Analiza cantitativa hplc a ceaiului verde, a polifenolilor din ceai verde

INTRODUCERE

În timpul metabolismului celular normal, aproximativ 98% din oxigenul

molecular este în totalitate redus la apă. Restul de 2% produce specii reactive de oxigen,

afectând în mod direct ţesuturile, prin oxidarea proteinelor celulare, a lipidelor şi a

acizilor nucleici. În condiţii fiziologice normale, există un echilibru între formarea

radicalilor liberi şi îndepărtarea lor de către sistemele de apărare antioxidantă ale

corpului. Acestea includ enzime ca superoxid dismutaza, glutation peroxidaza şi catalaza,

dar şi antioxidanţi neenzimatici ca gluationul, acidul ascorbic, tocoferolii, etc. În condiţii

patologice, producţia radicalilor liberi creşte, împreună cu o creştere a consumului şi o

descreştere a producţiei acestor molecule antioxidante de apărare, conducând la afecţiuni

celulare sau chiar la moarte. Flavan-3-olii, un subgrup al flavanoidelor, care include

catechinele, contribuie alături de sistemul antioxidant enzimatic la apărarea antioxidantă

a celulelor.

Flavan-3-olii pot lupta de asemenea împotriva CANCERULUI, contribuind la

prevenirea acestei boli.

Utilizând tehnica Cromatografiei de Lichide de Înaltă Performanţă (HPLC) se

separă, se identifică şi se evaluează conţinutul de catechine din extracte de ceai verde.

Pentru extractele caracterizate se monitorizează şi se compară activitatea antioxidantă

utilizând diferite metode: ORAC, TEAC, DPPH. Metoda de determinare a capacităţii de

absorbţie a radicalului oxigenului, ORAC este o metodă nouă de evaluare a activităţii

antioxidante a alimentelor.

Determinarea potenţialului antioxidant al extractelor de ceai verde bogate în

catechine şi capacitatea acestora de a proteja in vitro celulele epiteliale pigmentate din

retina umană, în scopul utilizării lor ca suplimente în prevenirea degenerescenţei

maculare senile. S-au ales celulele RPE (linia D407) pentru a studia mecanismul

1

molecular la răspunsul adaptativ la stresul oxidativ. Acesta este primul studiu ce

evaluează efectul catechinelor asupra sistemului antioxidant de apărare al celulelor RPE.

Datele recente demonstrează că polifenolii din ceaiul verde pot induce evenimente

ale semnalizării celulare, implicate în inhibarea creşterii celulare, progresia ciclului

celular, inducţia apoptozei, inhibiţia angiogenezei, a invaziei tumorii şi a metastazei

cancerului de prostată. Ca atare se utilizează extractul Polyphenon E ca potenţial agent

chemopreventiv în cancerul de prostată. S-au urmărit căile moleculare şi mecanismele de

acţiune ale acestui extract asupra metabolismului celular.

Principalele obiective sunt:

Extracţia flavan-3-olilor din cele 5 extracte de ceai verde. Ceaiurile au fost procurate

de pe piaţa românească (Vedda) şi de pe piaţa japoneză (ceai verde japonez).

Suplimentele alimentare au fost obţinute de la companiile comerciale (Pharmanex;

Teacalon; Japan; Polyphenon E);

Caracterizarea extractelor de ceai verde prin Cromatografia de Lichide de Înaltă

Performanţă;

Evaluarea activităţii antioxidante a extractelor de ceai verde, utilizând metodele

ORAC, TEAC şi DPPH şi determinarea conţinutului total de polifenoli;

Efectele extractului de ceai verde (Polyphenon E) asupra viabilităţii celulelor

epiteliale din retina umană (D407) şi determinarea nivelului de specii reactive de

oxigen intracelulare;

Evaluarea activităţii superoxid dismutazei, catalazei, glutation peroxidazei şi

cuantificarea glutationului, după tratamentul cu Polyphenon E şi catechine.

Studiul influenţei produsului Polyphenon E asupra morfologiei celulelor PC-3 în

funcţie de concentraţia şi durata tratamentului;

Efectele induse de Polyphenon E asupra proliferării, folosind metoda WST-1 şi

colorarea cu cristal violet;

Evaluarea apoptozei prin flow citometrie;

Evaluarea efectelor induse de Polyphenon E asupra expresiei proteinei PCNA

utilizând analiza Western blot.

2

Capitolul 1 şi 2 caracterizează flavan-3-olii, în funcţie de proprietăţile lor chimice

şi biochimice, şi trece în revistă metodele analitice de separare şi dozare a acestora.

Capitolul 3 prezintă implicaţiile stresului oxidativ în etiologia degenerescenţei

maculare senile şi importanţa protejării epiteliului pigmentat al retinei

Capitolul 4 rezumă date referitoare la implicarea polifenolilor din ceaiul verde în

inducţia apoptozei, inhibarea invaziei tumorii şi metastazei cancerului de prostată

Capitolul 1

În zilele noastre ceaiul este consumat în mai mult de 30 de ţări din întreaga lume,

cu un consum mediu per cap de locuitor de 120 ml/ zi, ca şi băutură ceaiul ocupând locul

doi în lume, după apă (Graham, H. N., 1992). În funcţie de procesul tehnologic de

obţinere ceaiurile sunt clasificate astfel: ceai verde ‘nefermentat’, ceaiul oolong ‘semi-

fermentat’ şi ‘fermentat’ ceaiul negru sau roşu.

Flavan-3-olii sunt un subgrup al flavonoidelor, care include catechinele. Frunzele

de ceai verde conţin şase catechine majoritare: (+)-catechina (C), (-)-epicatechina (EC),

(+)-galocatechina, (-)-epicatechin galat (ECG), (-)-epigalocatechina (EGC) şi (-)-

epigalocatechin galat (EGCG) (Fig.1).

Conţinutul total de catechine a fost evaluat utilizând tehnica HPLC. Diferite

metode antioxidante au fost utilizate pentru a monitoriza şi compara activitatea

antioxidantă a extractelor de ceai verde: ORAC, TEAC, DPPH.

MATERIALE ŞI METODE

Extracţia: 0.2 g pudră (Pharmanex, Teacalon, Polyphenon E, Japan Green Tea)

sau frunze (Vedda) cu 10 ml apă Millipore fiartă, au fost sonicate, centrifugate şi filtrate.

Cromatografia de Înaltă Performanţă (HPLC) este o metodă uzuală utilizată

pentru separarea unor antioxidanţi ca şi catechinele. Analiza HPLC s-a realizat cu

ajutorul unui sistem Shimadzu, echipat cu detecţie cu fotodiodă. A fost utilizată o coloană

SUPELCOSIL TM LC-18, 5μm, 25 cm x 4.6 mm. S-a folosit un gradient de eluare: faza

3

mobilă A- metanol: acid acetic: apă bidistilată şi faza mobilă B, metanol: acid acetic: apă

bidistilată.

Conţinutul total de polifenoli: Compuşii albaştrii formaţi între fenolaţi şi

reactivul Folin-Ciocâlteu sunt independenţi de structura compuşilor fenolici, dezvoltând

astfel complexe între centrul metalic şi compuşii fenolici. Absorbţia a fost înregistrată la

lungimea de undă 765 nm. Conţinutul total de fenoli a fost exprimat în echivalenţi de acid

galic.

Capacitatea de absorbţie a radicalului oxigenului (ORAC) determină

capacitatea de inhibare a radicalului peroxil, inducând oxidarea, evidenţiind eliberarea

clasică radicalului, prin transferul atomului de H. Valorile ORAC au fost raportate ca

echivalenţi Trolox, fiind exprimate ca μmol TE/DW. Intensitatea fluorescenţei, ex.

485nm, em. 525 nm a fost monitorizată pentru 35 min.

Metoda echivalentului Trolox al capacităţii antioxidante (TEAC) se bazează

pe capacitatea de neutralizare a radicalului anion ABTS+ de către antioxidanţi. ABTS

este oxidat de către radicalii peroxil sau alţi oxidanţi la radicalul său cationic ABTS. +,

intens colorat (λmax = 734 nm). Capacitatea antioxidantă este exprimată ca şi potenţialul

4

compuşilor testaţi de a decolora radicalul ABTS. + prin reacţie directă cu acesta.

Capacitatea antioxidantă a compuşilor testaţi a fost exprimată ca şi echivalenţi Trolox.

Analiza cantitativă HPLC a extractelor de ceai verde

Fig. 2 evidenţiază separarea amestecului de catechine standard pure, în 22 minute.

Ordinea de eluare a fost: GC, C, EGC, EGCG, EC, GCG, ECG, CG.

Conţinutul total de catechine a fost foarte scăzut în probele Vedda (12.03 mg/g) şi

Japan Green Tea (17.56 mg/g), posibil datorită oxidării polifenolilor şi /sau polimerizării

induse de fermentarea frunzelor de ceai. Acest fapt ar putea de altfel explica şi activitatea

antioxidantă redusă a acestora, evidenţiată cu ajutorul metodelor: ORAC, TEAC, DPPH.

Conţinutul total de catechine din suplimentele alimentare (Pharmanex, Teacalon and

Polyphenon E) este semnificativ mai ridicat, comparativ cu probele de ceai verde,

datorită concentrării probei în urma tehnologiei de extracţie prin pulverizare uscată.

EGCG, ECG şi EC sunt catechinele ce se regăsesc în concentraţie mai mare în

extractele de ceai verde. Suplimentul alimentar Teacalon conţine EC (134.67 mg/g), C

(22.83 mg/g) şi GCG (23.64 mg/g), compuşi identificaţi în cantităţi mici în alte două

suplimente alimentare Pharmanex şi Polyphenon E. Proba Pharmanex conţine 56.58 mg/g

EC şi 42.07 mg/g ECG, în comparaţie cu Polyphenon E 11.62 mg/g EC şi 63.39 mg/g

ECG. Conţinutul de GC din probele Pharmanex şi Teacalon a fost similar: 11.69 şi

respectiv 11.43 mg/g.

Fig.3. Cromatogramele extractelor de ceai verde analizate: A).Pharmanex;

B).Teacalon

Tabel 1.

Conţinutul (mg/g) în catechine al probelor de ceai verde, conform determinării

HPLC şi calibrării cu standarde pure

mg/g extract

Denumire

probă

GC C EGC EGC

G

EC GCG ECG CG Total

Pharmanex 1.69±0 6.63 10.14 08.93± 56.58±0. 7.71±0.0 42.07±0. 1.11±0.0 254.85

5

.05 ±0.1 ±0.09 0.87 3 6 04 2

Teacalon 1.43±0

.05

2.83±0

.01

6.19

±0.07

76.20±

0.43

134.67±0

.6

23.64±0.

15

73.93±0.

3

3.49±0.0

5

72.37

Polyphenon E 8.33±0

.06

0.72±0

.02

1.56

±0.07

196.32

±0.72

11.62±0.

05

21.55±0.

1

63.39±0.

14

1.89±0.1

1

315.39

Vedda 1.30±0

.05

4.28±0

.02

0.86

±0.11

1.95±0

.04

3.43±0.0

2

- 0.21±0.0

5

- 12.03

Japan Green

Tea

1.19±0

.05

4.04±0

.04

1.73

±0.05

6.83±0

.05

2.56±0.0

2

0.34±0.0

2

0.71±0.0

2

0.16±0.0

1

17.56

Conţinutul total de polifenoli

Conţinutul total de polifenoli variază de la 74 la 695 mg/g acid galic. Cel mai

redus conţinut de polifenoli s-a întâlnit în proba Japan green tea (74.43±1.60 mg/g acid

galic) în timp ce proba Teacalon (695.1±3.56 mg/g acid galic) înregistrează cel mai

ridicat conţinut de polifenoli, urmată de proba Polyphenon E (677.5±8.63 mg/g acid

galic). Conţinutul altor probe de ceai verde a fost 284.2±8.63, 75.38±2.56 mg/g acid galic

acid în proba Pharmanex, respectiv proba Vedda (Fig. 4). Conţinutul de polifenoli totali

variază considerabil între probele de ceai verde şi suplimentele alimentare.

Fig. 4. Conţinutul total de polifenoli din cele cinci extracte de ceai verde:

Pharmanex, Teacalon, Polyphenon, Vedda, Japan green tea. Valorile sunt

exprimate ca media ± SEM.

Corelarea metodelor HPLC şi Folin-Ciocâlteu

Coeficientul de corelare Pearson pentru analiza cantitativă determinată prin

metoda HPLC şi conţinutul total de polifenoli a fost obţinut utilizând programul de

analiza statistică PRISM, versiunea 5 (GraphPad Software, San Diego, CA). Analiza

HPLC s-a corelat semnificativ cu analiza spectrofotometrică a conţinutului total de

polifenoli, Pearson r- 0.93, p < 0.01 (Fig. 5).

Fig. 5. Corelarea analizei HPLC cu determinarea spectrofotometrică a conţinutului

total de polifenoli (acid galic mg/g DW)

6

Capacitatea de absorbţie a radicalului oxigenului (ORAC)

Polyphenon E şi Teacalon sunt extractele de ceai verde cu cele mai mari valori

ORAC (5143 mM TE/g probă, respectiv 4988 mM TE/g probă). Cel mai ridicat conţinut

în EGCG (după cum s-a obţinut în urma analizei HPLC) şi cele mai mari valori ORAC au

fost înregistrate pentru probele Teacalon şi Polyphenon E. EGCG este considerată

catechina cu cel mai mare potenţial antioxidant. Pharmanex conţine o cantitate redusă de

EGCG, ca atare prezintă o activitate antioxidantă mai redusă comparativ cu probele

Polyphenon E şi Teacalon. Probele de ceai verde Vedda şi Japan green tea au înregistrat

cele mai mici valori ORAC (1033 mM TE/g, respectiv 898 mM TE/g).

Valorile ORAC s-au corelat cu valorile obţinute în urma determinării conţinutului

total de polifenoli, după cum se observă în Fig. 5.

Fig.6. Valorile obţinute prin metoda capacităţii de absorbţie a radicalului

oxigenului (ORAC) pentru cinci extracte de ceai verde. Valorile sunt prezentate ca

medie ± SEM.

Echivalentul Trolox al capacităţii antioxidante (TEAC)

Polyphenon E şi Teacalon sunt extractele de ceai verde cu cele mai mari valori

TEAC (179±6.6 mM TE/g probă, respectiv 201±3.6 mM TE/g probă). Pharmanex

prezintă o activitate antioxidantă mai redusă comparativ cu Polyphenon E şi Teacalon,

116.5 ± 1.97 mM TE/g. Vedda şi Japan green tea au înregistrat cele mai mici valori

TEAC (71±1.08 mM TE/g, respectiv 58.5± 1.28 mM TE/g). Valorile TEAC s-au corelat

cu conţinutul total de polifenoli, după cum se observă în Fig. 7.

Fig. 7. Capacitatea antioxidantă a echivalentului Trolox (TEAC) pentru cele

cinci extracte de ceai verde: Pharmanex, Teacalon, Polyphenon, Vedda, Japan;

7

Corelarea metodelor ORAC, TEAC şi Folin-Ciocâlteu

Coeficientul de corelare Pearson pentru activitatea antioxidantă determinat prin

metodele TEAC, ORAC şi conţinutul total de polifenoli, cu ajutorul programului de

analiză statistică PRISM. Activităţile antioxidante determinate prin metodele TEAC şi

ORAC s-au corelat semnificativ cu conţinutul total de polifenoli, Pearson r- 0.99, p =

0.0011, respectiv r- 0.98, p =0.0026 (Fig. 8).

Fig. 8. Corelarea metodelor antioxidante TEAC, respective ORAC cu cantitatea

de polifenoli totali din extractele de ceai verde. Valorile sunt exprimate ca media± SEM;

CONCLUZII

5 ceaiuri achiziţionate de pe piaţa romanească (Vedda) şi japoneză (Japan Green

Tea) şi trei suplimente alimentare (Pharmanex, USA; Teacalon, Japan; Polyphenon E,

USA) au fost analizate prin RP-HPLC, pentru cuantificarea catechinelor din ceaiul verde

(GC, C, EC, EGC, EGCG, ECG, GCG, GC);

EGCG, ECG şi EC sunt catechinele majoritare din ceaiul verde şi suplimentele

alimentare, după cum s-a demonstrat prin analiza cantitativă HPLC;

Conţinutul total de polifenoli din extracte variază de la 74 la 695 mg/g acid galic.

Cel mai scăzut conţinut a fost înregistrat pentru proba Japan green tea, în timp ce proba

Teacalon a înregistrat cel mai ridicat conţinut;

Probele Teacalon, Polypheon E şi Pharmanex prezintă activitatea antioxidantă

(ORAC, TEAC, DPPH) cea mai ridicată şi cel mai mare conţinut total de polifenoli;

Metodele antioxidante (TEAC, ORAC) s-au corelat cu analiza spectrofotometrică

a conţinutului total de polifenoli;

Analiza cinetică a DPPH evidenţiază că panta cea mai abruptă fost înregistrată

pentru proba Polyphenon E

8