5 de la Escherichia coli K12. Aceast gen codific neomicinfosfotransferaza enzima implicat n detoxificarea unor antibiotice

aminoglucozidice cum ar fi: neomicina, kanamicina, paramomicina sau geneticina .Numeroase specii de plante au fost transformate cu gena nptII , cum ar fi tutunul,cartoful, Arabidopsis , porumbul, orezul, soia, bumbacul .Pentru aceast gen ca agen i de selec ie se utilizeaz cel mai mult kanamicina (50 100 mg/l) sau geneticina. Unele specii de plante, mai ales monocotiledonate s-audovedit insensibile la kanamicin , n acest caz geneticina dnd rezultate mai bune. Deasemenea, s-a observat c la unele specii kanamicina poate interfera cu procesele deorganogenez , afectnd eficien a regener rii plantelor transformate.


106/118

Genele raportoare , nu confer celulelor rezisten fa de unanumit compus. Ele codific proteine care pot fi detectate directsau catalizeaz reac ii specifice ai c ror produ i pot fi detecta iprin metode relativ simple. Genele raportoare permit studiulfactorilor de transcrip ie cis sau trans , n condi iile transform riitranziente sau permanente, precum i monitorizarea ioptimizarea tehnologiei de transformare.

( d ) difi l id (GUS) i f t i l t d l E


107/118

gena gus (uidA) codific-glucuronidaza (GUS) i a fost izolat de la E.coli K12; este gena raportoare cel mai mult utilizat la plante. Existpentru aceast hidrolaz compui substat pentru evidenierea prin metodespectrofotometrice, fluorimetrice sau histochimice la nivelul esuturilorrezultnd un compus de culoare albastr uor de evideniat. La pH-ulutilizat pentru determinarea GUS nu exist activitate-glucuronidazicdetectabil n nici un esut vegetal. Toate metodele de determinare seaplic ns, numai celulelor fixate, nonviabile.

gena raportoare luc pentru enzima luciferaz folosete un sistem substrat-

enzim care produce bioluminescen. Genaluc a fost izolat de laospecie de licurici din America de Nord, Photinus pyralis, fiind exprimat nplante. Produsul genei, luciferaza poate fi extras din esuturi iaractivitatea ei poate fi determinat n prezena luciferinei. Dar, exist i ometod de determinare non-letal i neinvaziv direct n esuturile iorganele plantelor transformate, pentru msurarea bioluminescenei fiindnecesar un luminometru.

gena gfp pentru proteina cu fluorescen verde (GFP) reprezint cea mainou gen raportoare i totodat cea mai spectaculoas i avantajoas.


108/118

nou gen raportoare i totodat cea mai spectaculoas i avantajoas.Gena a fost izolat de la o meduz,Aequarea victoria , fiind transferat lacteva specii de plante. GFP prezint o serie de avantaje i anume:nunecesit un substrat, proteina se evideniaz n esuturi intactein vitro i invivo

, prin excitarea n UV, proteina poate fi fuzionat cu alte proteinepermind monitorizarea traficului proteic i a metabolismului. gena cat izolat de laE. coli, codific enzimacloramfenicolacetiltransferaza (CAT), fiind, de asemenea, mult utilizat cagen raportoare la plante. Determinarea sa este mai pretenioasbazndu-se pe monitorizarea acetilrii cloramfenicolului prin marcarea cu14C fie a acetil-CoA, fie a cloramfenicolului, produii fiind separai princromatografie n strat subire (TLC) i msurai prin densitometrie sau prinscintilaie. Uneori poate exista activitate CAT i n unele esuturi vegetale,mai ales laBrassicaceae , ceea ce afecteaz eficiena acestui sistem.

Antocianii sunt pigmen i ro ii sau purpurii care se acumuleaz n vacuole

n unele esuturi ale plantelor. Sinteza de antociani este controlat de genestructurale i reglatoare, unele dintre ultimele gene fiind izolate i clonate.


109/118

g , g Astfel de gene pot fi utilizate ca gene raportoare n esuturile i organele unorgenotipuri care con in gene structurale dar nu sintetizeaz antociani. Utilizareaantocianilor ca markeri prezint o serie de avantaje: nu necesit un substrat,se exprim doar n celulele viabile i metabolic active, sunt u or devizualizat . Cel mai mult s-au utilizat genele pentru factorii de transcrip ie R iC1 de la porumb.

Genele care confer rezisten la streptomicin i/sau spectinomicin au fost, de asemenea, utilizate ca gene raportoare prin efectul de etiolare pecare l au, prin inactivarea cloroplastelor.


110/118

Pierderile cauzate de diferiti factori (% din productiapotentiala)


111/118

6315

1413

Productia realizataBoliInsecte

Buruieni


112/118

Ponderea diferitelor caractere obtinute prin

transgeneza in cadrul suprafetelor total cultivatecu PMG (2014)


113/118

58

24

28

Toletanta la erbicide(TE)Rezistenta la insecte(RI)TE/RI

cu PMG (2014)


114/118


115/118

Cartof ce sintetizeaza fructan - Giessen


116/118

Carto ara amiloza (Am lora)BASF2008 -155 ha


117/118


118/118

Biotehnologii in Agricultura Note de Curs

Documents

Transcript of Biotehnologii in Agricultura Note de Curs