Biochimie descriptivă / Biochimie și toxicologie - Curs 10 Proteinele. Nivele de organizare. Unul dintre cele mai interesante aspecte este elucidarea rolului biologic al unei

proteine, rol care presupune cunoaşterea proprietăţilor chimice şi fizice al lanțului polipeptidic.

Asemeni altor structuri polimerice proteinele pot fi studiate pe diverse nivele de organizare:

A. Structura primară constituie secvenţa de aminoacizi care intră în compoziţia proteinelor. Această secvenţă se poate obţine utilizând metoda de degradare Edman.

În ultimii ani spectrometria de masă (SM) a devenit o tehnică importantă pentru determinarea structurii primare a proteinelor.

B. Structura secundară este aranjamentul spaţial al lanţului polipeptidic fără a lua în considerare conformaţiile grupărilor din catena laterală (corespunzătoare resturilor aminoacizilor componenți).

C. Structura terţiară se referă la structura tridimensională a întregului lanţ polipeptidic, incluzând şi grupările laterale.

D. Structura cuaternară reprezintă aranjamentul spaţial al subunităţilor unei proteine.

Determinarea structurii primare Elucidarea structurii macromoleculelor constituie un pas important în stabilirea unor corelaţii între proprietăţile chimice ale biomoleculelor şi funcţia lor biologică. Tehnicile folosite în determinarea structurii compuşilor organici (RMN, UV-VIS, IR sau SM) sunt aplicate frecvent la studiul biomoleculelor, dar natura polimerică a acestor molecule necesită aplicarea unor procedee complementare de analiză. Frecvenţa unui tip de aminoacid, din cei 20(21) de aminoacizi posibili, diferă de la o proteină la alta. Din acest motiv, structura primară a unei polipeptide sau proteine poate fi elucidată numai după ce este determinată compoziţia în aminoacizi şi implicit secvenţa lanţului polipeptidic.

O varietate de strategii sunt utilizate de către eucariote pentru a direcționa proteinele sintetizate de la nivelul ribozomilor către nucleu, peroxiomi, mitocondrii sau cloroplaste. O secvență semnal este o secvență de 9-12 aminoacizi hidrofobi și uneori aminoacizi încărcați pozitiv. Această secvență este situată la capătul N-terminal al lanțului polipeptidic al proteinei biosintetizate. Prezența acestei secvențe semnal permite identificarea proteinei și certifică disponibilitatea acesteia de a străbate membrana reticulului endoplasmatic. Unele secvențe semnal se mențin în proteina “matură”, altele sunt scindate de enzime specifice în lumenul reticulului endoplasmatic.

Determinarea aminoacizilor de la capătul N-terminal al proteinelor se poate face prin reactia cu clorura de dansil (clorura de dimetilamino-naftil-sulfonil) în condiții alcaline. Metoda permite detecția unor concentrații mai mici de 1 nmol.

Degradarea treptată a lanțului polipeptidic (degradarea Edman) se poate face și prin reacția capătului N-terminal al lanțului proteic cu fenil izotiocianatul. Identificarea aminoacizilor scindați, sub forma unui derivat de fenil-tiohidantoina, se relizează după fiecare ciclu al degradarii Edman prin intermediul cromatografiei în strat subțire sau a separării cromatografice (HPLC).

Figura 1. Diagrama Ramachandran

Unele proteine au gruparea amino acetilată (anhidraza carbonică din eritrocitele umane), formilată, miristoilată (kinaza) sau cuplată cu un rest piroglutamil (peroxidaza din ridiche).

Determinarea aminoacizilor de la capătul C-terminal se realizează prin reacția cu hidrazina cu obținerea de hidrazide, compuși care pot fi separați prin cromatografie și identificați ulterior cu analizorul pentru aminoacizi.

Structura secundară

Lanţul polipeptidic principal al unei proteine se referă la atomii care participă în legăturile peptidice, cu excepţia celora aflaţi pe catena laterală a aminoacizilor compo-nenţi. Lanţul polipeptidic poate fi considerat a fi constituit dintr-o secvenţă de grupe peptidice planare. Astfel conformaţia lanţului polipep-tidic poate fi de aceea descrisă de unghiurile de torsiune (unghiuri diedrale sau de rotație) în jurul legăturii C- N () şi C- C () a fiecărui rest de aminoacid. Gradul de rotaţie în jurul acestor legături este constrâns de coliziunile dintre atomii de hidrogen amidici sau de substituenţii de la atomul C. Valorile permise ale acestor unghiuri ( și ) por fi calculate şi reprezentate printr-o diagramă Ramachandran (Figura 1).

Structurile -helix şi -pliată O serie de elemente din cadrul structu-rii secundare a proteinelor sunt întâlnite în proteinele care diferă prin secvenţa primară. Structurile -helix şi -pliată sunt numite şi structuri secundare regulate deoarece sunt compuse din secvenţe de reziduuri a căror unghiuri ( şi ) au valori care se repetă.

În elementul structural -helix (L. Pauling, 1951) legătura carbonil peptidică a reziduului n formează o legătură de hidrogen cu gruparea N-H a reziduului n+4. Substituenţii din catena laterală sunt proiectaţi descendent şi în exteriorul -helixului, evitând atât efectele sterice cu lanţul polipeptidic cât şi cu cei vecini. Interiorul helixului este strâns împachetat (atomii formează legături de tip van der Waals).

Procentul de structuri de tip -helix variază de la o proteină la alta. De exemplu, feritina (o proteină care fixează fier) are un conținut în -helix de aproximativ 75%. De obicei, -helixurile au o lungime mai mică de 45 Å. Există însă și situații în care 2 sau mai multe -helixuri se “împletesc” cu scopul de a forma structuri foarte stabile cu lungimi care pot atinge 1000 Å (miozina din mușchi, fibrina din cheagurile de sânge, keratina din păr). În citoscheletul celulelor se află așa numitele filamente intermediare care au în

componență 2 lanțuri de tip -helix. Alte proteine au porțiuni de -helix care sunt ancorate în membranele biologice.

În structura -pliată (1951, Pauling şi Corey) legăturile de hidrogen se desfăşoară între lanţurile polipeptidice vecine. Există 2 variante de structură pliată: antiparalelă (în care lanţurile polipeptidice implicate în legături de hidrogen au orientare diferită) şi paralelă (în care lanţurile polipeptidice implicate în legături de hidrogen au aceeaşi orientare). Structurile -pliate conţin de la 2 până la 22 de lanţuri polipeptidice, cu o medie de 6 lanţuri polipeptidice. Fiecare lanţ polipeptidic conţine maxim 15 resturi de aminoacizi. Structura -pliată antiparalelă este mai stabilă decât cea paralelă. Structura -pliată antiparalelă (sus) și paralelă (jos)

Conexiunea dintre lanţurile polipeptidice antiparalele dintr-o structură -pliată poate fi realizată printr-o buclă. În schimb, conexiunea dintre lanţurile paralele trebuie să fie în afara planului format de acestea. Acest element de legătură poate fi adesea format din mai multe reziduuri şi conţine -helixuri.

Segmentele cu structură regulată (-helix sau -pliată) sunt în mod normal îmbinate de porţiuni care-şi schimbă direcţia de orientare:

- “întoarceri reversibile” sau curbele (conectează lanţurile succesive din structurile -pliate antiparalele);

- buclele – localizate la suprafaţa proteinelor – au rol de recunoaştere în procesele biologice (enzimele – proteine speciale care acționează asupra unor molecule mai mici numite substrate pe care le “sechestrează” într-o cavitate numită situs activ).

Proteinele fibrilare Cheratina este o proteină foarte stabilă întălnită la vertebratele superioare (în păr, coarne, unghii şi pene). Difracţia cu raze X a demonstrat faptul că cele două lanţuri polipeptide ale cheratinei (fiecare având o structură de -helix) sunt răsucite unul faţă de celălalt spre stânga. - Cheratina este bogată în resturi de cisteină, care permit formarea legăturilor disulfidice între lanţurile polipeptidice adiacente. Colagenul-un triplu helix Colagenul este una din cele mai abundente proteine din vertebrate. Fibrele sale (puternice şi insolubile) intră în componenţa oaselor, dinţilor, cartilajelor, tendoanelor şi a matricilor fibroase ale pielii sau vaselor de sânge. O moleculă de colagen constă în 3 lanţuri polipetidice. Secvenţa de aminoacizi a unui lanţ polipeptidic de colagen constă în tripleţi Gli-X-Y (Gli = Glicina, X = prolina sau Pro, Y = 4-hidroxi-prolina, sau 5-hidroxi-

Structura -butoi (1234)

Motivul

lizina). Resturile de Pro previn formarea structurii -helix clasice (orientate spre dreapta) şi determină formarea unei conformaţii -helix (orientat spre stânga) care are în jur de 3 resturi de aminoacid pe pas. Cele 3 lanţuri paralele (de -helix) formează structura triplu-helică orientată spre dreapta şi conferă colagenului o stabilitate mărită.

Structurile supersecundare Structurile supersecundare sau motivele (grupuri de structuri secundare) sunt:

a. motivul în care un -helix face conexiunea dintre 2 structuri de tip ; b. motivul - structuri -pliate care au lanţuri antiparalele; c. motivul - alcătuit din două helixuri antiparalele; d. motivul cheii greceşti – în care o structură de tipul b. este formată din 4

structuri antiparalele; e. structurile -pliate extinse formează structuri de tip -butoi.

Motivul constituie unul dintre cele mai des întâlnite motive. Michael

Rossmann a propus faptul că o structură de tip , în care lanţurile formează un plan paralel cu conexiuni de-helixuri, poate forma un situs de legare al nucleotidelor. În marea parte a proteinelor care leagă dinucleotide (NAD+), două astfel de unităţi se combină formând un motiv cunoscut modul de împachetare de legare a dinucleotidelor sau modul de împachetare Rossmann. Lactat dehidrogenaza este un exemplu de astfel de proteină. În motivul -helixul constituie un segment care este aproape antiparalel cu cele două lanţuri (care sunt paralele între ele).

N

C

N

C

Structura deschisă (4312)

Există 2 clase de proteine /: - cele în care există 8 lanţuri răsucite paralele () în care -helixurile care fac

conexiunea se află în afara butoiului (structura butoi TIM, exemplu: TIM-triozfosfat izomeraza);

- o structură răsucită deschisă în care structura -pliată este înconjurată de helixuri situate pe ambele părţi ale structurii -pliate (exemplu: dehidrogenaza şi kinaza). Segmentul de legătură se află de aceeaşi parte a structurii şi este consecinţă tendinţei lanţurilor de a se roti spre partea dreaptă. Toate structurile închise de tip -butoi care au 8 lanţuri paralele prezintă 8 conexiuni (de tip -helix). 160 de aminoacizi au resturi echivalente din punct de vedere structural (8 lanţuri şi 8 -helixuri) în 15 proteine diferite (triozofosfat izomeraza, piruvat kinaza, Taka amilaza, fosfoglucoaldolaza, xilozizomeraza, gluconat oxidaza, muconat lactonaza, aldolazele, triptofan sintaza şi enolaza). Structurile deschise au de regulă între 4 şi 10 lanţuri . Carboxipeptidaza (proteină - o enzimă dependentă de Zn2+) catalizează hidroliza lanţului polipeptidic în capătul C-terminal (este îndepărtat ultimul aminoacid care are grupare –COOH liberă din lanțul proteinelor sau peptidelor) al proteinelor. Structura carboxipeptidazei este o structură de tip pliată mixtă în care 8 lanţuri şi -helixurile sunt orientate în ambele parţi ale structurii .

Structura terţiară Cunoaşterea structuriilor primare şi secundare ale proteinelor nu permite explicarea unor proprietăţi ale acestora (puterea catalitică şi specificitatea). Pentru o reacţie catalitică eficientă lanţul polipeptidic al proteinei (enzimei) trebuie să se împacheteze într-o manieră care să permită crearea unor situsuri (locuri) de legare a substratului. Marea parte a structurilor tridimensionale a proteinelor a fost elucidată prin intermediul cristalografiei cu raze X, tehnica ce dezvăluie informaţii la nivel atomic. Există şi tehnici (RMN-ul, dicroismul circular, schimbul izotopic, stingerea fluorescenței) care permit studierea structurii tridimensionale în soluţie.

Structura cuaternară Multe proteine există sub forma unor agregate de două sau mai multe lanţuri

polipeptidice care sunt identice sau diferite. Lanțurile polipeptidice diferite poartă denumirea de subunităţi, monomeri sau protomeri şi sunt în mod uzual notate cu litere. Subunităţile pot fi sub forma unor copii multiple ale unui singur lanţ polipeptidic (homomultimer) sau ele pot reprezenta lanţuri polipeptidice distincte (22 în hemoglo-

Structura -butoi a triozofosfat izomerazei (TIM)

bina umană, r6c6 în aspartat transcarbamoilaza). În ambele cazuri subunităţile se împachetează sub forma unor unităţi individuale distincte, posedând structuri secundare şi terțiare proprii.

Hemoglobina umană este un tetramer (22) Subunitățile (identice) sunt reprezentate cu fucsia Subunitățile (identice) sunt reprezentate cu galben

Molecula conține 4 structuri de hem reprezentate cu negru Subunităţile pot fi asociate prin intermediul forţelor necovalente: legăturilor de

hidrogen, punţilor de sare sau interacţiilor hidrofobe. Uneori intervin şi legături covalente (punţile disulfidice) între subunităţi diferite (vezi insulina). Asocierea dintre molecule necesită complementaritate fizică şi spaţială. Majoritatea proteinelor au evoluat în aşa manieră încât nu interacţionează cu marea parte a proteinelor cu care vin în contact.

Există numeroase exemple de proteine care posedă mai multe subnităţi. Proteinele se pot organiza sub formă de trimeri (proteina bacterioclorofiliană şi aldolaza KDPG), câţiva tetrameri (mangan superoxid dismutaza şi neuramidaza), pentameri (muconolacton izomeraza) sau chiar 17-meri (discul virusului tutunului).

Amsamblarea subunităţilor dintr-o proteină comparativ cu altele defineşte structura cuaternară a acesteia. Schimbările din structura cuaternară a unei proteine/enzime pot avea consecinţe dramatice în decursul actului catalitic (vezi modificările hemoglobinei care apar în boala numită siclemie).