169

SISTEMUL MUSCULAR

Anatomia muchiului

Exist 3 grupe distincte de muchi: scheletic, cardiac i neted. Muchiul scheletic este cel

mai studiat i posed un grad mare de regularitate structural. El const din fascicule paralele de

celule musculare cilindrice, neramificate, sau miotubi, fibre cu nuclei multipli ca un rezultat al

fuziunii mai multor celule singulare n timpul miogenezei. Fibrele ating lungimea total a

muchiului i dpdv microscopic prezint o bandare ncruciat caracteristic. Ele au plci terminale

nervoase bine definite i sunt sub control voluntar. Contraciile sunt iniiate prin impulsuri nervoase

i sunt denumite neurogenice.

Muchiul scheletic al vertebratelor este constituit din multe celule sau fibre, care sunt extrem

de lungi, paralele pe ntreaga lungime a muchiului. Celulele sunt multinucleate (Fig. 29.1).

Diametrul celulelor variaz de la 20 la 100 m, i n fiecare celul exist un fascicul de miofibrile

cilindrice, fiecare de aproximativ 1-2 m grosime. Miofibrilele sunt nconjurate de o reea extins

de canale tubulare, reticulul sarcoplasmic. Terminaiile nervoase sunt ataate suprafeei externe a

sarcolemei prin placa motorie terminal a axonului. n cadrul spaiului inclus n sarcolem fibrilele

sunt scldate de lichidul intracelular al muchiului, sarcoplasma. Sarcoplasma conine glicogen,

enzime glicolitice, ATP, ADP, AMP, creatin fosfat, creatin, electrolii anorganici, aminoacizi,

peptide, i numeroase alte componente celulare. Fibrele sau celulele muchiului sunt meninute

mpreun de esutul conjunctiv colagenic, care formeaz, la capetele muchilor, tendoane ntre

muchi i schelet. Muchiul exercit apoi aciunea sa asupra scheletului ca o prghie, fie ca un

flexor, fie ca un extensor.

n cadrul miofibrilelor materialul contractil este organizat n uniti repetitive, denumite

sarcomere. Sarcomerele sunt observate n microscopia optic ca o alternan de benzi luminoase i

ntunecate, ce conduc la striaii ncruciate caracteristice (Fig. 29.2). Modul de bandare este

determinat de materialul contractil organizat care formeaz 2 seturi de filamente, cu proprieti

optice alternante, denumite band anizotropic (band A) i band izotropic (band I),

respectiv. Materialul contractil organizat din cadrul fibrilelor este compus n mare din proteinele

miozin i actin ntr-o form filamentoas alternant n fiecare sarcomer. Miozina este n principal

n banda A, suprapunndu-se cu filamentele de actin care sunt localizate n principal n banda I.

Proteinele aflate n structura miofibrilar sunt listate n tab. 29.1.

Muchiul cardiac se afl numai n inim. El prezint o bandare ncruciat ca i muchiul

scheletic, dar celulele sunt ramificate i interconectate. Nu exist plci terminale definite n

170

muchiul cardiac, i n condiii normale el nu este sub control voluntar; aceasta nseamn c el nu

necesit nervi pentru a iniia i menine contracia sa i deci el este denumit miogenic.

Muchiul neted este compus din celule fusiforme, strmte, de aproximativ 2-4 m n

diametru, cu un singur nucleu. El nu prezint bandare ncruciat. Celula muscular neted nu are o

plac terminal definit structural i nu este sub control voluntar; deci el este definit muchi

involuntar. Muchiul neted se gsete de obicei n pereii tubilor sau sacilor ca de exemplu vasele de

snge, peretele uterului, vezica urinar, intestinele i bronhiolele. El este caracterizat prin contracia

lent i poate menine tensiunea sau o lungime dat fr oboseal la un cost energetic sczut.

Funcia

Mecanismul

Funcia general a muchilor este un rspuns mecanic la stimularea care produce scurtarea i

dezvoltarea forei, amndou producndu-se de obicei mpreun. Funcia muchiului scheletic este

modificat prin mecanismul cu prghii ca un rezultat al fixrii sale de schelet.

n muchiul cardiac dezvoltarea forei este manifestat prin dezvoltarea presiunii n cadrul

camerelor inimii n timpul scurtrii muchiului cardiac care determin o mrime redus a camerei.

Scurtarea muchiului neted este mai mult demonstrativ cnd sacii sau cavitile musculaturii

netede sunt golite, ca n cazul eliminrii urinei din vezica urinar sau a unui copil din uter. Este

evident c o for considerabil este dezvoltat n timpul unei astfel de activiti a musculaturii

netede.

Muchiul scheletic poate fi scurtat la cel mult o treime din lungimea sa original. Un model

denumit modelul alunecrii filamentelor este folosit pentru a explica contracia muscular n acest

sistem. Cele 2 filamente musculare discontinue aflate n sarcomere interdigiteaz i filamentele

groase i subiri alunec una fa de cealalt n contracie. n timpul acestei alunecri lungimea

sarcomerei scade deoarece cele 2 tipuri de filamente se suprapun mai mult n stare contractat.

Hidroliza ATP furnizeaz energia imediat pentru contracia muscular. Cantitatea de ATP

hidrolizat n contracie nu este constant dar depinde de durata contraciei i cantitatea de munc

exercitat de ctre muchi. Muchiul folosete mai mult ATP cnd ncrctura sa este mai mare

dect n repaus. Totui ATP este hidrolizat ntr-o mrime notabil cnd nu exist o munc extern

aparent; de exemplu nu este permis muchiului s se scurteze cnd el ine o valiz grea pentru un

lung timp, i aceasta conduce la un sentiment de oboseal ca la ridicarea unei ncrcturi grele.

Situsurile de hidroliz a ATP sunt pe punile ncruciate ce interacioneaz ntre elementele groase

(miozin) i subiri (actin) ale sarcomerului i ATP-aza este nalt activ numai cnd miozina i

actina interacioneaz.

Relaxarea muchiului este un proces pasiv. Cnd nu exist formarea punilor ncruciate

sarcomerul dobndete lungimea sa n repaus. Filamentele interdigitate alunec napoi ntr-o poziie

mai puin suprapus, prin aceasta crescnd lungimea muchiului. Acelai principiu de baz se aplic

171

muchiului scheletic i cardiac i chiar contraciei muchiului neted; totui, n muchiul neted nu

exist sarcomere i filamentele groase i fine sunt mai puin organizate. n muchii netezi,

filamentele de actin sunt ancorate fie la membrana celular, fie n cadrul citoplasmei la corpii

deni, structuri asemntoare liniilor Z ce se dezvolt n muchiul scheletic.

Acetilcolina ca un transmitor neuromuscular

Terminaiile nervului motor difer, n funcie de tipul fibrei principale. Fibrele slow twitch-

smulgere lent, care rspund la stimulul nervos cu contracie prelungit, sunt n general inervate de

terminaii nervoase multiple. Fibrele fast twitch sunt inervate de obicei de plci terminale

individuale. La ambele tipuri de terminale nervoase motorii este sintetizat acetilcolina (Ach) i

depozitat n vezicule. Aceste vezicule conin aproximativ 10000 molecule de acetilcolin; o unitate

din coninutul unei astfel de vezicule este denumit un quantum. Impulsurile nervoase conduse

elibereaz un numr mare de molecule de acetilcolin dnd natere la un potenial de plac

terminal de mare amplitudine. Un astfel de potenial declaneaz o secven complex de

evenimente, ncepnd cu depolarizarea membranei musculare i conducnd la contracia

muchiului.

Cuplarea excitaie-contracie

n muchiul striat, la o singur plac terminal a nervului motor, impulsul nervos este

transmis la membrana fibrei musculare (sarcolema) prin transmitorul chimic din nerv (Ach) (Fig.

29.3). Depolarizarea membranei plasmatice este iniiat de legarea Ach la receptorul Ach.

Depolarizarea difuzeaz ca potenialul de-a lungul sarcolemei i n josul tubulilor T n jurul

miofilamentelor, afectnd ntr-o oarecare msur reticulul sarcoplasmic (SR). Rspunsul este o

eliberare masiv de calciu din SR. Concentraia de Ca2+ liber crete lng miofilamente de 100-200

ori peste concentraia de repaus. Calciul se leag la complexul de troponin n filamentele subiri, i

interacia cu filamentele groase este iniiat. Filamentele alunec una fa de cealalt i se produce

contracia.

n stnga Fig. 29.3 este schema evenimentelor cronologice de la nerv la miofilamente. n

partea dreapt a fig. este scala de timp a evenimentelor.

ntre timp, Ach eliberat i legat de receptor este distrus de ctre o enzim foarte activ,

acetilcolinesteraza. Nivelul de Ca este sczut de acumularea activ n SR. Calciul din complexul

troponinei este eliberat i activitatea muchiului nceteaz pn se produce o nou categorie de

evenimente.

Biochimia normal

Proteine contractile din muchi Tab. 29.1

Miozin. Miozina este proteina major din muchiul scheletic i compune 60% din proteina

total din miofibrile, care sunt localizate n banda A n filamentele groase. Molecula individual de

miozin are o MM de aproximativ 480000Da i o form lung de tip varg. Ea const din 2 lanuri

172

peptidice aparent identice: lanuri grele (H) cu o mas de aproximativ 200000 Da fiecare, i 4

peptide mai mici, denumite lanuri uoare (L) n domeniul de mas de 16000 la 30000 Da.

Exist 3 forme diferite izomerice de lanuri uoare, definite L1, L2 i L3, respectiv. Fiecare

molecul de miozin conine 2 L2 i o pereche fie de L1 sau L3, n funcie de tipul de muchi. Se

pare a exista o uoar variaie ntre lanurile uoare n diferite tipuri de muchi; totui lanurile L2

par a fi asociate prin capacitatea lor de a suferi fosforilarea catalizat de light chain kinase. Kinaza

este activat prin proteina de legare a Ca, calmodulina. Lanul L2, care sufer fosforilarea a fost

implicat n reglarea contraciei musculaturii netede.

ntr-o singur molecul de miozin, partea funcional este localizat n principal n partea

globular a fiecrei peptide, care conine situsul ATP azei i situsul de legare a actinei, cele 2

activiti principale ale miozinei.

Actina. Actina este a doua protein ca abunden din muchi, ce constituie 20% din proteina

total din miofibrile. Dpdv structural, actina este o protein constituit dintr-un singur polipeptid

pliat ntr-o form globular. Actina se leag puternic cu un nucleotid, ATP sau ADP, i un cation

divalent, Ca2+ sau Mg2+per molecul. Ea este compus din 374 aminoacizi. MM a actinei este 41

785 Da, sau 42 300 Da cnd s-a legat ATP i Ca2+.

Actina a fost gsit n fiecare organism EK testat i este probabil una din cele mai

conservate proteine n evoluia biologic. Exist cteva microheterogeniti ntre actinele diferitelor

specii dar n muchiul scheletic i cardiac este gsit numai un singur tip de actin, -actina. 2 alte

specii de actin, -actina i -actina sunt gsite n celulele nemusculare.

Actina interacioneaz cu un numr mare de proteine. n cadrul miofibrilelor anumite interacii

sunt eseniale funciei sale fiziologice. Ea interacioneaz cu -actinina, care n muchiul striat este

localizat n linia Z a sarcomerelor, i rolul su mpreun cu alte proteine din linia Z este probabil

de a ancora filamentele de actin. Cealalt protein care interacioneaz cu actina este tropomiozina,

care este o parte integral din filamentul fin din miofibrile i este discutat mai jos. Interacia

funcional major a actinei este cu miozina, n mod specific cu partea globular a miozinei.

Interacia stimuleaz activitatea ATP-azic a miozinei ? prin accelerarea eliberrii ADP din

miozin, care pare a fi etapa limitant de vitez n activitatea ATP-azei. Complexul actomiozinei

este apoi disociat de ctre ATP i ciclul actinei i interacia miozinei ncepe din nou. Acest proces

conduce la contracie.

Proteine reglatorii din muchi

Tropomiozina i troponina sunt 2 proteine reglatorii implicate cu reglarea mediat de Ca2+ a

interaciilor actinei i miozinei. Ele sunt localizate n filamentele subiri ale miofibrilelor cu asociere

puternic dar necovalent cu actina dublu catenar n filament.

Tropomiozina Tropomiozina este o molecul coil-coiled, -helical, cu 2 subuniti cu o

MM de aproximativ 65000 Da. Ea constituie aprox 3% din proteina total din miofibrile. Molecula

173

lung, coiled de tropomiozin formeaz agregate filamentoase prin suprapunerea extremitilor

amino i carboxil. Aceast molecul de tropomiozin lung se leag de actin i ocup cele 2 laturi

canelate ale filamentului de actin dublu catenar. Dizlocarea acestor molecule de tropomiozin de

pe filamentul de actin de la un situs la cellalt situs este reglat prin troponin, reglatorul fiind

concentraiile de Ca2+. Reglarea contraciei de tropomiozin-troponin-Ca2+ este propus a fi prin

tropomiozin dizlocarea filamentului de actin, care apoi i se permite s interacioneze cu miozina.

Troponina. Troponina este o protein cu 3 subuniti cu o MM de aprox 70000 Da i

constituie aproximativ 4,5% din proteina total a miofibrilelor. Exist 3 subuniti de troponin care

sunt definite ca troponin C (component de legare a Ca), troponin T (component de legare a

tropomiozinei) i troponina I (componenta inhibitoare, ce inhib interaciile actinei i miozinei n

prezena ATP dar n absena Ca).

Filamentul fin, ce const din actin, tropomiozin i troponin i a crei mas combinat

const din aproximativ 27,5% din proteinele totale n miofibril, este localizat n banda I a

sarcomerului.

Alte proteine musculare

Mioglobina. Dei hemoglobina care este gsit n celulele roii ale sngelui, este transportorul

de oxigen n vertebrate, mioglobina care este localizat n muchi, faciliteaz deplasarea oxigenului

din snge n muchi i servete ca un furnizor rezerv de oxigen. Ea este o molecul compact cu un

BOLI MUSCULARE

Distrofiile musculare

Distrofiile musculare sunt un grup heterogen de boli motenite genetic, caracterizate din

punct de vedere clinic prin slbiciune muscular cronic i care prezint caracteristici

anatomopatologice ca necroze ale fibrelor musculare, semne de regenerare muscular, fibre

hipertrofice i proliferarea esutului conjunctiv. Aceast descriere difereniaz distrofiile musculare

de alte afeciuni primare ale muchiului cum ar fi miopatiile congenitale i inflamatorii cu care ar

putea fi uor confundate.

Distrofiile musculare progresive sunt cunoscute de mult timp. Prima descriere a unei astfel

de boli musculare a fost facut de catre Edward Meyron i William Little care n 1852 au descris

cazul unui biat de 14 ani ce prezenta la fel ca i fratele lui, o slbiciune muscular a musculaturii

proximale a minlor i picioarelor. n notiele sale Meyron scria biatul nu putea sta n picioare de

la vrsta de 2 ani i jumtatentotdeauna era n mod vdit obosit, la fel ca i fratele lui i ambii

nu alergau, nu sreau i nu se jucau cu ali copii. Cei doi frai aveau mari dificultai la urcatul

scrilor se agau de balustrade cu ambele mini i nclinau capul n fa i fixndu-se n aceast

atitudine ncordat i trau picioarele dup ei.

174

Guillaurme Duchenne, al crui nume a fost mai trziu asociat cu distrofia muscular

Duchenne, a contribuit la descrierea detaliat a acestor maladii prin prelevarea biopsiilor musculare

de la pacieni n diferite stadii ale bolii cu ajutorul unui ac acul histologic. Obinerea unei

biopsii de la un pacient cu distrofie muscular a fost un pas hotrtor n descrierea detaliat a

modificrilor care au loc n muchiul pacientului bolnav. Prelevarea biopsiei musculare la aceti

pacieni devine o cerin obligatorie pentru diagnosticul de laborator. (Becker E i van Ommen G:J,

1998).

Cu ajutorul tehnicilor de imunohistochimie i investigaiilor genetice, s-a demonstrat c o

mare parte din distrofiile musculare progresive apar ca urmare a deficitului uneia dintre proteinele

citoscheletice constitutive sau doar legate de membrana celular a fibrei musculare (sarcolema sau

plasmalema).

n anul 1986, mai muli cercettori americani (Monaco A.P. i Kunkel L.M.) descoper

defectul genetic n distrofia muscular Duchenne (DMD), un an mai trziu Hoffman, identificnd

nsi proteina deficient n DMD - distrofina.

Descoperirea distrofinei n anul 1986 (Hoffman et al., 1987) ca protein implicat n

distrofia muscular Duchenne, nu a clarificat numai cauza molecular a producerii celui mai comun

tip de distrofie muscular, dar a i renoit interesul n structura plasmalemei fibrei musculare

precum i asocierea ei cu membrana extracelular a fibrei musculare.

Cercetrile ulterioare au dus la descoperirea i a altor proteine al cror deficit tulbur funcia

i integritatea fibrei musculare i care au primit ulterior numele de complexul proteinelor asociate

distrofinei (Dystrophin Glycoprotein Complex - DGC).

Complexul proteinelor asociate distrofinei a fost descoperit curnd dup distrofin de ctre

Campbell i Kahl (1989) care au artat c distrofina este asociat cu un grup de proteine

membranare. ncepnd din acel momet s-au fcut o serie de descoperiri care au artat complexitatea

acestui grup de proteine. Astfel au fost identificate o serie de proteine din sarcolema fibrei

musculare (distrofina, sarcoglicanii, disferlina, caveolin-3), din matrixul extracelular (2-laminina,

colagenVI), din sarcomere (telotonina, miotilina, titina, nebulina), din citosol (calpaina-3, TRIM32,

LARGE), precum i proteine din nucleu (emerina, lamina A/C). (M. Vainzof,M.Zatz, 2003) (Fig.

1). Mutaiile care apar n genele care codific aceste proteine sunt responsabile de apariia

diferitelor tipuri de boli neuromusculare.

Pn n prezent se cunosc peste 40 de proteine care conlucreaz pentru stabilizarea

membranei, inser aparatul contractil al fibrei musculare pe sarcolem i fac legtura ntre aparatul

contractil al fibrei musculare i esutul conjunctiv din jurul fibrei. Mutaiile care apar n una din

componetele acestui complex determin deficiena primar a proteinei pe care o codific gena

respectiv, deficien care este adesea acompaniat i de modificri secundare a altor proteine ce

aparin complexului glicoptroteinelor asociate distrofinei.

175

Fiecare protein din acest complex este implicat ntr-un tip de distrofie muscular, pn n

prezent cunoscndu-se peste 40 de tipuri de distrofii musculare. Unele din proteinele complexului

DGC au o localizare extracelular (-distroglican), apte sunt proteine membranare (-distroglican,

sarcospan i -, -, -, -,i -sarcoglican), patru sunt proteine citoplasmatice (-actinina-2 i

sintrofina 1, 1, i 2) i dou sunt izoforme ale proteinelor subsarcolemale (-distrobrevina-1, -

2).

Se cunoate faptul c aceste proteine mpreun cu distrofina formeaz membrana

citoscheletic a membranei fibrei musculare, cu rol structural dar i posibil rol n transmiterea

semnalului celular ntre elementele contractile ale fibrei i matrixul extracelular. (Ervasti and

Campbell, 1993).

Figura 1. Schema dispoziiei i conexiunii proteinelor citoscheletale membranare din fibra

muscular. (Cohn i Campbell, 2000)

Studiul proteinelor musculare este importatant att pentru nelegerea corelaiilor genotip -

fenotip ct i n stabilirea exact a unui diagnostic pentru aceste maladii n care sunt implicate un

numr mare de gene. Analiza expresiei proteinelor deficiente este un instrument valoros pentru a

stabili unde ncepe cutarea unei mutaii n cele mai rspndite forme de boli neuromusculare

(Vainzof i col.,2003b; Zatz i col.,2003).

Importana biologic a citoscheletului n muchiul scheletic este subliniat de numeroasele

boli musculare motenite cauzate de mutaii att n proteinele sarcolemale ct i n cele

citoscheletice.

Aspecte ale morfologiei muchiului scheletic

176

Muchiul scheletic este constituit din celule musculare denumite fibre musculare, grupate n

fascicule. Fibrele musculare scheletice sunt sinciii multinucleate, rezultate din diferenierea, n

cursul ontogenezei, a miotubulilor, ei nui formai prin fuziunea mai multor mioblaste (celule

musculare individuale), celule primitive de origine mezenchimal. Forma caracteristic a fibrelor

musculare este cea de cilindru, a crui lungime variaz n funcie de lungimea muchiului putnd

atinge 20 cm

n seciune transversal, fibrele musculare sunt mai mult sau mai puin poligonale i prezint

o discret variabilitate de talie n jurul unui diametru cuprins ntre 10 i 80-100 m, variabil n

funcie de vrst, sex, dar i de volumul i gradul de dezvoltare a muchiului. Modificri de talie ale

fibrelor musculare precum hipertrofia sau atrofia pot aprea i n situaii patologice. Astfel att

hipertrofia - creterea dimensiunilor fibrelor musculare-, precum i atrofia muscular - reducerea

diametrului fibrelor musculare-, sunt ntlnite n procesele distrofice care au loc n muchi.

n seciuni longitudinale se observ aspectul caracteristic al muchiului striat: alternana de

benzi deschise i nchise la culoare, cu o periodicitate de 1.5-3.0 m, dependent de gradul de

scurtare al muchiului n timpul prelucrrii lui morfologice.

Constituieni structurali ai fibrelor musculare sunt cei ntlnii n orice celul, cu deosebirea

c unii sunt mai dezvoltai, tocmai datorit funciei fibrei musculare. n general, se poate considera

c fibrele musculare striate sunt compuse din patru constituieni: sarcolem, sarcoplasm (format

la rndul ei din cinci componente principale: matricea sarcolpasmatic, mitocondriile, reticulul

sarcoplasmatic, incluziunile sarcoplasmatice i aparatul Golgi) nucleii i miofibrilele.

Delimitarea fibrei musculare striate se face prin sarcolem, care la exterior prezint un

nveli polizaharidic, n care se afl fibre subiri de colagen, care vor contribui la formarea

tendonului. Sarcolema trimite tubi spre interior, care pot avea o direcie fie transversal pe corpul

fibrei musculare, cu ramificaii n jurul miofibrilelor formate din proteine contractile (sistemul

transversal, sistemul T), fie au o orientare paralel cu miofibrilele contractile (sistemul longitudinal,

sistemul L).

Membrana celular a fibrei musculare sarcolema - joac un rol central n structura i

funcia muchiului scheletic. Este alctuit din dou componente distincte: membrana bazal i

membrana plasmatic (plasmalema) (Anderson LVB, 2002; Ross MH, 2003; Weller RO i colab,

2002). Sub membran bazal (30-50nm grosime) se adpostesc, n contact strns cu fibra muscul,

un numr de celule satelite (celule musculare incomplet difereniate dar cu potenial de difereniere

n condiii ce impun regenerarea i nlocuirea fibrei musculare lezate).

Sarcolema are o structur similar cu celelalte membrane celulare, cu deosebirea c la

nivelul ei ntlnim o serie de proteine cu importan deosebit n funcia i integritatea fibrei

musculare. Aceste proteine au fost descoperite recent iar structura i funciile lor nu sunt pe deplin

elucidate. Unele dintre aceste proteine sunt prezente i n alte celule, dar n proporie mult mai mic

177

dect n fibra muscular. ntre acestea citm: distrofina, utrofina - protein omoloag distrofinei,

desmina, vinculina etc. Deficienele care apar n aceste proteine sunt generatoare de boli musculare

grave. Aceste proteine formeaz o teac groas, care nconjur fiecare fibr muscular, sunt n

contact permanent cu plasmalema i se presupune c protejeaz fibrele musculare de apariia

distruciilor mecanice. Membrana bazal este fixat de sarcolem prin intermediul costamerelor,

care menin cele dou membrane la distan una fa de cealalt i nu permit glisarea una pe

cealalt. n prezent, se consider c defectele de fixare ale membranei bazale la axul distrofinei, prin

intermediul costamerelor i la complexul sarcoglican sunt eseniale n patologia distrofinopatiilor

(Weller RO i colab, 2002)

Membrana bazal este parte a matrixului extracelular care menine legatura mecanic dintre

fibra muscular i esutul conjunctiv endomisial i poate avea rol n semnalizarea celular. n timpul

procesului de necrozare a fibrelor musculare, lamina bazal se pastreaz servind ca platform pentru

proliferarea fibrelor musculare i fuziunea ce are loc n timpul regenerrii. Exista cteva proteine

ale laminei bazale ale cror alterri genetice sunt cauza unor diferite boli. (merozina, integrin VII).

Membrana bazal se compune dintr-un strat de colagen amorf, gros de 20-30nm, strns

aderent de conturul fibrei i separat de plasmalem printr-un spaiu electron-clar de 20nm lrgime

reprezentnd o poriune necolorat a glycocalyxului plasmalemei (Sanes i colab.,1978). Mai

conine fibronectin, proteoglycan, heparan-sulfat i laminin. Ultima prezint un interes deosebit

deoarece n tipul occidental de distrofie muscular congenital s-a evideniat o scdere dramatic a

unui component al lamininei (merosina), ceea ce demonstreaz implicarea unor defecte ale

membranei bazale n anumite forme de distrofii musculare (Hayashi i colab.,1993). Extern fa de

membrana bazal, n muchiul normal mai exist un strat foarte lax de fibre reticulare fine.

Spre deosebire de sarcolem, membrana bazal este rezistent la diverse noxe care distrug

fibra muscular. Dup distrugerea fibrei, membrana bazal rmane de obicei sub forma aa-

numitului tub sarcolemal (Allbrook,1962; Price i colab.,1964), n interiorul cruia are loc deseori

regenerarea fibrei. ngroarea pn la 500nm a membranei bazale poate fi observat n distrofia

miotonic (Mair si Tome ,1972). Are rolul de a menine forma fibrei musculare n limite normale.

Cellalt component al sarcolemei - plasmalema - formeaz o barier fizic i funcional

ntre mediul extracelular i cel intracelular. nvelete fibra muscular i se ramific n interiorul

acesteia sub forma sistemului tubular transvers. Este implicat n reglarea ionic, receptarea

transmitorilor, propagarea potenialului de aciune, endo- i exocitoz. Endo- i exocitoza se

realizeaz la nivelul caveolelor, structuri asemntoare veziculelor pinocitotice din celulele

endoteliale, cu rol metabolic prin mrirea suprafeei plasmalemei i a plasmalemei, i rol n

scurtarea acesteia n timpul contraciei. Unele caveole sunt evident legate de tubulii n T.

Plasmalema este asociat cu un sistem citoscheletal sarcolemal foarte complex, sistem n care

distrofina i -actina reprezint elementele cheie.

178

Distrugerea plasmalemei este primul eveniment din sucesiunea de evenimente care conduc

la necroz (Karpati, 2002).

Defectele genetice care apar la nivelul genelor proteinelor plasmalemale sunt cauza a

numeroase boli musculare. Principalele proteine care sufer mutaii sunt: distrofina, sarcoglicanii,

disferlina i caveolina.

Distrofina este o protein alungit, flexibil asociat plasmalemei, a crei gen este

localizat pe cromozomul X n locusul p21. Absena ei caracterizeaz distrofia muscular Duchenne

(DMD) iar alterarea ei distrofia muscular Becker (BMD).

Proteina nrudit cu distrofina utrofina - omolog al distrofinei a crei gen este situat pe

cromozomul 6 (Love i col.,1989), este o protein citoscheletal din familia spectrinelor, n form

de bastona (Voit i col.,1991; Khurana i col.,1991). Este prezent n boala Duchenne, dar absena

ei poate determina apariia unei distrofii musculare cu transmitere autosomal. S-a sugerat c

aceast protein ar putea compensa pn la un punct defectul de distrofin.

Vinculina este o protein membranar (Pardo i col.,1983), care face legtura ntre

citoschelet i matricea extracelular. Este demostrat (Minetti i col.,1992) deficiena ei la bolnavii

cu distrofie musculara progresiva Duchenne. Se consider c deficiena n vinculin ar putea juca

un rol n patogenia molecular a proliferrii esutului conjunctiv n DMD.

Desmina (Lazarides, 1970) este prezent numai n celulele musculare striate i netede unde

formeaz o reea intermiofibrilar i subsarcolemal mai dens la nivelul jonciunilor

neuromusculare. Se consider c la nivelul sarcolemei, desmina ar putea juca rol n meninerea

structurii n falduri a regiunii postsinaptice a plcii neuromusculare i totodat ar ajuta la ancorarea

altor molecule joncionale (receptorii pentru acetilcolin) n sarcolem la nivelul plcii. S-a observat

c n condiii patologice i n hipercontracia fibrei musculare, desmina nu se mai exprim (aceast

modificare apare naintea primelor modificri structurale), dar este foarte bine exprimat n

regenerare (Vater i col., 1992).

Spectrina formeaz o reea subsarcolemal care asigur mpreun cu distrofina stabilitatea

sarcolemei.

Clasificarea distrofiilor musculare

Clasificrile timpurii ale distrofiilor musculare erau bazate pe criterii clinice: vrst de debut

i distribuia muchilor afectai. n anul 1954 bazndu-se pe propriile studii clinice detaliate i pe

literatura de specialitate existent pn la acea dat, Walton i Nattrass au propus o clasificare nou

i de mare valoare a distrofiilor musculare n care luau n considerare aceste dou criterii.

Astfel au fost identificate trei grupuri mari de distrofii musculare: de tip Duchenne,

fascioscapulohumeral i de tip forma centurilor precum i trei forme relative rare: oculofaringeal,

distal i congenital. Datorit dezvoltrii tehnicilor de biologie molecular cu aplicabilitate n

medicin, zece ani mai trziu, Walton revizuie clasificarea i o public n British Molecular

179

Journal. Clasificarea a rmsa valabil mult timp i a fost o baz pentru cercetrile clinice i genetice

ulterioare.

1.3.1. Tipuri de distrofii musculare

Dup modul de dobndire distrofiile musculare pot fi clasificate n:

distrofii X-lincate:

DMD - distrofina

BMD - distrofina

distrofia muscular Emery-Dreiffus - emerina

miopatia centonuclear -

miopatia cvadricepilor distrofii musculare autosomal recesive

distrofii musculare de tip forma centurilor (DMFC)

DMFC 2A produsa de deficienta calpainei

DMFC 2B - disferlinei

DMFC 2C -sarcoglican

DMFC 2D -sarcoglican

DMFC 2E -sarcoglican

DMFC 2F -sarcoglican

DMFC 2G telotonin

DMFC 2H proteina 32 tripartif motiv (TRIM32)

DMFC 2I fukutina (FKPR)

DMFC 2J - titina

DMFC 2K proteina O-manozid N-acetilglucoso miniltransferaza (POMT1)

distrofii musculare autosomal dominante

distrofii musculare de tip forma centurilor (DMFC)

DMFC 1A- miotilina

DMFC 1B laminina A/C

DMFC 1C caveolina-3

DMFC 1D proteina necunoscuta

DMFC 1E proteina necunoscuta

DMFC 1F proteina necunoscuta

DMFC 1G proteina necunoscuta alte forme de distrofii musculare autosomal dominante

distrofia muscular Emery-Dreiffus Laminin A/C

miopatia Bethlem Colagen VI 1

miopatia Bethlem - Colagen VI 2

miopatia Bethlem - Colagen VI 3

distrofia muscular epidermolisis Plectina

distrofia muscular scapuloperoneal protein necunoscut

distrofia miotonic Miotonin protein kinaza/ 65 Distrofii musculare congenitale (DMC)

distrofia muscular de tip Fukuyama fukutina

sindromul Walker-Warburg O manoil transferaza I

distrofia muscular cu merozin negative

boala Ullrich 1, 2 i 3 colagen VI

180

DMC 1A Laminina 2

DMC 1B protein necunoscut

DMC 1C FKRP d numele ntreg al proteinei

DMC 1D LARGE d numele ntreg al proteinei Clasificarea bazat pe caracteristicile clinice ale bolior musculare este astzi depait

datorit fapului c unele fenotipuri clinice pot fi comune unor afeciuni cu substrate patogenice

diferite dup cum acelai substrat poate conduce la manifestri clinice diferite.

Odat cu aplicarea tehnicilor avansate de biologie molecular ncepnd cu anii 80, a fost

identificat gena DMD i mai apoi proteina. De atunci utilizndu-se tehnici de biologie molecular

au fost identificate i alte gene implicate n distrofiile musculare precum i proteinele pe care

acestea le codific. Identificarea poziiei pe care fiecare protein o are n muchiul scheletic

permite acum o nou clasificare a distrofiilor musculare. (Tab. 1).

Tabelul 1. Proteine implicate n diferite boli neuromusculare

Grupuri de

proteine Proteina Fenotip

Mod de

transmitere

Poziia genei

Funcia

Proteine

sarcolemale

distrofina DMD/BMD XL Xp21 Structural -sarcoglican LGMD2D AR 17q12 Structural - sarcoglican LGMD2E AR 4q12 Structural -sarcoglican LGMD2C AR 13q12 Structural -sarcoglican LGMDF AR 5q33-34 Structural

disferlina LGMD2B/Miopatia

Miyoshi AR 2p13 Necunoscut

caveolina-3 LGMD1C AD 3p25 Structural

Proteine din

matrixul

extracelular

laminin 2 DMC AR 6q2 Structural

collagenVI DMC Ullrichs,Miopatia Bethlem

AR 21q22 Structural

Proteine

ciostolice

calpaina-3 LGMD2A AR 15q15.1 Enzim TRIM 32 LGMD2H AR 9q31-34 Ligaza?

miotubularina Miopatia miotubulara XL Xq28

Complexul Golgi

fukutina DMC Fukuhama/LGMD

2L AR 9q31-33 Glicozilare

FKRP LGMD2I/DMC1C AR 19q1 Glicozilare

POMFnT1 DMC muchi-ochi-creier AR 1p32-34 Glicozilare

POMT1 DMC Walker-

Warburg/LGMD2K AR 9q34 Glicozilare

LARGE DMC1D Glicoziltransferare

Proteine

sarcomerice

titina LGMD2J AR 2q Structural miotilina LGMD1A AD 5q22-34 Structural teletonina LGMD2G AR 17q11-12 Structural actina Miopatia nemalina AD/AR 1q42

tropomiozina 3 Miopatia nemalina AD/AR 1q21-23 topomiozina 2 Miopatia nemalina AD 9p13

nebulina Miopatia nemalina AR 2q21-22

troponina T1 Miopatia nemalina AR 19q13

Proteine nucleare

emerina DM Emery-Dreifuss XL Xq28 Necunoscut laminin A/C LGMD1B AD 1q11-21 Structurala

SMN Atrofia muscular spinala

AR 5q11-13

PABP2 Distrofia oculofaringeala AD 14q11.2-

q13 Necunoscut

Pentru distrofiile musculare sunt responsabili cel puin 29 de loci diferii care dau natere la

peste 40 de boli musculare clinic diferite.

Se admite astzi c aproximativ 70% din distrofiile musculare ale bieilor i brbailor, i

aproximativ 10% din distrofiile fetelor i femeilor se datoresc unui defect al distrofinei.

Aproximativ 2% din distrofiile copilului i adultului au drept cauz un defect primar al unui

sarcoglican alfa, beta sau gamma (Hoffman, 1996).

181

Distrofia muscular Duchenne (DMD), este cea mai cunoscuta si cea mai severa forma de

miopatie. Se estimeaza ca afecteaza aproximativ 1 din 3.500 de baieti. Se caracterizeaza prin

scaderea fortei musculare in prima decada a vietii, ajungandu-se la pierderea capacitatii de a merge

catre varsta de 1215 ani. Afectarea cardiaca poate fi prezenta chiar in prima decada de viata. Unii

pacienti cu DMD (20%) prezinta un retard mental moderat, cu un coeficient de inteligenta in jur de

70 iar din anii 90 se recunoaste afectarea retiniana caracterizata prin afectarea severa a vederii

nocturne. Sunt prezente si probleme intelectuale non-progresive la unii pacienti cu DMD (20%),

coeficientul de inteligenta situindu-se la un nivel relativ scazut, sub 70. Decesul se produce intre

1525 ani in urma unei cardiomiopatii, a insuficientei respiratorii sau a pneumoniei, iar folosirea

ventilatiei artificiale poate prelungi si imbunatati calitatea vietii acestor bolnavi timp de cativa ani.

Modificarile ecocardiografice in DMD reflecta o atrofie selectiva a regiunii posterobazale si

a peretelui lateral adiacent al ventriculului stang, mai degraba decat hipertrofia actuala a

ventriculului drept. In cursul celei de-a doua decade de viata iau amploare modificarile anormale ale

sistemului de conducere (bloc pe ramura, aritmie) si semnele evidente de cardiomiopatie

(hipertrofica si dilatativa). In timp ce incidenta defectelor de conducere ramane scazuta, incidenta

cardiomiopatiei creste mult, afectand 1/3 din pacienti pana la varsta de 14 ani si toti pacientii pana

la varsta de 18 ani. Cardiomiopatia dilatativa este comuna la toate varstele si adesea se dezvolta

dupa o perioada de hipertrofie. In ciuda unei mari incidente a implicarii cardiace, multi pacienti cu

DMD raman asimptomatici astfel incat doar 57% din cei de peste 18 ani prezinta o implicare

cardiaca evidenta.

Distrofia musculara Becker (DMB) este versiunea mai blanda a DMD. Se estimeaza ca

afecteaza 1 din 17.500 de baieti. Varsta de debut este de obicei mai mare si progresia bolii este mai

lenta, dar simptomele dezvoltate sunt aceleasi. La unii pacienti usor afectati, primele simptome

clinice pot aparea catre varsta de 30 de ani pana la 60 de ani. In unele cazuri, diagnosticul molecular

a aratat ca pacientii au fost gresit diagnosticati din cauza unei prezentari atipice a bolii. Un simptom

in special subapreciat (pus pe seama efortului) este durerea de gamba, pe care au exprimat-o intr-un

anumit stadiu al bolii aproximativ 81% din subiectii unui lot de studiu de 67 pacienti cu DMB

(Bushby KM si col, 1993). Unii pacienti au fost gresit diagnosticati cu atrofie musculara spinala,

altii cu distrofie musculara forma centurilor, altii cu boli musculare metabolice din cauza durerilor

si crampelor musculare la efort. Bolnavii cu DMB prezinta o incidenta inalta a afectarii cardiace, in

ciuda manifestarilor mai blande a simptomelor musculare, unii necesitand chiar un transplant

miocardic. Problemele intelectuale sunt mult mai putin marcate decat la bolnavii cu DMD, dar pot

fi prezente. La pacientii cu DMB cardiomiopatia dilatativa este frecvent intalnita comparativ cu

cardiomiopatia hipertrofica. Rareori apare o cardiomiopatie inainte de 16 ani, dar poate afecta 70%

din pacientii de peste 40 de ani.

182

Proportia femeilor purtatoare DMD/DMB cu o evidenta ecocardiologica a dilatarii

ventriculului stang a fost raportata la 40%. O incidenta chiar mai mare (pana la 90%) a unei

ecocardiografii anormale s-a inregistrat intr-un studiu italian. Un studiu facut in Marea Britanie pe

femei purtatoare DMD/DMB si martori, care a fost efectuat in orb a aratat ca incidenta

simptomelor clinice este mai scazuta. Semnele cardiomiopatice au fost prezente doar la 7% din

subiecti, la care se adauga 18% cu anomalii cardiace anterioare minime pe ECG, fara sa necesite un

tratament de urgenta.

Cardiomiopatia dilatativa legata de cromozomul X (CDLX) este un fenotip clinic al

distrofinopatiei, caracterizat prin implicarea preferentiala a muschiului cardiac, fara alte semne ale

unei afectari a musculaturii scheletice. Totusi, este prezent intotdeauna un nivel ridicat al creatin

kinazei serice si biopsia musculara prezinta modificari miopatice. Bolnavii tipici sunt baieti

adolescenti care prezinta insuficienta cardiaca congestiva letala sau femei de varsta medie,

purtatoare ale mutatiei, care manifesta o durere atipica in capul pieptului. La baieti evolutia bolii

este rapid progresiva si acestia mor daca nu sufera un transplant cardiac dupa 12 ani de la debutul

bolii. La femei, insuficienta cardiaca progreseaza timp de cativa ani si este fatala in mod frecvent. O

proportie semnificativa de pacienti prezinta o mutatie in gena distrofinei si o expresie anormala a

proteinei in muschiul cardiac.

Distrofinopatiile sunt cauzate de apariia de mutaii la nivelul genei DYS situata pe braul

scurt al cromozomului X, in locusul Xp21, una dintre cele mai mari gene identificate pana in

prezent (3 Mb de ADN). Gena are 79 de exoni iar ARNm are 14 kb. Dimensiunea genei predispune

la mutatii noi si exon skipping. Distrofina (Dys) este o proteina de 427 kD care este exprimata n

muschiul striat si neted, creier si retina. Dys este format din: capatul NH2 - terminal Dys la care se

leag actina, domeniul central bogat in cisteina care se ancoreaza de beta-distroglican (proteina

sarcolemala care face parte din complexul glicoproteic legat de distrofina) si capatul COOH -

terminal la care se leaga distrobrevina si sintrofinele.

La nivel celular Dys este localizata, pe faa interna a membranei celulei musculare, unde

este absenta n DMD, in timp ce n DMB apare o protein modificat cu o greutate molecular mai

mic, sau este subexprimat.

Principala funcie a Dys este structural - suport al sarcolemei prin cuplarea proteinelor

contractile (F-actina) i moleculele matrixului extracelular (merozina). Se formeaz o legatura

puternica intre citoscheletul subsarcolemal si matrixul extracelular. Apariia de mutaii la nivelul

genelor proteinelor din complex duce la aparii ade diferite forme de DM. n acest context, mutaiile

la nivelul genei Dys si o reducere variabila a expresiei proteinelor aflate in conexiune cu proteina

acesteia duce la reducerea flexibilitatii, fortei si stabilitatii sarcolemei in timpul contractiei (Petrof

BJ, 1998). Mai mult, legatura dintre F-actina, distofina, glicoprotenele membranare, merozina si

183

nNOS (Nitric Oxid sintaza neuronala) poate fi semnificativa pentru controlul vascular in timpul

contractiei musculare. In absenta Dys, expresia celorlalte proteine mentionate poate fi afectata.

O proteina cu similaritati structurale si funcionale cu distrofina este Utrofina (DRP). DRP

este localizata n celula muscular de la aduli exclusiv la nivelul jonctiunii neuromusculare. Spre

deosebire de Dys, DRP este exprimat ubiquitar, fiind bine exprimata in plamani, vase de sange si

nervi. Omologia structural dintre cele dou proteine este de aproximativ 80%. In cazul DMD si

DMB, DRP compenseaz parial funciile distrofinei, fiind prezenta subsarcolemal, de-a lungul

intregii fibre musculare, ceea ce duce la o supraexprimare a acesteia pe intreaga suprafata interna a

sarcolemei fibrelor musculare. Studiile anterioare efectuate pe pacieni cu DMB au sugerat existena

unei variabilitati a expresiei DRP in corelatie directa cu cantitatea de Dys. Din literatura de

specialitate s-a constatat c cele mai frecvente mutaii in distrofinopatii sunt deletiile exonice sau

multiexonice (60-65% in DMD si pana in 80% in DMB), dar pot aparea si duplicatii (5-10%),

alturi de mutaii non-sens care genereaza codoni STOP n cazul DMD (Roberts RG si col., 1994).

Deletiile care duc la modificarea cadrului de citire produc o terminare prematura a translatiei si

imposibilitatea sintezei distrofinei, generand un fenotip sever asociat cu DMD, in timp ce acelea

care indeparteaza portiuni largi din gena dar mentin cadrul de citire sunt asociate cu DMB. Rata

mare de aparitie a mutatiilor intr-o gena atat de mare duce la cresterea continua a numrului de

femei purtatoare. Astfel, aproximativ 1/3 din noile cazuri cu DMD sunt familiale, 1/3 sunt cauzate

de o noua mutatie care se produce la mama si 1/3 sunt cauzate de o noua mutatie aparuta la baiatul

afectat.

In CDLX mutatiile la nivelul genei DYS se intalnesc in regiunea promotorului si la nivelul

exonilor 1-7 i 48-51. Studiile efectuate pe cateva familii releva o expresie diferita a distrofinei in

muschiul cardiac comparativ cu muschiul scheletic. La bolnavii cu cel mai sever fenotip cardiac,

muschiul cardiac este in general incapabil sa produca distrofina, in timp ce la nivelul muschiului

scheletic, distrofina continua sa fie sintetizata (Ferlini A si col., 1999). La unele femei purtatoare de

mutaii la nivelul DYS, simptomatologia cardiaca poate fi singura manifestare clinica.

Prin studii imunohistochimice s-a observat ca in cazul DMD expresia DYS lipseste (cu

exceptia a cateva fibre revertante in unele cazuri), in timp ce in DMB se observa o slaba exprimare

a DYS la nivelul majoritatii fibrelor musculare. Prin analiza de Western blot efectuata la pacienti cu

DMD se observa completa absenta a DYS distrofinei.

Prin corelarea studiilor clinice, anatomopatologice si de biologie moleculara, s-a reusit

initierea unor terapii moderne tintite pentru anumite categorii de pacienti, prin administrarea de

modulatori ai trascriptiei si expresiei genei distrofinei, de tipul gentamicinei.

Mutatiile genei distrofinei conduc la pierderea integritatii structurale si a viabilitatii celulelor

musculare somatice si/sau miocardice, determinand boli degenerative musculare grave.

Dezintegrarea si moartea miocitelor striate produc modificari morfo-functionale de tipul distrofiei

184

musculare Duchenne/Becker (DMD/DMB), pe cand cele de la nivelul miocitelor cardiace produc o

forma de cardiomiopatie dilatativa (CMD) ce se manifesta in special la subiectii tineri de sex

masculin (CMDX-linkata). Afectarea cardiaca face parte integranta in ambele categorii de afectiuni.

DMD si DMB sunt afectiuni ereditare recesive X- linkate cauzate de mutatii la nivelul genei

distrofinei, si caracterizate prin reducerea majora sau absenta expresiei distrofinei din sarcolema

miocitului striat. Mutatiile cel mai frecvent raportate in DMD/DMB sunt deletiile si duplicatiile.

Mutatiile genei distrofinei produc in secundar si o afectare cardiaca de tipul CMD. Afectarea

cardiaca care apare in DMD se dezvolta insidios in prima decada de viata, atunci cand afectarea

musculaturii scheletice este deja foarte evidenta. Pacientii cu DMB au de asemenea o rata inalta a

afectarii cardiace, in ciuda afectarii scheletice moderate. De fapt, un procent ridicat dintre pacienti

cu DMB sunt initial diagnosticati datorita afectarii cardiace severe. Este recunoscut faptul ca cea

mai frecventa cauza de deces in BMD este insuficienta cardiaca, si nu insuficienta respiratorie

precum in DMD.

Femeile purtatoare de status mutant al genei distrofinei cauzatoare de DMD sau DMB au o o

rata surprinzator de inalta a afectarii cardiace care progreseaza cu inaintarea in varsta si se

manifesta predominant sub forma unei cardiomiopatii dilatative. cu varsta si se manifesta prin

CMD.

Diagnosticul este precizat prin studiul proteinelor musculare si cel genetic molecular

Tehnicile de diagnostic pot in prezent identifica mutatiile genetice la purtatorii sanatosi si in utero.

La pacientii cu DMD, biopsia muschiului evidentiaza absenta distrofinei, in timp ca la

pacientii diagnosticati cu DMB, distrofina este prezenta, dar proteina este de tip anormal.. Biopsiile

efectuate la cei cu status carrier inidica un aspect in mozaic al miocitelor cardiace: cardiomiocitele

cu expresie normala a distrofinei alterneaza cu cele cu expresie redusa (DMB) sau absenta (DMD).

Gena distrofinei genereaza mai multe transcripturi, lucru ce conduce la formarea mai multor

proteine izoforme. Aceste izoforme deriva dintr-o combinatie de promoteri specifici ai diferitelor

tesuturi si din procesul de splicing alternativ a exomnilor genici comuni. Gena are in strucura sa 7

promoteri distincti. 3 dintre promoteri, cel specific pentru creier, muschi si celule cerebeloase

Purkinje, sunt aranjati in serie la capatul 5 al genei si initiaza trasnscriptia integrala a ARN

mesager, insa fiecare transcriind o anumta secventa de pe exonul 1. Majoritatea mutatiilor capatului

5 al genei conduc la produsi de transcriptie identici la nivelul miocardului: mutatiile nu permit

expresia integrala a trascriptului muscular. Absenta acestuia este partial compensata de catre

transcriptii celulelor nervoase si Purkinje pentru tesutul muscular striat dar nu si pentru cel cardiac.

Mutatiile genei distrofinei afecteaza de o maniera proprie tesutul miocardic: mutatiile afecteaza fie

procesul de transcriptie, fie cel de splicing, fie ambele procese. Alte mutatii produc destabilizarea

unor regiuni ale proteinei distrofinei, acest efect fiind mai evident la nivelul tesutului cardiac decat

la nivelul celui muscular scheletic. Toate studiile cu privire la mutatiile genei distrofinei subliniaza

185

diferentele fundamentale intre functiile pe care le exercita gena distrofinei asupra tesutului

miocardic comparativ cu cel muscular scheletic, pentru fiecare tip de tesut existand domenii ale

genei critice pentru buna functionare a respectivului tip de tesut muscular.

Fenomenele mutationale raoprtate la nivelul genei distrofinei pot fi:

- spontane (erori de replicare) = rata 1/100.000

- induse (status mutant, agenti chimici, radiatii, etc.)

Tipuri de mutatii intalnite la nivelul genei distrofinei:

Mutaiile pot avea diferite efecte asupra cadrului de citire. Ipoteza cadrului de citire propus

de Monaco A.P. i col., n anul 1988 explic dou fenotipuri rezultate din producerea unor mutaii

n aceeai gen. Conform acestei ipoteze mutaiile care deplaseaz cadrul de citire (frame-shift) sunt

rspunztoare de apariia distrofiei musculare Duchenne, n timp ce mutaiile care menin cadrul de

citire (in frame) conduc la sinteza unei distrofine anormale dar parial functional ceea ce determin

o distrofie muscular Becker. (Monaco i col., 1989). Corelarea fenotipului cu mutaiile n gena

distrofinei au confirmat aceast ipotez la 92% din cazuri. (Pandey G.S. i col., 2003). Exist 3 tipuri

de mutatii care pot afecta funcia distrofine: deleiile.dac unul sau mai muli exoni ai genei lipsesc,

duplicaiile-dac o parte a genei este repatat i mutaiile punctiforme dac o singur pereche de

baze este schimbat, eliminat, adugat.

1. Studiile de pn acum au indicat faptul c cele mai frecvente mutaii care apar n gena

distrofinei sunt deleiile.

Cu toate c deleiile pot aparea de-a lungul ntregii gene, cercettorii au observat c la

nivelul genei distrofinei exist doua zone fierbini numite zone hotspot n care frecvena

mutaiilor este foarte mare. O zon este n regiunea central a genei iar cealalt spre captul 5 al

genei (mai mult de 18%). Cele mai multe deleii se ntlnesc n jurul exonilor 45 - 52 i 3 - 19.

n DMD majoritatea deleiilor apar n regiunea central a distrofinei i spre captul 3 n

timp ce n BMD deleiile apar n special la captul 5.

Pn n prezent nu s-a reuit realizarea unei corelaii ntre mrimea deleiei i fenotip dar s-a

observat c:

deleia exonului 1 i a regiuni promotoare duce la o slbiciune muscular moderat

asociat mai mult sau mai puin cu cardiomiopatia;

deleia exonilor 3-7 reprezint o excepie de la teoria cadrului de citire deoarece este

o mutaie out of frame ce determin apariia DMD.

la nivelul exonului 19 apar n special mutaii punctiforme;

deleia exonului 45 poate determina att DMD ct i BMD;

poriunea central i distal a domeniului rod din gena DYS par sa fie far valoare

fucional, deoarece deleiile la acest nivel duc la mialgii i crampe musculare dar nu

186

slbiciune muscular. Unii din aceti pacieni pot prezenta chiar un nivel ridicat al

creatin-kinazei serice (Angelini C.i col., 1996, Beggs i col., 1991);

deleiile mari care au loc n domeniul central, conduc la BMD, cu condiia ca

alterarea s nu ating capetele C- i N-terminal ale DYS;

deleiile care care au loc n domeniul WW-bogat n cistein (exonii 63-69), au ca

rezultat, n cele mai multe cazuri, un fenotip de distrofie muscular;.

deleiile n domeniul C-terminal sunt rare iar fenotipul determinat de ele poate varia

de la forme uoare la forme severe chiar n aceeai familie;

deleia unui exon mic cum este cazul exonului 44 determin un fenotip DMD;

deleiile mari care pot implica mai muli exoni ce pot afecta mai mult de 50% din

gen au fost descoperite la pacienii cu BMD (Love i col.,1991);

pacienii care prezint deleii n frame n exonii 32 - 44, 48 - 51 sau 48 - 53 au o

concentraie normal sau aproape normal de distrofina.

pacienii cu BMD cu mutaii frame-shift prezint cteva deleii (sau duplicaii)

caracteristice spre captul 5 al genei (exonii 3-7; 5-7; 3-6) sau n apropierea exonilor

51, 49-50, 47-52, 44 sau 45 (Koenig i col., 1989). 70% din pacieni prezint de regul

mutaii n frame n timp ce 16% sunt au mutaii frameshift.

2. Duplicaiile - apar mai rar n gena distrofinei n proporie de aproximativ 5% majoritatea

fiind localizate spre captul 5 al genei. Frecvena duplicaiilor scade treptat spre captul 3

ajungnd pn la 1%.

Duplicaiile au fost observate n special la nivelul exonilor 6 i 7 (22% din cazuri), dar i n

exonii 45-55 care se consider a fi regiune hot spot. Efectele duplicaiilor sunt foarte complex motiv

pentru care nu putem vorbi de un anumit fenotip, deoarece regula cadrului de citire nu este

ntotdeauna valabil.

3. Muatiile punctiforme se ntlnesc la mai mult de 73% din pacienii far deleii sau

duplicaii (Roberts i col., 1994), pe toat ntinderea genei DYS fr a exista ca n cazul deleiilor

regiuni hot spot.

Cele mai multe mutaii puntiforme sunt ntlnite:

spre captul 3 al exonului 55 - mai mult de 40% dintre acestea;

n regiunile promotoare sunt asociate cu cardiomiopatia dilatativ;

la nivelul situsurilor reglatoare ale expresiei genei.

Mutaiile punctiforme identificate la pacienii cu DMD pot fi de tip nonsense, deleii mici

(1pb) sau inserii (frame-shift), sau mai rar missense. Au fost observate nivelul domeniului bogat n

cistein (Cys331Phe) i sunt responsabile de fenotipul Duchene. Mai rar apar n distrofia muscular

Becker (Asp165 Val).

187

n prezent, mutaiile punctiforme se determin prin tehnica protein truncation test (PTT),

iar recent a fost introdus tehnica High Resolution-Melting Curve Analysis.

Tehnici de diagnostic molecular genetic

Screeningul deletiilor/ duplicatiilor

1. Multiplex Ligation Probe Amplification (MLPA) permite intr-o singura reactie screeningul

celor 79 de exoni ai genei distrofinei

2. Multiplex-Amplifiable Probe Hybridisation (MAPH) - varianta mai veche a MLPA (mai

laborioasa, necesita cantitati mai mari de ADN)

3. Alte tehnici multiplex PCR - realizeaza screeningul a maximum 18 exoni genici - poate face

detectia calitativa pentru deletii, nu poate detecta duplicatii

4. Protein Truncation Test (PTT) tehnica performanta, insa necesita pentru analiza ARN

obtinut preferabil prin biopsie musculara sau cADN obtinut prin RT-PCR

ofera in plus indicatii asupra proceselor de RNA-splicing

Screeningul mutatiilor punctiforme

1. Denaturin Gradient Gel-Electrophoresis (DGGE) - eficienta detectiei ~ 100%

2. Secventiere directa prin SCAIP (single condition amplification/ internal primer)

3. SSCA (single strand conformation analysis)

4. Denat. hight performance liquid cromatography (DHPLC))

Distrofia miotonic- boli ale mecanismului contractil

Miotonia este caracterizat prin incapacitatea de relaxare a muchiului. n trecut, cteva boli

diferite au fost clasificate mpreun pe baza manifestrii miotoniei ca o trstur a tabloului clinic.

n prezent, este clar c aceste boli sunt rezultatul diferitelor mutaii care afecteaz diferite proteine.

De exemplu, anomalii ale canalelor de sodiu n muchi determin paralizia periodic hipercalemic

i paramyotonia congenita (boal muscular rar autozomal ereditar caracterizat printr-o condiie

n care muchii nu se relaxeaz dup contracie (miotonie). Simptomele pot fi declanate prin

expunere la frig) n timp ce o protein kinaz deficient se afl la baza distrofiei miotonice i

canalele de clor anormale stau la baza formelor autozomal dominante (AD) i autozomal recesive

(AR) de miotonia congenita (miotonia congenita este o boal genetic rar n care o anomalie a

membranei fibrei musculare scheletice determin un rspuns exagerat neobinuit la stimulare-

hiperexcitabilitate. Ca un rezultat, indivizii afectai prezint dificultate n relaxarea anumitor muchi

dup contractarea lor-miotonia), rigiditate muscular i simptome asociate). n consecin, exist o

dramatic heterogenitate a proteinei afectate n ciuda similaritii unor trsturi clinice n aceste boli

diferite.

n membranele celulelor excitabile sunt incluse canale ionice de Na, Cl i K separate i

distincte. Deplasarea sodiului n celula muscular declaneaz nceputul potenialului de aciune n

188

timp ce deplasarea potasiului prin canale specifice determin repolarizarea. Canalele de Cl pot

determina hiperpolarizarea celulelor musculare. Pentru muli ani s-a considerat c sindroamele

miotonice sunt boli ale excitabilitii membranei musculare deoarece simptomele nu au fost afectate

de blocarea nervilor locali sau a jonciunii neuromusculare. n plus, studii pe esut muscular

provenit de la pacieni cu paralizie periodic hipercalemic i paramiotonia congenita au evideniat

o conductan a ionilor de sodiu anormal de mare, care poate fi abrogat de ctre un agent de

blocare a canalului de sodiu, tetrotoxinul, incriminnd canalul de sodiu.

Celulele musculare din pacieni cu distrofia miotonic au un potenial de repaus mai mic dect

normal cu o conductan a K+ normal dar anormal de crescut a Na+. Studii de diagnostic

molecular au artat c produsul genei distrofiei miotonice nu este canalul de Na+ nsi. O teorie

actual implic o protein kinaz cAMP dependent ca un modulator a funciei canalului de Na.

Spre deosebire de DMD, care afecteaz n principal masculi tineri, distrofia miotonic este cea

mai comun form de distrofie muscular la aduli cu o inciden de 1:8000. Distrofia miotonic

este transmis ca o trstur dominant autozomal, o alt caracteristic important distinctinctiv a

tabloului su clinic. Deoarece n DMD, tehnicile moderne au identificat o mutaie responsabil

pentru distrofia miotonic-expansiunea unui triplet C-T-G pe cromozomul 19q. Aceast extensie

pare a crete pentru generaii succesive corelndu-se cu creterea severitii bolii la aceste generaii.

n forma adult a distrofiei miotonice, defectul molecular ce rezult din mutaia genetic s-a

dedus a fi o protein cu omologie cu o cAMP dependent protein kinaz. Ea a fost denumit o

miotonin-protein kinaz. Datele electrofiziologice subliniaz anomalii n membran care produc un

potenial de repaus mai sczut atribuit probabil unei conductane ionice alterate. Este posibil ca

protein kinaza alterat genetic s ndeplineasc n mod normal un rol n modularea funciei

canalelor ionice prin fosforilare, i ca protein kinaza mutat s nu poat exercita aciunea sa.

Dup cum s-a subliniat, miotonia este definit ca o relaxare ntrziat a muchiului n urma

contraciei. Studiile electrofiziologice demonstreaz o depolarizare rapid urmat de o repolarizare

ntrziat. Astfel, indivizii afectai frecvent prezint simptome asociate funciei neuromusculare, n

special slbiciunea i adesea rigiditatea muscular cu eventuala atrofie a muchilor afectai. De

asemenea, ali muchi pot fi afectai n special la nivelul intestinului i inimii. Ca rezultat,

dificultide digestie i aritmiile nu sunt neobinuite. Ptoza (cderea pleoapelor) este frecvent pe

lng formarea de cataract (pierderea transparenei cristalinului). De asemenea se remarc i o

implicare endocrin, mai proieminent la masculi datorit degenerrii testiculare. O proporie

semnificativ de pacieni prezint schimbri de personalitate i somnolen marcant.

Electromiografia este util n clarificarea diagnosticului de distrofie miotonic. Miotonia

simptomatic se poate ameliora cu procainamid sau fenitoin.

Slbiciunea muscular episodic - paralizia periodic.

189

Spre deosebire de bolile prezentate anterior, anumite stri patologice ale funciei musculare

manifest fluctuaii de slbiciune, astfel nct ntre atacuri individul este normal sau aproape

normal. Proieminente ntre acestea sunt paraliziile periodice i miastenia gravis (cea mai comun

boal primar a transmisiei neuromusculare. Cauza obinuit este o anomalie imunologic

dobndit dar n anumite cazuri rezult din anomalii genetice la nivelul jonciunii neuromusculare).

Exist cteva forme de boli paralitice periodice, care manifest anumite trsturi, ce ar putea sugera

medicului categoria de boal. n mod surprinztor, paralizia se produce cnd exerciiul este urmat

de repaus complet i poate fi abrogat prin exerciiul blnd continuu. n timpul atacurilor se produc

reflexe de tendon sczute, principalul factor de mediu provocator fiind frigul.

Este cunoscut c cauzele secundare ale hipocalemiei i hipercalemiei, determinate de pierderile

i retenia de potasiu respectiv, sunt asociate cu anomalii n funcia neuromuscular. n acestecauze

secundare, nivelul seric de K+ scade ntotdeauna n afara nivelului normal (3,5-5,5 mEq/ l). n

paralizia periodic primar, totui, defectul rezid n membrana muscular, permind astfel atacuri

cu nivele de K+ n domeniul normal. n toate formele de paralizie periodic, membrana muscular

devine totui inexcitabil determinnd episoade de paralizie.

ntr-un pacient cu paralizie periodic hipercalemic, modificarea unei singure baze n gena

pentru canalul de sodiu a determinat substituia metioninei la valin. Celulele din acest pacient au

fost crescute n cultur i examinate prin metode patch-clamp (Tehnica patch-clamp (Neher, 1992)

este o metod central n electrofiziologia modern. Ea permite nregistrarea curenilor unui singur

canal de ioni, sau alternativ curenii dintr-o celul ntreag. Ea folosete o pipet de sticl ca un

electrod care este aplicat uor pe membrana celular). Cnd K+ a fost crescut n mediul de cultur,

anumite canale de sodiu din celulele pacienilor nu s-au comportat normal. n mod specific, dei

aceste canale s-au deschis cnd membrana a fost depolarizat, ele nu au reuit s se nchid (cum

fac n mod normal) la sfritul ciclului de repolarizare. Rezultatul rmnerii deschise a anumitor

canale de sodiu este de a permite ionilor de sodiu n exces s intre n celul, mpiedicnd

repolarizarea celulei i generarea unui alt potenial de aciune. Consecina depolarizrii este

paralizia muscular.

Miopatii metabolice.

Glucoza (derivat din glicogenul muscular) i acizii grai satisfac diferitele necesiti ale

muchilor. n timpul condiiilor sedentare, acizii grai satisfac preponderent necesitile energetice.

Totui, cnd muchii sunt stresai n momentul exerciiului intens, glicogenul satisface necesitile

energetice n aceast stare relativ hipoxic.

Glicogenul intracelular este principalul combustibil glucidic pentru muchi, fiind important n

special pentru exerciiul de durat. Totui, lipidele, predominant sub form de acizi grai i cetone,

sunt combustibilul dominant pentru muchii n repaus i n timpul exerciiului uor pn la mediu

190

prelungit. Datorit limitrii depozitelor de glicogen n muchi, cnd exerciiul este prelungit pentru

mai mult de 40 minute, acizii grai susin necesitile energetice musculare crescute.

Muchiul este situsul diferitelor erori nnscute ce implic fie metabolismul glucidelor fie al

lipidelor. Modelul bolilor metabolice ereditare ale muschilor este deficiena n fosforilaz (Boala

McArdles sau boala de depozitare a glicogenului de tip V). Aceti pacieni sunt incapabili s

foloseasc glicogenul muscular ca surs de energie i trebuie s depind de glucoza din snge (care

nu este o surs de energie pentru muchi la fel de bun ca glicogenul) i de acizii grai. O

caracteristic a acestei boli i a celor din calea glicolitic (vezi mai jos) este incapacitatea de a

produce lactat cu exerciiul ischemic.

O alt boal de depozitare a glicogenului este cea de tip VII sau boala Tauris, caracterizat prin

durere muscular, contractur i intoleran la exerciiu dup lucrul ischemic. Eaeste determinat de

absena fosfofructokinazei musculare i ca i n boala McArdles se nregistreaz ocazional

mioglobinuria.

Boala Pompes sau boala de depozitare a glicogenului tip II este determinat de absena -1,4

glucozidazei i este cea mai sever form de depozitare a glicogenului. Ea poate afecta inima,

determinnd cardiomegalie.

Miopatiile inflamatorii de etiologie necunoscut-polimiozita

Polimiozita este o boal inflamatorie a muchiului scheletic ce se produce cu o frecven de

1/200 000 de persoane anual. Dei cauza este necunoscut, patogeneza bolii este atribuit

autoimunitii. Muchii afectai prezint degenerare i regenerare simultane, necroz parial a

fibrei musculare cu fagocitoz macrocitic, infiltrat de celule mononucleare, i zone de atrofie i

fibroz. n poliomiozita neasociat cu malignana, exist o frecven a cazurilor la sexul femeiesc cu

peak-uri la 12 i 50 de ani. Dintre acestea, aproximativ 50% vor regresaspontan iar cealalt jumtate

poate evolua n ru cu moarte ce rezult din aritmiile cardiace. Tratamentul ntreprins este cu

steroizi ca n multe alte boli autoimune dei nu exist studii controlate care s-i demonstreze

eficacitatea.

Modificri ale enzimelor serice n bolile musculare

O treime din masa corporal este reprezentat de musculatur, care conine cantiti importante

de CK-MM, LDH4-5, aldolaz (ALD) i cantiti relativ reduse de ASAT. Ar trebui deci ca orice

leziune muscular s se nsoeasc de creteri marcante ale acestor enzime din ser.

Gradul de modificare a activitii serice a enzimelor menionate depinde ns n mare msur de

activitatea musculaturii i implicit de fluxul sanguin capabil s antreneze n torentul circulator

enzimele scurse din musculatura lezat. Aa se explic faptul c, dup contuzii sau chiar dup

intervenii chirurgicale, care produc leziuni limitate ale musculaturii,creterile activitilor serice ale

191

CK i LDH nu sunt deosebit de accentuate, musculatura lezat fiind pus n repaus i avnd o

circulaie sanguin restrns.

Pe de alt parte, efortul fizic intens, care antreneaz o cretere important a fluxului sanguin n

musculatur, poate duce la creteri semnificative n CK, cauzate probabil de o hipoxie trectoare.

De altfel, hipoxia sever i generalizat a musculaturii, survenit n strile de oc, se

nsoetedecreteri importante ale enzimelor provenitedin musculatur

Creteri moderate dar semnificative ale CK-MM se pot decela i dup injecii intramusculare cu

tetraciclin, penicilin, diazepam i antiaritmice. De altfel, leziunile toxice ale musculaturii ntre

care i o intoxicaie acut cu alcool, pot duce n unele cazuri la o aa numit rabdomioliz i la

creteri extrem de accentuate de CK (izoenzima CK-MM).

Distrofiile musculare reprezint ns principalul domeniu n care determinrile de enzime i

gsesc valoare diagnostic. De fapt, creteri extrem de accentuate ale CK (izoenzima CK-MM) care

depesc de 10-30 ori limita superioar a normalului se ntlnesc n distrofia muscular progresiv

i mai ales n tipul Duchenne. Important este faptul c cele mai importante creteri ale CK se

constat n fazele de debut ale unei distrofii musculare progresive, cnd manifestrile clinice

locomotorii sunt relativ mai puin exprimate, iar pierderile de mas muscular sunt nc relativ

reduse. Pe msur ns ce boala progreseaz i musculatura este nlocuit cu esut conjunctiv i

adipos, activitatea CK scade, astfel nct la bolnavii imobilizai activitatea enzimelor serice ajunge

adesea la valori n limite normale. Dac pe lng creterea izoenzimei CK-MM se constat i valori

crescute ale izoenzimei CK-MB se poate bnui c procesul distrofic intereseaz i miocardul.

Determinrile de CK i ALD pot fi utile i pentru stabilirea mecanismului genetic de transmitere

a acestei anomalii cu caracter familial, care se transmite prin femei (gena patologic legat de

cromozomul X) i care d manifestri clinice doarla subiecii de sex masculin nscui din mame

care prezint o alel mutant. De fapt femeile purttoare ale alelei mutante i care transmit

anomalia, prezint de regul, nivele serice de CK i ALD situate deasupra limitei superioare a

normalului.

Pe lng determinrile enzimelor i izoenzimelor prezentate anterior, diagnosticul i

monitorizarea leziunilor miocardului i ale musculaturii striate mai beneficiaz de pe urma dozrilor

imunochimice ale unor proteine specifice acestor esuturi i trecute n ser. De exemplu, orice

leziune acut a esuturilor musculare i miocardului duce la eliberarea de mioglobin, care avnd o

greutate molecular relativ redus (aprox. 17000) se elimin prin urin i poate fi detectat n acest

produs de excreie.

O importan mai mare se acord dozrilor serice de troponin T (Troponina este o protein cu 3

subuniti cu o MM de aprox 70000 Da i constituie aproximativ 4,5% din proteina total a

miofibrilelor. Exist 3 subuniti de troponin care sunt definite ca troponin C (component de

legare a Ca), troponin T (component de legare a tropomiozinei) i troponina I (componenta

192

inhibitoare, ce inhib interaciile actinei i miozinei n prezena ATP dar n absena Ca). Aceast

protein din structura musculaturii striate i din miocard contribuie mpreun cu actina i

tropomiozina la formarea miofibrilelor. Metode imunochimice bazate pe utilizarea anticorpilor

monoclonali au reuit s identifice i s dozeze difereniat o troponin T de origine muscular i o

TnT specific miocardului. Se consider c determinrile de TnT miocardic ar fi mai specifice

pentru leziunile miocardului dect dozrile de enzime, c TnT ar crete mai repede dect CK i c

aceast cretere ar fi mai persistent chiar dect creterea activitii LDH. Totui durata unei dozri

de TnT printr-un procedeu ELISA este ns de 90 min, n timp ce determinarea activitii CK nu

depelte 7 min. Acest neajuns, ca i costul ridicat al reactivilor pentru dozarea TnT miocardic (care

necesit anticorpi monoclonali) restrng utilizarea acestei dozri imunochimice doar pentru situaii

particulare (lezri concomitente ale musculaturii i miocardului, diagnosticul retrospectiv al

miocardului).