Termenul biomarker este acceptat în ultimii ani, deși are încă o definire inconsistentă. Biomarkerii sunt oricare din răspunsurile biologice la o substanță chimică la nivel individual sau o îndepărtare a organismului de starea normală a organismului.

Clasificare a răspunsurilorbiologice : biochimice, fiziologice, histologice, morfologice și comportamentale -biomarkeri.

Anumite exemple de biomarkeri la nivele diferite de organizare sunt arătate în tabelul 10.1. Răspunsurile biologice la nivele de organizare superioare nivelului individual (populație, comunitate și ecosistem ) – sunt considerate ca bioindicatori. Totuși, din punct de vedere al importanței, unele răspunsuri sunt considerate, în general, biomarkeri specifici. Relația dintre biomarkeri și bioindicatori privind specificacitatea și relevanța ecologică este arătată în figura 10.1. În general, se poate spune că este dificil de descris modificările ecologice (chiar dacă subțierea cojii ouălor la unele specii de păsări este cauzată de p,p'-DDE ,iar imposex ul la crabi de TBT), întrucât și schimbările fiziologice sunt legate de schimbarea masivă a populației.

Clasificarea biomarkerilor Au fost propuse mai multe clasificări ale biomarkerilor. Mai frecvent utilizată

este împărțirea în acestora în două tipuri de biomarkeri: de expunere; de efect. Biomarkerii de expunere -răspunsuri care indică expunerea organismului

la substanțe chimice, dar nu dă nicio informație asupra nivelului efectelor adverse pe care acestea le cauzează.

Biomarkerii de efect sau poate, mai corect, efectele toxice (din cauză că toți biomarkerii prin definiție produc un astfel de efect) -răspunsuri care induc efecte adverse demonstrate asupra organismului.

Conceptul de biomarker se bazează pe modificările parametrilor fiziologici arătate în figura 10.2.  

Modificarea stării de sănătate a unui individ, odată cu creșterea timpului de expunere la o substanță chimică este indicată printr-o curbă dreaptă, plecând de la o stare de sănătate complet reversibilă la schimbările ireversibile care pot conduce la moarte. Punctele de tranziție pe traseul acestei căi sunt:

organismul să fie anterior stresat, funcțiile sunt afectate, iar organismul, deși stresat, este capabil să compenseze acest

stres, organismul nu este capabil să compenseze un timp îndelungat, schimbările sunt reversibile, iar îndepărtarea stresului permite însănătoșirea organismului, punctul r -schimbările sunt ireversibile și în final moartea.

Specificitatea biomarkerilor  Împărțirea biomarkerilor în specifici și nespecifici este necesară întrucât efectele

asupra sistemului imunitar pot fi cauzate de o varietate largă de poluanți. O listă a biomarkerilor în funcție de gradului lor de specificitate este dată în tabelul 10.2.

Biomarkerii specifici, cât și cei nespecifici au o valoare importantă în evaluarea hazardelor. Ex. prin probele de sânge ale unei păsări maritime-este determinată activitatea ALAD (dehidrogenaza acidului aminolevulinic), astfel fără alte măsurători, se determină procentul păsărilor maritime expuse intoxicațiilor cu plumb. determinarea ALAD nu aduce nicio informație despre alți poluanți care pot fi prezenți în mediu.

Inhibiția AChE poate fi utilizată pentru a furniza dovezile legale ale morții provocate de pesticidele organofosforice și carbamate, o astfel de acțiune inhibitorie fiind considerată specifică la aceste clase de poluanți chimici. Totuși, în ultimii ani, evidențele au indicat că inhibiția AChE este cauzată și de alte pesticide. Payne (1996) stabilește depresia activității AChE la pești mai mare de 50% și consideră că în acest caz poate fi implicat un complex de poluanți. Astfel, Guillermino și col. (1998) a arătat că detergenții și metalele pot inhiba activitatea AChE și sugerând că utilizarea acestei enzime ca biomarker poate fi extinsă.

Inducerea monooxigenazelor - o mare varietate de substanțe chimice -constituie un indicator sensibil al prezenței poluanților. Aceasta este o indicație obișnuită prin care organismele afectate de poluanți dau slabe informații asupra cauzei specifice. În acest caz, biomarkerul are valoare de studiu secundară din cauză că poluanții trebuie să fie prezenți la un nivel destul de ridicat pentru a provoca un efect detectabil.

Biomarkeri specifici Inhibiția esterazelor Monoxigenazele Studiile asupra materialului genetic Porfirinele și sintezele hemului Inducerea vitelogenului Inhibiția esterazelor AChE este utilizata ecotoxicologic a-special -indică locul lor de acțiune al ST- nivelul lor indică inhibarea corelat

cu efectele toxice. Butiratcolinesteraza (BuChE) -studiată în anumite situații în paralel cu AChE-rolul său este necunoscut și nivelul de inhibare nu este atât de ușor de corelat cu efectul toxic. Studiul neuropatiilor provocate de esteraze , a căror interacțiune cu compușii organofosforici (OP) poate conduce la întârzierea influxului nervos, a fost limitată la studiile de laborator. Modul lor de acțiune este binecunoscut și a fost arătat anterior.

La vertebrate-inhibiția AChE cerebrale -utilizată la stabilirea cauzelor morții produse de către pesticide carbamate (Mineau, 1991). În condiții ideale, inhibiția în procent de 50-80% poate fi luată drept dovadă a mortalității provocate de pesticide. În practică, nivelul poluarii este adesea necunoscut, și de aceea un control adecvat este greu de obținut. De asemenea, inhibiția carbamaților este foarte ușor reversibilă și se poate pierde cu ușurință după moarte. determinarea OP-urilor și a carbamaților este mai dificilă rapid metabolizați și eliminați; de fapt, analizele chimice ale nivelelor reziduale nu au fost larg utilizate în diagnosticul intoxicațiilor produse de acești compuși.◦ esCreierul - organul cel mai des folosit ca probă la vertebratele sălbatice, întrucât acesta este

principalul loc de acțiune al OP-urilor și carbamaților. Cu toate că folosirea inhibării AChE și BuChE serice sunt mult mai acceptabile, întrucât inhibarea AChE cerebrale este mult mai complexă. Studiile au arătat că variabilitatea activității esterazei este mult mai mare în plasmă decât în creier și de aceea refacerea activității AChE serice este mult mai rapidă decât a celei din sistemul nervos și, astfel, diagnosticul bazat pe activitatea serică a AChE este dificilă.

 

◦ Creierul - organul cel mai des folosit ca probă la vertebratele sălbatice, întrucât acesta este principalul loc de acțiune al OP-urilor și carbamaților. Cu toate că folosirea inhibării AChE și BuChE serice - mult mai acceptabilă, întrucât inhibarea AChE cerebrale este mult mai complexă. Studiile variabilitatea activității esterazei este mult mai mare în plasmă decât în creier și de aceea refacerea activității AChE serice este mult mai rapidă decât a celei din sistemul nervos și, astfel, diagnosticul bazat pe activitatea serică a AChE este dificil de pronunțat.

 Monoxigenazele Sistemul monooxigenazelor este cuplat la sistemul de transport ionic compus din două

enzime, citocromul și flavoproteina (NADPH-citocrom reductaza). Sistemul este elaborat de reticulul endoplasmatic al multor organe, dar activitatea este mult mai ridicată în ficat decât în multe alte țesuturi

Reacțiile citocrom P450 I-dependente, includ N-oxidarea și S-oxidarea; activitățile enzimatice frecvent studiate includ monooxigenazele: etoxiresorufin O-deetilaza (EROD), hidroxilaza benzopirenică (BePH) și hidroxilaza aril hidrocarbonică (AAH).

Oxidările dependente de citocromul P450, includ hidroxilarea aromatică, hidroxilarea aciclică, dezalchilarea și dezaminarea. Cea mai larg studiată activitate enzimatică este cea a N-demetilazei benzfetaminică și a epoxilazei aldrinică.

Prima demonstrație a efectului pesticidelor organoclorurate asupra metabolismului hepatic microzomal fost făcută acum peste 30 de ani-rezultate neașteptate la șobolani cărora în perioada de somn li s-a administrat fenobarbital după ce ascunzătorile lor au fost pulverizată cu clordan -a dus la stimularea activității microzomale hepatice, medicamentul fiind metabolizat enzimatic -constatare rapid extinsă și la organoclorurate , PCB-urile, PCDT-urile și PCAD-urile+largă varietate de compuși de interes pentru mediu, organofosforicele, piretroidele și hidrocarburile policiclice aromate (PAH).

Conceptul inducerii activității monooxigenazelor la pește, cu scopul monitorizării poluării mediului maritim prin uleiuri (petrol), a început a fi aplicată pe la mijlocul anilor '70. Așa s-au obținut date despre inducerea activității aril hidrocarbon hidroxilazei (AAH) la ieșirile apei menajere în Los Angeles la pești sau inducerea activității etoxiresorufin O-deetilazei (EROD) la peștii din apele efluenților fabricilor de hârtie din Suedia.

Inducerea monooxigenazelor de către afluenții fabricilor amintite a constituit unul din cei mai sensibili biomarkeri pentru tratarea acestui tip particular de poluare.

Utilitatea monooxigenazelor în monitorizarea biologiei mediului a fost clar demonstrată în cazurile poluării cu substanțele amintite, răspunsul acestora fiind cauzat de o mare varietate de substanțe chimice și, de aceea, se poate spune că sistemul este menit să detecteze o expunere suficient de mare pentru a produce un răspuns biologic la foarte multe xenobiotice. Chiar dacă despre agentul cauzal se află puține lucruri, poate fi folosit pentru delimitarea ariei de acțiune a acestuia, ceea ce este folositor în timp și prin începerea altor investigații detaliate.

Rolul fundamental al ADN în procesele de reproducție este binecunoscut, acest aspect fiind utilizat la evaluarea daunelor produse ADN-ului de către poluanții de mediu care au efecte genotoxice specifice, în special creșterea carcinogenezei și, mai puțin efecte asupra proceselor reproductive

există o succesiune de evenimente care au loc între prima interacțiune a xenobioticului cu ADN-ul și mutația consecutivă acesteia, împărțite în patru stadii. Primul stagiu este formarea adiției prin punți de legătură. În următorul stadiu pot fi sesizate modificări secundare ale ADN-ului, fie o modificare de suprafață, fie o mărire a procentului de reparație. Al treilea stadiu este atins atunci când perturbările structurale ale ADN încep să fie realizate. În acest stadiu, celulele afectate prezintă alterări funcționale. Unul din cele mai largi teste utilizate pentru măsurarea aberațiilor cromozomiale este schimbul de cromatide surori. La final, când celulele se divid, distrugerile cauzate de substanțele toxice pot conduce la crearea de ADN mutant și, consecutiv, alterării în funcționarea genelor.

Au fost utilizate două moduri diferite de abordare la studierea adiției de ADN după expunerea la poluanți:

Marcarea radioactivă -folosind 32P conduce la separarea adițiilor și gruparea lor prin cromatografie bidimensională în strat subțire.

Tehnici specifice de identificare a adițiilor -incluzând spectrometria fluorescentă, tehnicile de cromatografie, și testul imuno-enzimatic -ELISA; tehnici care sunt sensibile și care pot detecta o adiție la un număr de 108 nucleotide normale.

Cele două tehnici dau informații diferite, prima contribuie la obținerea indexul numărului total de legături covalente, pe când ultima dă informații despre gradul actual al relației cu anumiți compuși specifici.

Monitorizarea formării adițiilor furnizează cel mai bun mijloc de a detecta expunerea la hidrocarburi aromatice policiclice (PAH). Stabilitatea ADN și adițiile formate la hemoglobină, de către această clasă de compuși toxici, sunt indicatori care evidențiază expunerea la ST, după ce acestea au dispărut din corp.

De fapt, aceste adiții formate la hemoglobină pot fi cel mai studiat mijloc posibil de test non-invaziv.

În SUA, au fost probate studii la pești și sedimente. Prin determinarea nivelelor PAH-urilor din sedimente și intestin au fost stabilite și proporțiile adițiilor xenobiotice – ADN din ficat măsurate prin 32P marcat.

Porfirinele sunt produse pe căile biosintezei hemului, un sistem vital pentru multe sisteme animale. Au fost studiate două tulburări majore ale biosintezei hemului:

formarea în exces a unei cantități de porfirine după expunerea la anumite organoclorurate (OC); inhibarea enzimei dehidrataza acidului aminolevulinic (ALAD).1.Biosistemele hemului sunt strâns reglate în mod normal, iar nivelul porfirinelor în mod curent este

foarte scăzut. Porfiria hepatică este caracterizată printr-o acumulare masivă a porfirinei în ficat și eliminarea prin urină a acesteia și a acidului porfirinic heptacarboxilic. Deși mecanismul inducerii porfirinei de către OC-uri nu a fost complet elucidat, se consideră în anumite lucrări că inhibarea enzimei uroporfirinogen decarboxilaza este cea mai veridică cauză. Cele mai implicate OC-uri în producerea maladiei sunt hexaclorobenzenul (HCB) și PCB-urile.

2. Dehidrataza acidului aminonolevulinic (ALAD) este o enzimă din calea de biosinteză a hemului. Inhibarea ALAD a fost studiată încă de acum 30 de ani, ca un mijloc de detectare a expunerii oamenilor la plumbul din mediu și a devenit un biotest standard din acest motiv, frecvent utilizat în investigațiile lumii sălbatice. Testul este foarte specific pentru plumb, alte metale fiind de 10 ori mai puțin active din cauza inhibării. La acestea, inhibiția ALAD este rapidă, dar efectul este slab exprimat, ALAD revenind la valorile normale numai după 4 luni.

Inhibarea ALAD a fost folosită ca un indicator al expunerii la plumb în probleme generale, fie în aria urbană, fie de-a lungul autostrăzilor, fiind de asemenea specifice studiilor păsărilor acvatice cu probleme legate de plumb. Diferențe de trei ori mai mari ale ALAD, au fost găsite între șobolanii din aria rurală și cei urbani în Michigan (Mouw și col., 1975). Cei mai importanți indicatori ai intoxicației cu plumb la șobolanii din mediul urban au fost creșterea în greutate a rinichiului și creșterea incidenței incluziunilor intranucleare. În același mod, s-a diferențiat activitatea ALAD la porumbeii din mediul rural, urban la nivel central și, respectiv, periferic, în zona Londrei (Hutton, 1980).

Testul ALAD este unul simplu, care poate fi realizat fără un echipament costisitor sau o pregătire de durată.

În concluzie, inhibiția ALAD este un biomarker sensibil, măsurat însă pentru un singur poluant al mediului, plumbul.

 

Descoperirea unor specii de pești hermafrodiți pe cursul unor râuri în apropierea scurgerilor de ape menajere a fost o țintă a cercetărilor, în scopul evidențierii efectului de distructiv al estrogenilor la pești, având în vedere că hermafroditismul natural are o incidență foarte scăzută. Examinarea acestui proces la pești a arătat că masculii au un nivel ridicat al vitelusului, care este în mod obișnuit produs numai de către femele, acesta fiind o proteină a gălbenușului oului.

Schimbările de comportament reprezintă un nivel evoluat de organizare al biomarkeri-lor, fiind considerat de către unii foarte greu de demonstrat.

Unii din cei mai apropiați partizani ai valorilor comportamentului toxicologic consideră că acest comportament al unui organism, reprezintă rezultatul final integrat al biochimiei și fiziologiei proceselor declanșate de ST. Astfel, un singur parametru comportamental este, în general, mult mai cuprinzător decât unul fiziologic sau biochimic. Cu toate acestea, biomarkerii comportamentului nu fac parte din procedeele de testare formale.

Există două dificultăți fundamentale ale testelor comportamentale ale toxicității viețuitoarelor din mediului sălbatic, astfel:

slaba relevanță pentru mediu întrucât se obțin și se cuantifică foarte repede, o rezistență foarte puternică împotriva schimbărilor la cele mai relevante

dintre comportamente (Peakall, 1985). Studii recente includ multe din efectele metalelor grele. Dacă cineva compară

efectele slabe ale concentrației observate (LOEC), obținute din studii comportamentale (apărare, atractivitate, ventilația la pești, rata bolilor) cu studii cronice (de toxicitate), stabilește că anumite teste comportamentale sunt mai sensibile. Aceste teste implicând evitarea prădării, comportamentul alimentar, învățarea, interacțiunile sociale și variate comportamente locomotorii, sunt încă insuficient studiate pentru a permite judecarea sensibilității și utilități acestora

Totuși, testele comportamentale pot furniza date reale despre relațiile dintre prădător și pradă, însă testele trebuie să fie validate în mediu.

Biomarkerii specifici au fost identificați în plantele sensibile -este cunoscut faptul că excesul substanțelor chimice specifice a adus o creștere a producției unui metabolit care diferă prin toleranță și sensibilitate.

În prezența unui exces al seleniului, plantele seleniu-sensibile încorporează Se în aminoacizii cu sulf, conducând la sinteza enzimelor cu activitate scăzută, care pot conduce la moartea plantelor. În contrast, plantele Se-tolerante biosintetizează și acumulează selenoaminoacizi nonproteici, precum seleno-cisteină și Se-metil-selenocisteină, care nu pot cauza probleme metabolice pentru plante. Astfel, selenoproteinele din plante sunt excelenți biomarkeri pentru Se stres, chiar dacă folosirea lor în mediu nu a fost frecvent reprodusă.

Un alt exemplu este o expunere la fluor în exces, produsă printr-un minereu conținând fluoruri plantele sintetizează fluoroacetil coenzima A și, apoi realizează convertirea, pe calea ciclului acidului tricarboxilic în fluorocitrat. Apoi , compusul blochează calea metabolică prin inhibiția enzimei aconitază. Ca un rezultat al acestui proces, acumulările de fluorocitrat constituie un biomarker demn de încredere pentru intoxicațiile cu fluor.

Există anumite plante biomarkeri pentru metalele libere. Fitochelații sunt sintetizați în perioada expunerii la un număr de metale și anioni, precum SeO4

2-, SeO42- și AsO4

3-. Relațiile doză-timp dependență au fost stabilite în condiții de laborator pentru Cd, Cu și Zn. Pentru aceste monitorizări, cercetările au nevoie de producția de fitochelatați din mediu.