1

Protocol de cercetare

Modularea răspunsului la radioterapie în cancerul de col uterin prin compuşi biologici cu acţiune asupra mecanismelor moleculare ale cancerogenezei

- ANGIOCOL – -

Proiect CNCSIS multianual de cercetare ştiinţifică ( PN-II- IDEI-PCE-2008-2). Cod: 1532

Perioada de derulare: 2009-2011

Director proiect: NAGY VIORICA MAGDALENA

Echipa de cercetare

BALACESCU OVIDIU BUIGA RARES POTCOAVA BRIE IOANA CARMEN LELUTIU LUMINITA TODOR NICOLAE TUDORAN OANA

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu” Institutul Oncologic “Prof.I.Chiricuţă”

Cluj-Napoca 2009

2

CUPRINS

1. INTRODUCERE 2. OBIECTIVELE STUDIULUI

3. METODOLOGIA CERCETǍRII

3.1. Includerea în studiu a pacientelor cu cancer de col uterin

3.2. Includerea în studiu a pacientelor cu afecţiuni benigne ale colului uterin

3.3. Înregistrarea în baza de date

3.4. Protocol de recoltare probe biologice

3.5. Protocol experimental de anatomie patologică

3.6. Protocol experimental de genomică funcţională

3.7. Determinarea nivelului seric si din piesele tumorale de exereză chirurgicala a

EGFR, VEGFR SI COX -2

3.8. Protocolul cercetării clinice

4. ANEXE 4.1. Consimţământ informat 4.2. Schemă Angiocol

3

1. INTRODUCERE

Cancerul de col uterin pe plan mondial se află pe locul doi în rândul tumorilor maligne la femei, anual înregistrându-se aproximativ 500 000 cazuri noi şi 250 000 de decese. 45% din femeile diagnosticate cu cancer de col uterin au vârsta între 40-50 ani. Deşi cancerul de col uterin este o boală prevenibilă, în România reprezintă o problemă de sănătate publică, anual fiind înregistrate cca 3500 cazuri noi şi 1900 decese, situându-ne pe primul loc în Europa în privinţa incidenţei şi mortalităţii prin cancer de col uterin. Din cazurile noi diagnosticate cca 70% sunt în stadii avansate, în care rezultatele tratamentelor clasice (chirurgia, radioterapia, şi mai nou chimioterapia) sunt modeste: în stadiul IIB 70% supravieţuire la 5 ani, în stadiul IIIA 50%, în stadiul IIIB 40-30%, iar în stadiul IVA 10%.

Tratamentul clasic al cancerului de col uterin este chirurgia şi radioterapia (RT), iar ca rezultat al cercetărilor din ultimii zece ani standardul de aur al stadiilor avansate sau a stadiilor incipiente dar cu risc crecut de eşec a devenit radio-chimioterapia (RCT) concomitentă, care s-a dovedit superioară radioterapiei singure, ducând la o îmbunătăţire semnificativă, cu 15% a supravieţuirii generale. Cu toate acestea aproximativ 50% din paciente prezintă recidivă locală sau metastaze la distanţă în primii doi ani după tratamentul iniţial. Deoarece valorificarea factorilor de prognostic clinici şi histologici validaţi, precum şi eficacitatea tratmentelor clasice a ajuns la un platou, se impune intensificarea tratamentelor actuale pe baza unor noi factori de prognostic şi introducerea de noi strategii terapeutice.

Angiogeneza reprezintă o treaptă importantă în creşterea tumorală, motiv pentru care

este mult studiată prin investigarea unor biomarkeri, rezultatele studiilor publicate însă sunt contradictorii şi în parte incomplete. Totusi, pe lângă valoarea lor prognostică, inhibarea acestor biomarkeri ar putea avea efect terapeutic în mai multe situaţii.

Neovascularizaţia este o etapă importantă a progresiei tumorale de la leziunile in situ la boala extinsă şi metastatică, de aceea pe baza unor modele preclinice, ţintirea vaselor sanguine tumorale pare să fie o strategie anticanceroasă atractivă. În principiu tratamentul antiangiogenic poate determina, pe lângă prevenirea formării de noi vase, sensibilizarea celulelor endoteliale la efectul tratamentului citotoxic. Acest efect poate fi direct prin blocarea moleculelor angiogenice care cresc supravieţuirea celulelor endoteliale (ex. factorul de creştere endotelial vascular -VEGF) sau indirect, interferând cu recrutarea de către factorii angiogenici a celulelor derivate din măduva osoasă la nivelul ţesutului tumoral în vederea neovascularizaţiei. Astfel, deşi în fază incipientă de cercetare clinică, combinarea tratamentelor ţintite angiogenice cu radio-chimioterapia actuală pare să reprezinte o nouă modalitate de abordare fezabilă şi promiţătoare în mai multe cancere, inclusiv în cancerul de col uterin.

Câteva din provocările combinării tratamentelor antiangiogenice cu radio-chimioterapia sunt: monitorizarea răspunsului tumoral la substanţe antiangiogene, utilizând biomarkeri pentru identificarea pacienţilor responsivi şi stabilirea dozelor optimale; estimarea eficacităţii acestor noi regimuri care includ compuşi antiangiogenici; prevenirea lipsei de răspuns la acest tip de tratament.

4

Densitatea microvascularizaiei (MVD – microvessel density) este studiată şi considerată ca fiind o masură de evaluare a angiogenezei, luând în considerare posibila influenţă negativă asupra supravieţuirii în cancerul de col uterin.

Expresia receptorului factorului de creştere epidermal (EGFR – epidermal growth

factor receptor) s-a dovedit în unele studii a fi un factor independent de prognostic nefavorabil pentru cancerul de col uterin, în timp ce alte studii nu au confirmat acest rezultat. Inhibarea EGFR în cursul RT pare a fi o strategie terapeutică promiţătoare în unele carcinoame scuamoase. Astfel asocierea radioterapiei cu anticorpii EGFR (ex. Cetuximab) în cancerele ORL poate duce la îmbunătăţirea controlului loco-regional şi a supravieţuirii, în comparaţie cu radioterapia singură. Mecanismele care stau la baza acestei asocieri încă nu sunt bine cunoscute, ele putând fi multiple: moartea celulelor stem canceroase produsă direct de inhibitorii EGFR, radiosensibilizarea celulară produsă de modificarea transducţiei semnalului, inhibarea reparării leziunilor ADN, reducerea repopulării în cursul RT, etc. Aceste ipoteze impun studiul inhibitorilor EGFR şi a eficacităţii lor in combinaţie cu alte tratamente, ca RT sau CT, precum şi studiul efectelor secundare la nivelul ţesuturilor normale.

Factorul de creştere endotelial vascular (VEGF – vascular endothelial growth factor)

este o citokină cu funcţie centrală în angiogeneză. Acest factor este eliberat de celula tumorală şi induce formarea reţelei capilare din jurul tumorii. Corelarea angiogenezei cu prognosticul, respectiv răspunsul terapeutic, arată că expresia preterapeutică crescută a VEGF tumoral, determinat imunohistochimic, pare să aibă impact nefavorabil asupra prognosticului pacientelor cu cancer de col uterin, atât în ce priveşte supravieţuirea generală, cât şi supravieţuirea fără semne de boală. Analiza imunohistochimică a expresiei VEGF este o metodă rapidă de identificare a pacientelor cu risc crescut de recidivă după RCT şi poate fi utilizată pentru identificarea pacientelor care pot beneficia de alte metode terapeutice noi. VEGF a fost identificat în numeroase studii ca un factor de prognostic independent pentru supravieţuire, în timp ce în alte studii nu s-a dovedit influenţa sa asupra supravieţuirii. Mai mulţi investigatori au raportat corelarea expresiei VEGF cu invazia tumorală sau metastazarea ganglionară. Ţintirea VEGF ca o nouă strategie terapeutică este larg explorată în mai multe localizări tumorale.

Expresia Ciclooxygenazei-2 (COX-2) s-a observat a fi corelată cu invazia ganglionară

şi invazia parametrială în cancerul de col uterin. Expresia crescută a COX-2 la paciente cu cancer de col uterin pare să fie un predictor al răspunsului slab la chimioterpia neoadjuvantă şi al mortalităţii ridicate. Inhibarea COX-2 poate să crească radiosensibilitatea tumorală fără să afecteze semnificativ răspunsul ţesuturilor normale la iradiere].

Deşi s-au realizat numeroase cercetări, până la ora actuală sunt doar foarte puţine

studii care să investigheze concomitent mai mulţi biomarkeri la acelaşi lot de pacienţi trataţi omogen. Câteva studii au descris impactul negativ al markerilor angiogenici în cancerul de col uterin, dar cuantificarea angiogenezei este dificilă. Până la ora actuală studiile publicate au fost retrospective, cuprinzând populaţii neomogene în ce priveşte caracteristicile tumorale şi tratamentul aplicat. Rezultatele sunt contradictorii, neexistând

5

o concepţie unitară asupra utilităţii prognostice şi terapeutice a acestor biomarkeri în nici o localizare tumorală, ceea ce impune noi cercetări în acest domeniu.

Validarea semnificaţiei prognostice a acestor biomarkeri ai angiogenezei tumorale, corelarea acestora cu factorii de prognostici clinici (stadiu, volum tumoral, valoarea preterapeutică a hemoglobinei, doza de iradiere), stabilirea impactului lor asupra supravieţuirii în cancerul de col uterin poate deschide noi perspective în identificarea pacientelor cu risc crescut de recidivă şi introducerea de noi strategii terapeutice ţintite, cu scopul imbunătăţăirii rezultatelor actuale.

Pentru aceasta propunem un studiu prospectiv, care să cuprindă un grup omogen de paciente, cu cancer de col uterin, stadiile IB-IIIB, incluse în două braţe terapeutice: chirurgie primară (pentru stadiile incipiente), respectiv radio-chimioterapie concomitentă (stadiile avansate), la care să fie evaluat un set de factori angiogenetici tumorali şi serici, care vor fi analizaţi din punctul de vedere al valorii prognostice, a corelării cu factorii de prognostici clinici cunoscuţi şi a capacităţii de a identifica pacientele cu risc crescut de deces.

2. OBIECTIVELE STUDIULUI

Studiul de faţă propune examinarea unui pachet de biomarkeri ai angiogenezei în cancerul de col uterin având mai multe scopuri:

- Cunoaşterea mai exactă a mecanismelor moleculare şi a istoriei naturale a bolii - Identificarea şi validarea unor noi factori de prognostic - Validarea unor factori predictivi ai răspunsului la radiochimioterapie - Conturarea şi introducerea de noi strategii terapeutice cu potenţial curativ superior

celor clasice Deşi în fază incipientă de cercetare clinică, combinarea tratamentelor ţintite angiogenice cu radiochimioterapia actuală pare să reprezinte o nouă modalitate de abordare fezabilă şi promiţătoare în mai multe cancere, inclusiv în cancerul de col uterin. De interes deosebit în acest sens sunt: - Factorul de creştere al endoteliului vascular (VEGF), în prezent considerat cel mai important factor angiogenic, a cărui supraexpresie a fost observată în mai multe tipuri de tumori. Totuşi valoarea prognostică a VEGF este încă controversată: unele studii au găsit că valoarea preterapeutică crescută a VEGF este asociată cu risc crescut de eşec şi susţin că VEGF este cel mai puternic factor de prognostic, în timp ce altele nu confirmă această semnificaţie prognostică. - Receptorii factorului de creştere epidermal (EGFR) sunt supraexprimaţi într-o varietate de tumori solide, corelându-se cu un prognostic rezervat. Studii preclinice şi clinice au arătat că supraexpresia EGFR este corelată cu control tumoral redus după radioterapie. Este interesantă teoria că iradierea poate activa EGFR care la rândul său poate induce radiorezistenţă şi repopularea în cursul RT. Aceste observaţii pot sta la baza asocierii RT sau RT-CT-ei cu inhibitori ai EGFR, reprezentând o cale promiţătoare de studiu în oncologie. O modalitate optimă terapeutică poate fi integrarea tratamentelor moleculare ţintite în cursul radioterapiei.

6

- Printre factorii de prognostic nou studiaţi ai cancerului de col uterin se numără şi supraexpresia Ciclooxygenazei-2 (COX-2), considerată factor de prognostic nefavorabil, dar la ora actuală sunt doar puţine studii, şi acestea preclinice. - Densitatea microvascularizaţiei (MVD) este unul din factorii prognostici histopatologici cei mai studiaţi şi este considerată o masură a angiogenezei tumorale şi factor prognostic semnificativ în multe tipuri tumorale, fără însă a fi unanim acceptat ca factor de prognostic stabil. La ora actuală valoarea prognostică a acestor factori biologici şi implicarea lor în tratamentul cancerului de col uterin nu este încă confirmată, fiind chiar controverseată şi constituind obiectul unei intense activităţi de cercetare. - Reactia de PCR cantitativ (Real Time PCR) este o metodă de evaluare a nivelului de expresie a genelor implicate in aparitia si progresia cancerului de col uterin.

Obiectivele studiului constau în:

- evaluarea conţinutului intratumoral şi a nivelului seric al EGFR, VEGF şi COX-2 la pacientele cu cancer de col uterin st. IB-IIIB şi la paciente cu afecţuni benigne ale colului uterin - determinarea MVD în tumorile colului uterin şi evaluarea semnificaţiei ei prognostice, atât în sine cât şi în relaţie cu factorii angiogenici menţionaţi - corelarea factorilor angiogenetici evaluaţi cu factorii de prognostic clasici şi cu rezultatele terapeutice, respectiv controlul tumoral local şi eşecurile terapeutice - identificarea unor eventuale corelaţii între aceşti biomarkeri - evaluarea nivelelor de expresie genică prin qRT-PCR sau PCR array pentru genele de interes

Obiectivul final este ca, în urma derulării studiului să propunem strategii de îmbunătaăţire a rezultatelor terapeutice la pacientele cu cancer de col uterin, prin posibilitatea individualizării tratamentelor clasice şi introducerea de noi modalităţi terapeutice (terapii ţintite), astfel:

o în cancerul de col uterin incipient (în care tratamentul clasic este chirurgia), dacă prin determinarea factorilor angiogenici se estimează un prognostic nefavorabil, se va recomanda tratament adjuvant radio-chimioterapic

o în stadiile avansate, validarea acestor biomarkeri va crea posibilitatea asocierii la tratamentul clasic radiochimioterapic a tratamentelor moleculare ţintite.

Acest studiu este deosebit de complex şi totodată complet, adresându-se tuturor

aspectelor patogenetice şi investigând toate planurile relevante pentru această problematică, de la cel clinic la cel histologic şi până la nivel molecular şi genetic. În cazul unor rezultate pozitive, intenţionăm continuarea acestui studiu pentru evaluarea corelaţiei dintre biomarkerii de angiogeneză şi supravieţuire în cancerul colului uterin.

7

3. METODOLOGIA CERCETǍRII

Este un studiu prospectiv care va include: - un lot de 100 paciente cu cancer de col uterin stadiile IB-IIIB care vor fi recrutate

într-o perioadă de 2 ani: 30 în stadiile IB-IIA (operate în prim timp) şi 70 în stadiile IIB-IIIB (radio-chimioterapie primară)

- un lot mai mic (cca 20) de paciente cu afecţiuni benigne ale colului uterin. Cercetarea se va desfăşura pe două planuri simultane: clinic si experimental. 3.1. Includerea în studiu a pacientelor cu cancer de col uterin Pacientele cu carcinom epidermoid de col uterin confirmat histologic vor fi incluse în două categorii terapeutice:

- stadii incipiente (IB-IIA) care vor efectua în prim timp tratament chirurgical - stadii avansate (IIB-IIIB) care vor efectua radio-chimioterapie concomitentă

conform protocoalelor terapeutice standard în vigoare. Diagnostic, bilanţ preterapeutic şi stadializare

- examen clinic efectuat de către 2 examinatori - biopsia tumorii pentru confirmare histopatologică - radioscopie toracică - computer tomografie abdomino-pelvină cu substanţă de contrast iv - cistoscopie - ex. de laborator: hemoleucogramă, uree, creatinină, glicemie, transaminaze - stadializare conform clasificării FIGO -

Criterii de includere 1. Carcinom epidermoid de col uterin confirmat histologic 2. Stadiile clinice FIGO IB-IIIB 3. Vârsta pacientelor: 20-70 ani 4. Indice de performanţă Zubrod 2. 5. Probe hematologice: Hb 9 g/l, L 3000, Tr 100.000 6. Probe renale: creatinina < 1,2 mg/l, azot < 80 mg/l

Criterii de excludere

1. Prezenţa unei alte tumori maligne în antecedente 2. Cancer de col uterin tratat anterior (prin chirurgie, radioterapie sau

chimioterapie) 3. Indice de performanţă 3 sau 4 4. Tratament întrerupt 5. Contraindicaţii cardio-vasculare sau renale pentru administrarea de

cisplatin

8

3.2. Includerea în studiu a pacientelor cu afecţiuni benigne uterine In studiu vor fi incluse şi paciente cu col uterin normal, operate (histerectomie totală) pentru afecţiuni benigne ale organelor genitale.

3.3. Înregistrarea în baza de date Înaintea includerii în studiu pacientele vor fi informate despre metodologia

studiului, probele biologice care vor fi recoltate şi tratamentul indicat. Fiecare pacientă va semna consimţământul informat (Anexa 4.1.), respectându-se condiţiile de etică medicală.

Dacă pacienta îndeplineşte criteriile de includere în studiu, foaia de observaţie se

trimite pentru înregistrarea în baza de date a studiului (Mihaela Todor, etaj IV, tel: 214) şi eliberarea dosarului de studiu a pacientei. Cu această ocazie se va elibera şi eticheta specială a studiului cu numele bolnavei şi numărul de înregistrare în studiu, care va însoţi atăt foaia de observaţie clinică cât şi probele biologice recoltate de la pacienta respectivă. Consimţământul informat semnat de pacientă este inclus în dosarul de studiu.

După includerea în studiu fiecare pacientă va completa un chestionar de

evaluare a factorilor de risc pentru cancerul cervical (Anexa 4.2.).

3. 4. Protocol de recoltare probe biologice

Recoltarea de citologie cervico-vaginală

Recoltarea se va face preterapeutic la toate pacientele incluse în studiu de către clinician cu un recoltor de tip perie (cito brush) printr-o miscare circulara insistand pe zona de interes. Capatul periei se va detasa si se va introduce in solutia de fixare in vase speciale etichetate. Dupa inchiderea capacului se va agita bine vasul pentru desprinderea celulelor de pe perie, pentru buna fixare a acestora in lichid. Vasul (etichetat cu eticheta specială a studiului) se va trimite Laboratorului de Genomică (unde va fi preluat de către Nuţi Rechită sau Oana Tudoran, tel: 144). Din solutia obtinuta se va face un examen citologic monostrat (frotiu) si evaluare incarcatura HPV (33 subtipuri) prin reactia PCR.

Recoltarea de sânge (pentru obţinere ser) (dimineaţa între orele 8-10) De la fiecare pacientă se vor recolta în secţia clinică 12 ml sânge (in 2 eprubete a 6 ml nepreparate special) pentru evaluarea în dinamică a factorilor serici:

● preterapeutic: înaintea intervenţiei chirurgicale sau biopsiei (toate cazurile incluse în studiu) ● în ultima zi a radio-chimioterapiei ● la 2 luni de la încheierea radio-chimioterapiei

9

Eprubetele se trimit la Laboratorul de Genomică (unde vor fi preluat de către Nuţi Rechită sau Oana Tudoran, tel: 144). Din aceste eprubete o parte din sânge va fi trimis Laboratorului de Radiobiologie (Dr. Ioana Brie). Recoltarea de sânge (pt extracţia de ARN) (dimineaţa intre orele 8-10)

Pentru extractia de ARN se recoltează preterapeutic de la toate pacientele incluse în studiu 2,5 ml sânge in eprubetă specială (PaxGene) care contine o solutie stabilizatoare pentru ARN. Eprubetele sunt furnizate de Laboratorul de Genomică (Nuţi Rechită sau Oana Tudoran, tel: 144).

Post recoltare eprubeta trebuie agitata prin rotire stanga-dreapta de 10 ori , conform specificatiilor producatorului, pentru a inactiva cat mai eficinet RN-azele si a diminua efectul de degradare al ARN-ului.

Eprubeta etichetată va fi trimisa fara conditii speciale de transport in Laboratorul de Genomica in vederea extractiei de ARN (unde vor fi preluat de către Nuţi Rechită sau Oana Tudoran, tel: 144).

Recoltarea de ţesut de col uterin - la pacientele cu radio-chimioterapie primară (între orele 10-13)

Recoltarea preterapeutică si postterapeutică (la 2 luni după terminarea RT&CT) a fragmentelor biopsice se realizează in conditii metodologice identice: Medicul clinician va recolta 2 fragmente biopsice (minim 5x5 mm) de calitate egala (dimensiune, viabilitate) din tumora de col uterin evitand zonele necrotice ale acesteia.

- Primul fragment se va imersiona intr-un flacon etichetat continand formol tamponat 5%

- Al doilea fragment se va introduce intr-un criotub etichetat care va fi introdus imediat intr-un vas cu azot lichid (-1960)

Ambele flacoane se obţin de la Laboratorul de Anatomie Patologică, Camera 1 (primire piese, Gabi Tanu, tel 158) si sunt trimise cu piesa recoltată la Laboratorul de Anatomie Patologica pentru evaluare histopatologica (vor fi preluate sub semnătură de către asistentul de serviciu la camera 1- de primire Piese). Recoltarea de piesă operatorie (paciente operate în prim timp).

După semnarea consimţământului informat şi includerea pacientei în baza de date a studiului, eliberarea dosarului şi etichetelor (Mihaela Todor, tel 214), Laboratorul de Anatomie Patologica va fi notificat la inceputul programului operator. Piesa operatorie recoltata va fi ambalata imediat intr-o punga de plastic etichetata si introdusa intr-o cutie frigorifica pe unitati de racire şi se va transporta la Laboratorul de Anatomie Patologica (va fi preluată sub semnătură de către asistentul de serviciu la camera 1- de primire Piese) unde va fi examinata pentru diagnostic si includere in Biobanca.

10

Se aplică protocol identic si pentru piesele de histerectomie utilizate pentru recoltarea de tesut normal in vederea stabilirii lotului control (martor). Când probele ajung în Biobancă fiecare piesă va primi un cod specific biobăncii şi tipului de probă biologică recoltată.

3.5. Protocol experimental de anatomie patologică Va consta în determinări de laborator la toate persoanele incluse în studiu:

- evaluarea serică şi intratumorală a unor biomarkeri de angiogeneză (EGFR, VEGF, COX-2),

- cuantificarea microdensităţii neovascularizaţiei (MVD) - evaluarea nivelului de expresie a genelor implicate in apariţia şi progresia

cancerului de col uterin prin tehnica de PCR cantitativ (real-time PCR)

Pe măsura includerii în studiu a cazurilor se va efectua: - evaluarea iniţială a materialului tisular disponibil (re-evaluarea diagnosticului de

trimitere de către doi anatomopatologi) - evaluarea existenţei de material histologic suficient şi de bună calitate în blocurile

de parafină corespunztăoare, din care se vor executa secţiuni la 5 microni ce se vor etala pe lame silanate

- se va crea o bancă de materiale biologice congelate (biobancă) care va fi utilizată în realizarea studiilor de biologie moleculaă care au ca finalitate stabilirea de semnături moleculare la nivelul eşantioanelor analizate. Pe de alta parte, biobanca va permite deschiderea de oportunităţi de cercetare translaţonală atât la nivel naţîonal cât şi internaional.

Determinarea expresiei EGFR, VEGF si COX-2 în ţesutul tumoral

Se va face prin tehnici specifice de imunohistochimie, utilizând anticorpi primari anti- R-EGFR, anti-R-VEGF şi respectiv anti-COX-2. După deparafinare, secţiunile histologice se vor trata termic timp de 20 de minute în tampon citrat pentru demascarea antigenică a secţiunilor. Secţiunile histologice se vor incuba cu anticorpul primar folosind timpii de incubare şi respectiv diluţiile cele mai potrivite, conform specificaţiilor tehnice ale producătorului. Coloraţiile se vor aprecia cantitativ pentru compartimentul epitelial al tumorii utilizând grila Weibel de 42 puncte montată în piesa oculară a microscopului. Aceasta va permite evaluarea procentului de celule epiteliale pozitive pe 10 câmpuri microscopice de mărire mare (x 400) pentru fiecare lamă. Folosind valoarea mediană a expresiei EGFR în componenta epitelială, tumorile vor fi clasificate în tumori cu expresie ridicată a EGFR şi în tumori cu expresie scăzută a EGFR. In mod similar se va proceda şi în cazul VEGF şi COX-2. Determinarea densităţii microvascularizaţiei tumorale (MVD)

Se va face prin marcarea endoteliului vascular cu anticorpul monoclonal CD34 (clona QBEnd 10) şi încubare 30 minute la o dilutie de 1:200. Densitatea microvascularizaţiei tumorale se va aprecia prin tehnica “hot spot”, ce constă în scanarea ariei tumorale

11

pentru identificarea zonelor celor mai dens vascularizate, la nivelul cărora se număra şi se insumează elementele (profilele) vasculare identificate după criteriile general acceptate ale lui Weidner. Folosind valoarea mediană a DMV ca valoare prag, cazuistica se va diviza în tumori slab vascularizate, respectiv tumori intens vascularizate. In rarele cazuri care exprimă difuz CD34 la nivelul stromei, impiedicând astfel numărarea corectă a profilelor vasculare, se va utiliza CD31 ca metodă alternativă de colorare.

Rezultatele obţinute vor fi introduse în baza de date a studiului şi în dosarul de studiu

a pacientei.

3.6. Protocol experimental de genomică funcţională

Reacţia de PCR cantitativ (Real Time PCR) se va utiliza pentru evaluarea nivelului de expresie al genelor implicate în apariţia şi progresia cancerului de col uterin. Aceasta se va realiza cu ajutorul aparatului Light Cycler 2 (Hoffman la Roche) cu ajutorul sondelor taqman specifice fiecarei gene. Cuantificarea transcriptiei genice se va face prin reacţia PCR care foloseşte activitatea 5’-3' exonucleazică a enzimei taq-polimerază, pentru a îndepărta o sondă fluorescentă care se hibridizează specific pe produsul de transcripţie. Pentru normalizarea nivelelor de expresie a genelor de interes vor fi utilizate gene de referinţă precum: RPLPO (Large Ribosomal Protein PO), -globină, GAPDH (Glyceraldehide-3phosphate dehydrogenase). Genele de referinţă au o expresie cvasiconstantă la nivel celular fiind denumite şi gene housekeeping. Designul primerilor şi sondelor UPL (Universal Probe Library) se va face prin studii in silico. Aparatul utilizat pentru determinarile de expresie cantitativa va fi Light Cycler 480 (Hofmann la Roche).

Rezultatele obţinute vor fi introduse în baza de date a studiului şi în dosarul de studiu a pacientei. 3.7. Protocol de determinare a nivelului seric si din piesele tumorale de exereză chirurgicala a EGFR, VEGFR SI COX -2 (Laboratorul de Radiobiologie)

Concentratiile serice şi intratumorale ale receptorilor solubili ai VEGF si EGF si ale COX-2 vor fi cuantificate prin kituri ELISA (enzyme-linked immunoassay) cu ajutorul unui cititor ELISA de microplaci Tecan Sunrise Prelucrarea probelor Probele de sange:

Sange periferic recoltat se lasă 3- minute la temperatura camerei, timp in care are loc coagularea, după care se centrifughează 15 min la 1000 x g. Serul colectat se portioneaza în trei microtuburi care se păstrează la ≤- 200 C in Biobanca.

Inainte de analiza, serurile vor fi decongelate lent si aduse la temperatura camerei.

12

Probele de ser cu precipitate vizibile vor fi clarificate inainte de analiza, iar probele intens hemolizate sau lipemice vor fi excluse

Lizatele tisulare din piesele de histerectomie (tumoră şi ţesut cervical normal)

Celule aderente Pentru determinari este necesar un numar mediu de 107 celule aderente cultivate pe placi Petri de 90 mm diametru. Supernatantul este aruncat si se adauga 1 ml de de solutie de extractie a receptorului. Celulele sunt apoi desprinse cu ajutorul unui scrapper si transferate intr-un tub de microcentrifuga de 1,5 ml, si se centrifugheaza la 10000 x g. timp de 5 minute la temperatura de 40C. Supernatantul se colecteaza, se portioneaza si se pastreaza la -800C.

Celule neaderente Celulele neaderente se transfera in tuburi de microcentrifuga si se centrifugheaza la 300 x g. Dupa ce supernatantul este indepartat se va adauga 1 ml de de solutie de extractie a receptorului in care se vor resuspenda bland celulele. Suspensia celulara este apoi centrifugata la 10000 x g. timp de 5 min la temperatura de 40C. Stocarea se va face prin inghetare la, -800C. Probele de lizate tumorale vor fi diluate de 10-50 ori, probele de ser vor fi analizate nediluate sau diluate de 2 ori. Principiul metodei

Probele si standardele se pipeteaza in godeurile placii. Moleculele solubile de VEGF-R, EGF-R si COX-2, prezente in serul de analizat şi/sau în lizatele tumorale vor fi legate de anticorpii ce tapeteaza godeul.

Substantele ramase nelegate in godeuri vor fi indepartate prin spalare, dupa care se adauga anticorpii policlonali specifici pentru VEGFR sau EGFR sau COX, legati la sistemul enzimatic.

Dupa o noua spalare pentru indepartarea reactivului anticorp-enzima nelegat, se adauga substratul enzymatic. Virarea culorii este stopata si apoi se va masura intensitatea culorii la cititorul de microplaci, absorbtia la o lungime de unda indicata de producatorul kitului. Fiecare proba va fi analizata in duplicat.

Cu ajutorul programului Magellan se creeaza o curba standard si se va calcula valoarea medie pentru fiecare standard, control sau proba a pacientului. Tehnica de lucru

Va fi folosita cea din manualul tehnic al fiecarui kit folosit, conform indicatiilor producatorului.

Indiferent de kitul folosit, principalele etape sunt urmatoarele: 1. Prepararea reactivilor, solutiilor standard si solutiilor de lucru 2. Se adauga 100 μl din solutia standard/control/solutia de lucru in fiecare godeu

si se incubeaza 2 ore la 37C 3. Se indeparteaza lichidul din fiecare godeu, prin aspirare cu pipeta 4. Se adauga 100 μl din reactivul A de detectare in fiecare godeu si se incubeaza

1 ora la 37C.

13

5. Se aspira si se spala de 3 ori fiecare godeu. Spalarea se face prin umplerea fiecarui godeu cu tampon de spalare (350 μl). Indepartarea completa a lichidului in fiecare din aceste trepte este esentiala pentru corectitudinea rezultatelor. Dupa ultima spalare, se indeparteaza orice urma de tampon de spalare restant, prin aspirare sau decantare. Se inverseaza placa cu godeuri pe un tampon absorbant.

6. Se adauga 100 μl de reactiv B de detectare in fiecare godeu. Se acopera si se incubeaza 1 ora la 37C.

7. Se repeta aspirarea/spalarea ca in treapta 5. 8. Se adauga 90 μl de solutie-substrat in fiecare godeu. Se incubeaza 30 de

minute la temperatura camerei, protejat de lumina. 9. Se adauga 50 μl de solutie de stopare in fiecare godeu. 10. Se determina densitatea optica a fiecarui godeu, cu ajutorul unui cititor de

microplaci, la 450nm lungime de unda, in maximum 30 de minute.

Citirile se vor face in duplicat, pentru solutia standard, control si cea de lucru. Se face media citirilor duplicatelor si se construieste o curba standard.

3.8. Protocolul cercetării clinice Pacientele vor fi selectate, înrolate şi incluse (pe baza criteriilor de includere) în

două categorii terapeutice: - stadiile incipiente (IB-IIA), care vor efectua în prim timp tratament chirurgical - stadiile avansate (IIB-IIIB) care vor efectua radio-chimioterapie concomitentă

conform protocoalelor terapeutice standard în vigoare. -

Protocol terapeutic Stadiul IB1

1. Histerectomie radicală cu limfadenectomie pelvină fără iradiere preoperatorie. Iradiere pelvină postoperatorie (DT=50 Gy) asociată cu chimioterapie bazată pe cisplatin în caz de ganglioni pelvini pozitivi, margini chirurgicale pozitive, parametre invadate.

2. Radioterapie: iradiere externă pe pelvis asociată cu 2 sau mai multe aplicaţii de brahiterapie intracavitară. 3. Iradierea ganglionilor paraaortici (DT= 44-46 Gy) - dacă la intervenţia chirurgicală se evidenţiază ganglioni paraaortici pozitivi (extirpabili sau nu) şi tumora pelvină este controlabilă. Postoperator se indică radioterapie"extended-field" (iradiere pelvină şi paraaortică) asociată cu chimioterapie bazată pe cisplatin. Stadiul IB2

1. Radioterapie: iradiere externă pe pelvis asociată cu 2 sau mai multe aplicaţii de brahiterapie intracavitară, cu reevaluare la doza de 46+10 Gy, în vederea deciderii conduitei în continuare: radioterapie exclusivă sau intervenţie chirurgicală. (HRLP).

2. Chirurgie: histerectomie radicala cu limfadenectomie pelvină.

14

3. Iradierea ganglionilor paraaortici (DT= 44-46 Gy), dacă la intervenţia chirurgicală se evidenţiază ganglioni paraaortici pozitivi (extirpabili sau nu) şi tumora pelvină este controlabilă. Stadiul II A Tumori cervicale de dimensiuni < 4 cm 1. Chirurgie: histerectomie radicală cu limfadenectomie pelvină. 2. Radioterapie: radioterapie externă postoperatorie (DT=50 Gy/pelvis, tehnica “box”) ± brahiterapie intracavitară, asociat cu chimioterapie bazată pe cisplatin, dacă examenul histologic al piesei operatorii evidenţiază ganglioni pelvini pozitivi, margini de rezecţie pozitive sau parametre pozitive. Tumori cervicale de dimensiuni ≥ 4 cm

1. Radioterapie externă pelvină asociată cu cisplatin şi supraimpresiune pe colul tumoral prin brahiterapie utero-vaginală, urmată la interval de 4-6 săptămâni de chirurgie (histero-colpectomie lărgită cu limfadenectomie pelvină).

2. Radioterapie exclusivă (externă + brahiterapie intracavitară) + chimioterapie concomitentă cu cisplatin.

3. Iradierea ganglionilor paraaortici (DT=44-46 Gy) - dacă la intervenţia chirurgicală se evidenţiază ganglioni paraaortici inextirpabili şi tumora pelvină este controlabilă. Postoperator se indică radioterapie"extended-field" (iradiere pelvină şi paraaortică) asociată cu chimioterapie bazată pe cisplatin.

4. Radioterapie"extended-field" (iradiere pelvină şi paraaortică) asociată cu chimioterapie bazată pe cisplatin - dacă bilanţul preterapeutic evidenţiază ganglioni paraaortici măriţi de volum.

Stadiul II B Conduita standard in stadiul IIB este radioterapia. Chirurgia (HRLP) va fi utilizată numai în cazuri bine selecţionate, evaluate după radioterapie. Radioterapie: externă: DT=60-64 Gy/pelvis, tehnica"box" + supraimpresiune pe volumul tumoral central prin brahiterapie intracavitară (până la DT=85 Gy în punctul A) sau prin iradiere externă tehnica "pendulară" (DT=10-14 Gy) asociat cu chimioterapie concomitentă (cu cisplatin) Stadiul III Standard

Radioterapie: externă (DT=60-64 Gy/pelvis, tehnica"box") + supraimpresiune pe volumul tumoral central (brahiterapie intracavitară până la DT=85 Gy în punctul A sau prin iradiere externă tehnica "pendulară" (DT=10-14 Gy).+ Chimioterapie concomitentă (bazată pe cisplatin) Opţiuni 1. Reevaluare la doza de iradiere de 44-46 Gy/ pelvis + supraimpresiune pe tumora centrală (10-14 Gy): în cazul răspunsului favorabil la nivelul parametrelor (= operabilitate) dar cu relicvat tumoral central care nu poate fi controlat cu radioterapie exclusivă- intervenţie chirurgicală cu intenţie de radicalitate (HCL cu biopsie ganglionară

15

para-aortică) după un interval de 4-6 săptămâni. Dacă se confirmă histologic invazia ganglionilor para-aortici: postoperator iradierea ganglionilor para-aortici + chimioterapie. 2. Iradierea ganglionilor paraaortici (44 - 50 Gy) măriţi (> 1 cm) la examenul computer tomografic: tehnica "extended-field" asociat cu chimioterapie bazată pe cisplatin - dacă există şansa obţinerii controlului tumorii primare prin radio-chimioterapie Evaluarea răspunsurilor terapeutice Evaluarea răspunsului terapeutic pentru cazurile neoperate La 2 luni şi la 5 luni după terminarea radio-chimioterapiei exclusive:

- remisie completă (RC): dispariţia completă a tumorii la nivelul colului şi a extinderilor sale (vagin, parametre)

- remisie parţială (RP): diminuarea cu 50% sau mai mult a leziunilor cunoscute - staţionar (ST): o scădere cu 50% a leziunilor nu a putut fi documentată, dar

nici o creştere a lor cu 25% - evoluţie (EV): creşterea cu 25% sau mai mult a tumorii de la nivelul colului

sau a extinderilor loco-regionale Evaluarea răspunsului terapeutic la cazurile operate Pe baza rezultatului histologic al piesei operatorii:

- RC: piesa sterilă - RP: relicvat tumoral numai la nivelul colului uterin - ST: parametru (e) şi/sau ganglion (i) histologic pozitivi

In ultima etapă a studiului se va realiza: - analiza şi interpretarea datelor clinice şi experimentale - corelarea datelor experimentale obţinute cu factorii de prognostic clasici şi cu

rezultatele terapeutice (controlul tumoral local şi eşecurile terapeutice). Întreaga activitate desfăşurată în cadrul acestui proiect se va face respectând normele

elaborate de Comisia de Etică a Universităţii de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca şi în concordanţă cu normele internaiţonale din domeniu. Cercetarea clinică se va desfăşura cu respectarea Declaraţiei de la Helsinki referitoare la studiile pe subiecţi umani. De la fiecare pacientă se va obţine în prealabil consimţămnântul informat, sub semnatură. În ce priveşte partea experimentală, toate activităţile depuse pentru realizarea prezentului studiu se vor desfăşura în acord cu Regulile de bună practică în laborator.

Echipa implicată în desfăşurarea studiului este una multidisciplinară, cuprinzând clinician radioterapeut, chirurg, tolog, specialist în biologie moleculară, radiobiolog, activitatea lor necesitând o colaborare perfectă în vederea parcurgerii în lanţ a tuturor etapelor cercetării.

16

INSTITUTUL ONCOLOGIC “PROF. DR. I. CHIRICUŢĂ” CLUJ NAPOCA

STR. REPUBLICII NR. 34-36, 400015 CLUJ-NAPOCA, ROMÂNIA TEL: +40-264-598 361/62, 63, 64; 591281/82; 450672; Fax: +40-264-597673/597692; e-mail: office@iocn.ro

web: www.iocn.ro

Consimţământ informat

Semnătura dată mai jos confirmă următoarele:

Subsemnata, prin prezenta consimt să particip la studiul în domeniul colului uterin în care voi fi

inclusă.

Am fost informată că pentru aceasta mi se va recolta sânge din venă şi un fragment de tumoră de

la nivelul colului uterin.

Mi s-a explicat că acceptarea sau refuzarea includerii în studiile de cercetare în domeniul colului

uterin nu îmi va modifica conduita trerapeutică stabilită şi relaţia cu doctorul curant.

Accept ca orice date provenite din probele biologice care rezultă din acest studiu de cercetare să

poată fi incluse şi în alte studii de cercetare. Participarea mea este complet voluntară.

Am fost informată că datele (personale, clinice şi ale materialelor biologice) colectate pot fi

folosite pentru cercetarea ştiinţifică in domeniul patologiei colului uterin şi că imi va fi asigurată

confideniţalitatea.

Am înţeles că toate datele (personale, clinice şi ale materialelor biologice) colectate vor fi tratate

în conformitate cu „Directiva Uniunii Europene (Dir /95/46/EC) asupra protecţiei indivizilor cu

privire la procesarea datelor personale” şi cu aplicarea legilor naţionale.

Sunt de acord ca viitoarele studii de cercetare să poată fi realizate pe materialele biologice

rămase, incluse in biobancă, şi că orice dată rezultată din aceste studii să poată fi legată în viitor

de alte date provenite din studii de cercetare.

Nume Pacientă________________________________

Semnatura Pacientă______________________________

Data:________________

Subsemnata/ul, investigator clinic, confirm că am informat în prealabil pacienta cu privire

la realizarea studiilor de cercetare şi că nu am exercitat nici o presiune asupra pacientei de a lua

parte la aceste studii.

Nume Investigator________________________________

Semnatură Investigator:______________________________

17

St. I B – IIA (CH primara)

ANGIO - CERVIX

St. IIB – IIIB (RT& CT primara)

Consimtamântul informat

baza date + dosar + eticheta(Mihaela Todor, tel.214)

Recoltare probe biologicePreterapeutic

- citologie cervico-vaginala (perie)- sânge periferic - 2 eprub. x 6 ml )

- 1 eprub PaxGene2,5 ml

- piesa operatorie -> cutie frigorifica

-citologie cervico-vaginala (perie)

-sânge periferic - 2 eprub. x 6 ml )- 1 eprub PaxGene

2,5 ml

Recoltare probe biologice

Preterapeutic

- biopsie tumora 2 fragm. x 5 mm Ø

Postterapeutic ultima zi de RTE

- sange periferic (3 eprubete)

Postterapeutic la 2 luni dupa RTE

- sange periferic (3 eprubete)

- biopsie col uterin ( 2 fragmente)1. în flacon cu formol tamponat 5%2. în criotub -> azot lichid

Nr. paciente: - CH primara: 30- RT&CT primara: 70- Col normal: 20

Prelucrare

Lab.Genomica;

Lab.Genomica:tel.144

Anat. Patolog. tel.158

Lab.Genomica; tel.144

Lab.Genomica

Lab.Genomica:tel.144

Lab.Genomica

Anat. Patologica, tel: 158

Biobanca

Anat. Patologica: tel.158

Prelucrare

Anat. Patol.

Includere

1. în flacon cu formol tamponat 5%2. în criotub -> azot lichid

Radiobiologie

18