N°3 Noviembre 2011AVANCE

Creatinina UV Liquid One Step

AVANCEPublicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L. Necochea 3274 Rosario

CREATININA U.V.Liquid One Step

Método Enzimático U.V. para determinar creatinina en suero, plasma y orina.

GT Lab ha introducido un método enzimático U.V. para la determinación de creati-nina en fluidos biológicos que, no emplea ácido pícrico en su composición.Desde los trabajos de Jaffé hace más de 130 años (1), el uso del ácido pícrico para la determinación de creatinina en líquidos biológicos ha sido ampliamente usado. Jaffé había encontrado que la creatinina reaccionaba en medio fuertemente alcali-no con ácido pícrico originando un compuesto (complejo de Janovski) de color rojo, cuya concentración es directamente proporcional a la concentración de creatinina en la muestra. Este hallazgo permitió el desarrollo de un amplio abanico de determinaciones basa-das en la formación de este complejo y su medición espectrofotométrica.No obstante, no pocos son sus inconvenientes, tanto desde el punto de vista de su especificidad como de cuestiones prácticas.En efecto, existen muchas sustancias, además de la creatinina, que reaccionan con el ácido pícrico en las condiciones de reacción habituales, las que se denominan “sustancias Jaffé positivas”. Entre ellas podemos mencionar al ácido ascórbico, glu-cosa, piruvato, acetona, proteínas, ácido acetoacético, ácido úrico y antibióticoscefalosporinas. Para evitar la interferencia de las proteínas se empleó inicialmente la desproteiniza-ción de las muestras, lo cual resultaba engorroso y no impedía la interferencia de otras sustancias Jaffé positivas no precipitables.Se buscó superar estos inconvenientes estudiando la diferente velocidad de reac-ción entre la creatinina y las otras sustancias Jaffé positivas. Así, se desarrollaron diferentes variantes de métodos cinéticos con relativo éxito, ya que aun en estas condiciones las interferencias suelen ser importantes.Pero en cualquiera de las variantes en que se intentó superar el problema de la inespecificidad intrínseca de la reacción de Jaffé, persistían los problemas prácticos, principalmente el uso de un reactivo fuertemente alcalino y corrosivo y la presencia del mismo ácido pícrico con su alto poder de tinción sobre los elementos del labo-ratorio incluida la vestimenta del operador. Estas limitaciones se hicieron aun más importante con el advenimiento del uso de sistemas automatizados, a los que el laboratorista se resiste a deteriorar con el uso de un reactivo tan agresivo.Consecuentemente, la búsqueda de una alternativa enzimática que superara estos cuestionamientos a los antiguos métodos químicos y que fuera compatible con el uso de analizadores automáticos se hizo una necesidad.

N° 3 Noviembre 2011

N°3 Noviembre 2011AVANCE

Creatinina UV Liquid One Step

La creatinina es generada por el metabolismo a partir de la

creatina, en un mecanismo fundamental de provisión de ener-

gía muscular. Aproximadamente el 2% de la creatina corporal

es convertido en creatinina cada día, la que es excretada en

la orina.

La creatinina ha sido tomada como un indicador muy con-

fiable de la función renal. Cuando el riñón tiene algún tipo

de compromiso, el nivel sérico de creatinina aumenta, ad-

virtiendo sobre un mal funcionamiento incluso antes de que

el paciente reporte síntomas. Esto lleva a la conveniencia de

dosar creatinina en sangre y en orina dentro de la rutina del

laboratorio.

Los valores normales de creatinina son aproximadamente 0.5-

1.2 mg/dl. Individuos jóvenes o de edad media musculosos

pueden tener valores mayores, mientras los ancianos tienden

a tener valores menores. Por su lado, en la infancia la creatini-

nemia puede oscilar alrededor de 0.2 mg/dl, dependiendo del

desarrollo muscular. Pacientes con un solo riñón suelen tener

normalmente niveles de 1.8-1.9 mg/dl.

Niveles de 2.0 mg/dl en bebés y de 10.0 mg/dl en adultos

pueden indicar necesidad de diálisis. (3)

Ciertas drogas pueden provocar valores anormalmente altos

de creatinina, por lo que conviene consultar los trabajos de D.

Young (2), entre otros.

Los niveles de creatinina también aumentan después de cier-

tas ingestas, como carnes asadas.

Hay una gran variedad de patologías que producen hipercrea-

tininemia: anemia hemolítica autoinmune, leucemias, infarto

de miocardio, glomerulonefritis aguda posestreptocócica,

pielonefritis, falla renal, embolismo, trombosis, amiloidosis,

endocarditis bacteriana, hipertrofia prostática, diferentes car-

cinomas, diabetes, pre-eclampsia, falla hepática, leptospiro-

sis, etc,

Disminuciones de creatininemia se observan en anorexia ner-

viosa, eclampsia, hipertiroidismo y cirrosis.

Por su parte, la excreción de creatinina en orina es constante

durante el día y proporcional a la masa muscular, producién-

dose aumentos fisiológicos tras ingestión de alimentos que

aumentan su nivel sérico.

Las patologías que aumentan la creatininuria son acrome-

galia, gigantismo, hipotiroidismo, infección e hipertensión

renovascular. Disminución de creatininuria puede observarse

en una amplia variedad de patologías, como dermatomiosis

activa, enfermedades renales (antes del nivel final de fallo re-

nal), demencia tipo Alzhemier, esclerosis amiotrófica, anemia,

hipertiroidismo, leucemia, distrofia muscular, parálisis, pre-

eclampsia, distrofia muscular progresiva y malnutrición.

La concentración sérica de creatinina y la depuración (clea-

rance) de creatinina endógena (D.C.E.) son índices aceptados

de la velocidad

de filtración glomerular y son usados en el laboratorio clínico

para evaluar la función renal.2

INTRODUCCIÓN

La determinación de creatinina por el método enzimático ul-

travioleta se basa en la siguiente reacción:

CDI

Creatinina + H2O ---------> N-metilhidantoína + NH3

GlDH

NH3 + 2-oxoglutarato + NADH ---------> glutamato + NAD+

La creatinina es hidrolizada por la Creatinin Deiminasa (CDI),

con producción de N-metihidantoína y amoníaco. Este, a su

vez, reacciona con el 2-oxoglutarato del medio por acción de

la glutamato dehidrogenasa (GlDH) con consumo de NADH,

produciendo NAD y glutamato. La disminución de lectura a

340 nm mide el descenso de concentración del NADH en el

medio, siendo éste directamente proporcional a la concentra-

ción de creatinina en la muestra. (4)

PRINCIPIO

R1: solución lista para usar.

R2: solución lista para usar.

Enzima 1: reactivo en polvo para disolver en el frasco de R1.

Enzima 2: reactivo en polvo para disolver en el frasco de R2.

Estándar: solución lista para usar.

REACTIVOS PROVISTOS

GIDH……… 900 U/l Tris……… 50 mmol/l, pH = 8.2

CDI………… 1500 U/l 2-oxoglutarato de sodio.4.8 mmol/l

NADH…0.24 mmol/l Cloruro de magnesio… 3.0 mmol/l

COMPOSICIÓN FINAL DE LOS COMPONENTES EN EL MEDIO

Conservación: Refrigerador (2-8º C). Proteger de la luz.

Estabilidad: 1 mes.

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS DE TRABAJO

MUESTRASuero o plasma heparinizado o con EDTA: Debe separarse

dentro de los 30 minutos de extraída la muestra.

Orina: puede trabajarse con orina de 2 ó de 24 horas. Debe

recogerse en recipiente limpio y mantenerse en refrigerador.

Use el sobrenadante límpido. Diluya 1:50 con agua deioniza-

da libre de amonio, antes de ensayar.

Condiciones de conservación de las muestras

Refrigerador (2-8ºC): estable 24 horas.

Congelador (-20ºC): estable 3 meses.

Sustancias interferentes

No se han detectado interferencias por componentes usuales

de los líquidos biológicos objeto de ensayo. Se recomienda

la lectura del trabajo de D.S. Young mencionado en BIBLIO-

GRAFIA.

PROCEDIMIENTO

N°3 Noviembre 2011AVANCE

Creatinina UV Liquid One Step

3

Condiciones de reacción:

Espectrofotómetro a 340 nm (Hg 334 ó 366 nm)

Temperatura: 30-37ºC

PREVIAMENTE, ATEMPERE EL REACTIVO DE TRABAJO.

En dos tubos marcados E (estándar) y D (desconocido)

agregue:

E D

R1 de Trabajo 300µl 300µl

Estándar 50µl ------

Muestra ------ 50µl

Mezcle. Incube exactamente 5 minutos a 30° ó a 37°C y obtenga las lecturas finales E

2 y D

2 en

espectrofotómetro a 340nm.

CÁLCULOSCreatinina sérica (plasmática)

D1 – D2

------- x 2,0 = mg/dl creatinina

E1 – E

2

Creatinina urinaria

Muestra de 24 horas:

D1 – D

2 2,0 50

------- x ---- x ---- x diuresis (ml) = g creatinina/24 h

E1 – E

2 1000 100

D1 – D

2

------- x diuresis (l) = g creatinina/24 h

E1 – E

2

Muestra de 2 horas:

D1 – D

2 2,0 50

------- x ---- x ---- x volumen (ml) x 12 = g creatinina/24 h

E1 – E

2 1000 100

D1 – D

2

------- x volumen (l) x 12 = g creatinina/24 h

E1 – E

2

Depuración de creatinina endógena

g creatinina en orina/24 h

DCE = ------------------------------- x 69,4 = ml/min

mg creatinina en suero/dl

Para obtener los datos de concentración en unidades µmol/l,

multiplique el dato expresado en mg/dl por 88.5.

EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DEL MÉTODOa- Comparación con otros métodos:

En el desarrollo del producto se efectuaron comparaciones de

muestras contra reactivos comerciales aprobados por ANMAT,

tomados como referencia. Los resultados se muestran en la

TABLA I, expresados en mg/dl de creatinina. Estos datos están

representados en los GRAFICOS 1 a 3.

En base a los datos de dicha tabla se obtuvieron las siguientes

ecuaciones de regresión:

Contra GT Lab Jaffé Cinético:

Ecuación de regresión: y= 0,6759 x + 0,1682

Coeficiente de correlación: 0,9863

Contra método Jaffé cinético comercial origen nacional:

Ecuación de regresión: y= 0,6521 x + 0,2459

Coeficiente de correlación: 0,9842

Contra método enzimático UV comercial origen europeo:

Ecuación de regresión: y= 1,0209 x - 0,0254

Coeficiente de correlación: 0,9982

b- Sensibilidad:

La sensibilidad en espectrofotómetro a 340 nm, leyendo en

cubetas de caras paralelas con un paso de luz de 1 cm, es

aproximadamente 0,02 mg/dl.

c- Especificidad:

Los métodos químicos habitualmente usados, basados en la

reacción de Jaffé con picrato alcalino, dan reacción con otras

sustancias Jaffé positivas además de la creatinina.

El método enzimático está libre de tal interferencia. En este

método, el amoníaco endógeno es eliminado en la primer in-

cubación, con lo que el método resulta específico para crea-

tinina.

d- Linealidad:

La reacción cumple con la ley de Lambert & Beer entre 0 y 10

mg/dl (900 µmol/l).

e- Recuperación:

La recuperación obtenida por agregado de cantidades cono-

cidas de creatinina a muestras biológicas estuvo entre el 99,0

y el 103,1%, dentro del rango establecido en d-.

f- Reproducibilidad:

Se procesaron pooles de muestras de personas caucásicas,

adultas, sin antecedentes de patologías que no fueran las

asociadas con valores anormales de creatinina. Las muestras

se conservaron congeladas a -20ºC durante todo el tiempo

entre ensayos. Los resultados para los estudios intra e interen-

sayo se muestran en la TABLA II y en la TABLA III.

g- Inexactitud e Imprecisión:

El tratamiento estadístico de la inexactitud e imprecisión es-

tán desarrollados más arriba en “Comparación con otros mé-

todos” y en “Reproducibilidad”.

Resultados incorrectos pueden obtenerse si no se respetan

estrictamente las indicaciones dadas en el Manual de Instruc-

ciones sobre Procedimientos de Uso, Calidad de la Muestra,

uso de anticoagulante, etc.

SUSTANCIAS DE REFERENCIA Y /O PATRO-NES EMPLEADOSEl Estádar empleado tiene trazabilidad al Standard Reference

Material #909b (National Institute of Standards and Techno-

logy, EEUU): suero humano liofilizado.

N°3 Noviembre 2011AVANCE

Creatinina UV Liquid One Step

4

CONTROL DE CALIDADSe recomienda procesar juntamente con las muestras, sueros

control normal y anormal para controlar el desempeño del

ensayo. Se aconseja el uso de Qualiset Sueros Control Nivel 1

y 2 GT Lab (Códigos 602105 y 602205)

Cada Laboratorio debe diseñar su propio sistema de Control

de Calidad Interno y establecer las medidas correctivas si se

superan los límites de tolerancia aceptables.

VALORES DE REFERENCIASuero o plasma: 0.5-1.2 mg/dl

Orina: 0.8-2.0 g/24 hs

D.C.E.: 80-140 ml/min en adultos hasta 60 años

Cada laboratorio debe determinar su propio rango de acuerdo

a la población involucrada.

USO EN AUTOMATIZACIÓNLa TABLA IV indica los parámetros a usar en la aplicación de la

técnica a instrumentos automatizados.

Están disponibles adaptaciones para diferentes auto analiza-

dores. Solicítelos a infoprofesional@gtlab.com.ar.

TABLA Icomparación con métodos como referencia (resultados expresados en mg/dl)

Muestra N° Creatinina Jaffe cinético GT Lab

Método UV Enzimático GT Lab En ensayo

Método Jaffe Cinéti-co Comercial Origen

Nacional

Método Enzimáti-co UV Comercial Origen Europeo

123456789101112131415161718192021

0,6180,5391,9750,0970,9841,7581,1881,6341,0880,2711,3960,8050,4570,5201,3761,6761,5480,9451,8561,518

0,238

0,4140,3311,3840,0980,7421,2720,7801,0780,6690,1981,0140,5110,3410,4440,9011,2261,011

0,6381,1291,1880,183

0,6120,5442,0740,0991,0141,8461,2361,6011,153

0,2871,3680,7890,4750,5361,4171,6761,5790,9921,9491,5790,233

0,4180,3151,3570,0950,7341,2470,7411,0890,6820,1920,9740,4900,3450,4570,9281,1641,0420,6061,1071,1290,176

N°3 Noviembre 2011AVANCE

Creatinina UV Liquid One Step

5

TABLA IIReproducibilidad intra ensayo

Estándar =0,106 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

Muestra Lectura mg/dl Lectura mg/dl Lectura mg/dl

12345678910

0,06530,06570,06820,07110,06730,07170,06810,07140,06660,0668

1,231,241,291,341,271,351,281,351,261,26

0,22950,23690,23230,24050,23010,22240,23080,23790,24110,2401

4,334,474,384,544,344,204,354,494,554,53

0,52920,52720,52170,52520,50690,50370,50580,51330,53710,5190

0,52920,52720,52170,52520,50690,50370,50580,51330,53710,5190

Promedio 1,29 4,42 9,79

SD mg/dl+

C.V. %+

0,045 3,5

0,115 2,6

0,212 2,2

TABLA IIIReproducibilidad inter ensayo

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

Día Estandar Lectura mg/dl Lectura mg/dl Lectura mg/dl

12345678910

0,09800,10440,10670,09810,10170,10470,10430,10370,09730,1061

0,06660,06640,06820,07030,06530,07040,06840,06570,06880,0658

1,361,271,281,431,281,341,311,271,411,24

0,24560,22980,24710,23470,23820,22750,23870,24680,23550,2362

5,014,404,634,784,684,354,584,764,844,45

0,50130,49700,50080,50240,50140,50130,49650,49580,49130,4949

10,239,529,3910,249,869,589,529,5610,109,33

Promedio 1,32 4,65 9,73

SD mg/dl+

C.V. %+

0,065 4,9

0,210 4,5

0,347 3,6

N°3 Noviembre 2011AVANCE

Creatinina UV Liquid One Step

6

TABLA IVParámetros para automatización

N°3 Noviembre 2011AVANCE

Creatinina UV Liquid One Step7

GRÁFICO I

GRÁFICO II

GRÁFICO III

Parámetros para automatización

N°3 Noviembre 2011AVANCE

Creatinina UV Liquid One Step

8

Referencias Biográficas

1- Jaffe M: Über den Niederschlag welchen Pikrinesäure in normalen Harn Erzeugt

und über eine neue Reaktion des Kreatinins. Z.Physiol.Chem. 10:391-400;1880

2- Young DS: Effects of disease on Clinical Lab. Tests. 4th Ed. AACC Press, 2001

3- Perrone RD, Madias NE, Levey AS: Serum creatinine as an index of renal

function; new insights into old concepts. Clin Chem 38:1933-53; 1992.

4- Sontagg O, Büttner J: Evaluation of an UV method for the determination of

creatinine compared with Ektachem 700 and Fuller’s earth method. Clin.Chem.

36/6:1179;1990.