ALEXANDRU LUCIAN BEJAN REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT · Prin aceast ă tehnic ă, oochisturile apar...

Criptosporidioza vi�eilor �i iezilor: cercetări privind diagnosticul, epidemiologia �i etiopatogeneza

a

UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRICOLE SI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

SCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ

ALEXANDRU LUCIAN BEJAN

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT

CONDUCĂTOR STIINTIFIC Prof. dr. Vasile COZMA

CLUJ-NAPOCA 2009


b

UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRICOLE SI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

SCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ


CRIPTOSPORIDIOZA VITEILOR SI IEZILOR: CERCET ĂRI PRIVIND DIAGNOSTICUL, EPIDEMIOLOGIA SI

ETIOPATOGENEZA BOLII

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT

CONDUCĂTOR �TIIN�IFIC Prof. dr. Vasile COZMA

CLUJ-NAPOCA 2009


c

CRIPTOSPORIDIOZA VITEILOR SI IEZILOR: CERCT ĂRI PRIVIND DIAGNOSTICUL, EPIDEMIOLOGIA SI ETIOPATOGENEZA BOLII

REZUMAT

Criptosporidioza este o bolă întâlnită la om şi animale, cu evoluŃie favorabilă la

organismele imunocompetente şi gravă la cele imunodeficitare, caracterizată din punct de

vedere clinic, în principal, prin tulburări gastrointestinale şi mai rar prin cele respiratorii,

hepatice şi pancreatice. Boala are un caracter de zoonoză, deoarece se transmite de la

animale la om.

Pierderile economice la animale, asociate cu această boală, nu sunt reflectate doar

în mortalitate, dar şi în întârzieri în creştere, costul medicamentelor şi asistenŃa

veterinară.

Interesul faŃă de protozoarul Cryptosporidium s-a răspândit din aria sa academică

a biologilor şi parazitologilor, la medicii veterinari, medicii epidemiologi, farmacologi,

specialişti în domeniul sănătăŃii publice, a apei potabile, a fermierilor şi publicului în

general. Preocuparea pentru prevenirea şi tratamentul criptosporidiozei, se extinde de la

comunităŃile subdezvoltate la societăŃile puternic industrializate, de la persoanele

imunosupresate, la populaŃia sănătoasă.

După anul 1990, s-au efectuat numeroase cercetări şi s-a constatat că în apa

consumată de om şi animale se găsesc destul de frecvent oochisturi de Cryptosporidium.

Sunt citate 19 izbucniri de criptosporidioză cu origine acvatică, cu afectarea aproximativ

a 427000 de oameni. Cu toate tratamentele şi filtr ările apei de robinet, nu se poate garanta

absenŃa oochisturilor de Cryptosporidium parvum. Apa reprezintă vehiculul major pentru

transmiterea criptosporidiozei la animale �i oameni.


d

Obiectivele lucrării

Primul capitol de cercetări proprii î�i propune să evalueze 6 tehnici diferite de

diagnostic (2 metode de colorare, o metodă de flota�ie, 2 metode imunologice �i o

metodă de biologie moleculară) din punct de vedere al eficien�ei, al sensibilită�ii �i

specificită�ii, al costului, timpului �i u�urin�ei realizării.

O dată stabilită cea mai convenabilă tehnică de diagnostic din punct de vedre

economic, al u�urin�ei realizării �i nu în ultimul rând al sensibilită�ii �i

specificită�ii, cercetările ulterioare au fost realizate doar prin această metodă.

Al doilea capitol de cercetări proprii î�i propune analiza evolu�iei

criptosporidiozei la diferite categorii de vi�ei �i iezi, urmărindu-se câteva direc�ii

principale. Astfel, s-a realizat un studiu epidemiologic descriptiv, pentru cunoa�terea

frecven�ei �i prevalen�ei bolii la vi�ei �i iezi; s-a urmărit influen�a vârstei sexului

�i a varia�iilor sezoniere asupra evolu�iei bolii; s-a identificat specia de

Cryptosporidium ce afectează vi�eii prin micromăsurători, dar �i prin tehnici de

biologie moleculară; nu în ultimul rând s-a realizat un studiu al parazitozelor ce afectează

vi�eii cu vârsta cuprinsă între o zi �i 8 săptămâni.

Al treilea capitol de cercetări proprii vizează stabilirea locului criptosporidiozei în

etiologia diareei neonatale la vi�ei. Astfel, s-a urmărit frecven�a eliminărilor de

cryptosporidium spp., E. coli factorul F5, rotavirus �i coronavirus la vi�eii din centrul

�i nord-vestul României �i s-a încercat identificarea unor corela�ii existente între

gravitatea manifestărilor clinice, agen�ii etiologici biotici �i severitatea anomaliilor

biochimice �i hematologice la vi�eii afecta�i de diaree neonatală.

Al patrulea capitol de cercetări proprii î�i propune semnalarea unui focar de

criptosporidioză caprină, de la manifestările clinice apărute până la descrierea integrală a

patogenezei criptosporidiozei intestinale la tineretul caprin.

Ultimul capitol de cercetări proprii urmăre�te evaluarea dinamicii

coproeliminărilor de oochisturi de Cryptosporidium �i evaluarea parametrilor

hematologici în vederea determinării răspunsului sistemic, la iezii infecta�i experimental

cu oochisturi de Cryptosporidium spp.


e

EVALUAREA COMPARATIV Ă A METODELOR DE DIAGNOSTIC UTILIZATE PENTRU DETECTAREA OOCHISTURILOR DE

CRYPTOSPORIDIUM SPP.

Acest studiu �i-a propus să evalueze 6 tehnici de diagnostic (colora�ia

Henriksen, colora�ia Gunther, metoda flota�iei cu zaharoză, metoda ELISA, metoda

imunocromatografică �i tehnica PCR).

Au fost luate în studiu un număr total de 195 de probe de fecale, provenite de la

vi�ei cu vârsta cuprinsă între o zi �i 6 săptămâni. Probele au fost recoltate individual de

la nivel rectal �i păstrate la 4ºC.

Colorația Henriksen. Este o metodă de bază pentru identificarea

criptosporidiilor. Prin această tehnică, oochisturile apar de culoare roşu viu, net

delimitate, pe un fond verde sau verde-albăstrui, dacă frotiul este realizat mai gros

Colorația Gunther. Este o altă metodă de bază pentru identificarea

criptosporidiilor. Prin această tehnică, oochisturile apar de culoare albastră pe un fond

roşu.

Metoda de flotație cu zaharoză (Steather). Această metodă se bazează pe

flotarea şi ridicarea ouălor uşoare şi a oochisturilor la suprafaŃa soluŃiei suprasaturate de

zaharoză şi aderarea acestora la o suprafaŃă de sticlă.

Metoda coproELISA. Este o metodă extrem de utilizată pentru depistarea

antigenelor de Cryptosporidium spp. din fecale. Pentru realizarea acestei metode am

folosit kitul BIO K-070 (BioX Diagnostics, Jemelle, Belgium).

Metoda imunocromatografică. Este o metodă de depistare a antigenelor de

Cryptosporidium spp. din probele de fecale. Acest test a fost realizat în concordan�ă cu

instruc�iunile producătorului, utilizând kitul de diagnostic BIO K-155 (BioX

Diagnostics, Jemelle, Belgium).

Tehnica PCR. Pentru realizarea acestei tehnci, s-au urmărit următoarele etape:

extrac�ia ADN-ului, amplificarea prin nested PCR, migrarea probelor în gelul de agar

�i citirea rezultatelor. Extrac�ia s-a realizat utilizând QIAamp DNA kit (Qiagen).

Amplificarea propriu-zisă s-a făcut prin nested PCR utilizând următorii primeri: SSU-1

(5`-GAT TAA GCC ATG CAT GTC TAA G-3`), SSU-2 (5` -TTC CAT GCT GGA


f

GTA TTC AAG- 3`), SSU-3 (5`-CAG TTA TAG TTT ACT TGA TAA TC-3`) �i SSU-

4 (5`-CCT GCT TTA AGC ACT CTA ATT TTC-3`). Migrarea produ�ilor de

amplificare s-a realizat prin electroforeză orizontală în gel de agaroză 1,5%, la 80 V, timp

de 60 de minute. După migrarea probelor în gelul de agaroză, imaginea gelului cu

fragmentele de ADN după migrare a fost fotografiată, utilizând aparatul BioDoc-ITTM

Imaging System

Analiza statistică a rezultatelor a fost făcută cu ajutorul programelor Epi Info

3.5.1, Win Episcope 2.0 �i Statistica. Astfel, s-au calculat: sensibilitatea, specificitatea,

valoarea predictivă pozitivă, valoarea predictivă negativă, prevalen�a adevărată,

prevalen�a aparentă, coeficientul de concordan�ă între teste k, indicele Youden �i

indicele Spearman.

Rezultate

Prevalen�a maximă a fost pusă în eviden�ă prin colora�ia Henriksen (18,5%), în

vreme ce prevalen�a minimă s-a observat prin metoda Steather (7,4%). Valori medii au

fost observate prin metoda coproELISA (16,9%), colora�ia Gunther (16,4%), metoda

PCR (14,8) �i metoda imunocromatografică (13,33%.). În figura 1 se observă

prevalen�a criptosporidiozei prin cele 6 metode diferite de diagnostic.

Fig. 1. Reprezentarea grafică a cazurilor pozitive �i negative pentru Cryptosporidium spp., prin cele 6

metode de diagnostic

Sensibilitatea cea mai ridicată s-a înregistrat în cazul metodei Henriksen (91,89%),

urmată de metodele Gunther (83,78%), PCR (75%) �i coproELISA (72,97%), iar

sensibilitatea cea mai scăzută s-a înregistrat în cazul metodei Steather (44%).


g

Specificitatea tehnicilor studiate a fost peste 95%, fiind chiar 100% pentru metodele

Steather �i PCR.

Metodele coproscopice de depistare a oochisturilor de Cryptosporidium spp. sunt

cele mai ieftine, în vreme ce tehnicile coproELISA �i PCR au costul consumabilelor

foarte ridicat �i necesită investi�ii mari în aparatură. Cea mai expeditivă metodă este

metoda imunocromatografică, în vreme ce metoda PCR este metoda cea mai laborioasă.

Dintre metodele cu sensibilitate ridicată, colora�ia Ziehl-Neelsen, modificată de

Henriksen, este cea mai convenabilă din punct de vedere economic, dar �i din punct de

vedere al u�urin�ei �i timpului necesar realizării.

STUDII EPIDEMIOLOGICE ÎN CRIPTOSPORIDIOZ Ă LA VI țEI țI IEZI DIN

CENTRUL țI NORD-VESTUL ROMÂNIEI

Acest studiu a avut drept scop analiza evolu�iei criptosporidiozei la diferite

categorii de vi�ei �i iezi, urmărindu-se prevalen�a, influen�a vârstei, sexului �i a

varia�iilor sezoniere asupra evolu�iei bolii �i identificarea speciilor de

Cryptosporidium ce afectează vi�eii �i iezii prin micromăsurători �i tehnici de biologie

moleculară.

Au fost lua�i în studiu un număr total de 708 vi�ei, proveni�i din 29 de ferme de

bovine �i 412 iezi proveni�i din 12 ferme de caprine din centrul �i nord-vestul

României. Pentru punerea în eviden�ă a oochisturilor de Cryptosporidium spp. s-a

utilizat colora�ia Henriksen. Au fost efectuate micromăsurători pe un număr de 20 de

oochisturi cu ajutorul programului AdobePhotoshop CS 4, pe imagini obŃinute la

microscopul Olympus BSX430 cu obiectivul cu imersie. Pentru determinarea speciilor de

Cryptosporidium prin tehnici de biologie moleculară s-a utilizat tehnica Multiplex PCR

folosind gena Hsp 70. Pentru aceasta, s-au folosit primeri specifici pentru următoarele 4

genotipuri investigate: Cryptosporidium parvum (genotipul uman), Cryptosporidium

parvum (genotipul bovin), Cryptosporidium canis �i Cryptosporidium felis.

Rezultate


h

A. La vi�ei. Din cei 708 viŃei cu vârsta cuprinsă între o zi şi 8 săptămâni luaŃi în

studiu, 198 de viŃei au fost eliminatori de oochisturi de Cryptosporidium spp., adică

27,96% (95% IC =24,7%- 31,5%).

Eliminări de oochisturi de Cryptosporidium spp. s-au înregistrat încă de la vârsta

de 4 zile, prevalen�a cea mai mare constatându-se între 2 şi 3 săptămâni (fig. 2). Faptul

că infec�ia cu Cryptosporidium spp. a fost diagnosticată atât de timpuriu, sugerează o

contaminare foarte mare a acestei zone. Cea mai mare intensivitate a parazitării cu

Cryptosporidium spp. s-a observat la categoria de vârstă 1-2 săptămâni, unde 54% din

cazuri au prezentat intensivitate medie şi 38% din cazuri intensivitate crescută, în vreme

ce la categoriile de vârstă sub o săptămână şi peste 3 săptămâni, s-a înregistrat o

intensivitate scăzută (fig. 3).

Fig. 2. Prevalen�a criptosporidiozei (%) la viŃei

în funcŃie de vârstă

Fig. 3. Intensivitatea parazitării cu

Cryptosporidium spp. în funcŃie de vârstă

Cele mai mari valori ale inciden�ei infec�iei cu Cryptosporidium spp. s-au

înregistrat la sfâr�itul iernii - începutul primăverii, când au ajuns la 70,21%, în vreme ce

în restul anului, valorile au fost de 16,80 ± 5,78%.

Prin micromăsurătorile oochisturilor de Cryptosporidium spp. s-a depistat

eliminarea unui singur tip de oochist cu dimensiunile de 4,51 ± 0,41 µm lungime �i 4,07

± 0,33 µm lă�ime, având o formă u�or ovală.

Pe baza analizei genei SSU rRNA, prin nested PCR s-a depistat, la 8 probe,

amplificarea unui fragment de 638 bp, specific genului Cryptosporidium. Din cele 8

probe, 5 au fost pozitive pentru Cryptosporidium parvum human genotype (62,5%) �i 3

au fost pozitive pentru Cryptosporidium parvum bovine genotype (37,5%) (fig. 4). Nu s-a


i

pus în eviden�ă nici o probă pozitivă pentru Cryptosporidium canis �i Cryptosporidium

felis.

Fig. 4. Identificarea speciilor de Cryptosporidium prin tehnica PCR: coloana 1 - rulerul, coloanele 2 �i 6

- probe pozitive pentru Cryptosporidium parvum human genotype, coloanele 3 �i 4 - probe negative

pentru Cryptosporidium, coloana 5 - probă pozitivă pentru Cryptosporidium parvum bovine genotype

Asocia�iile parazitare întâlnite la vi�ei de 0-8 săptămâni au fost:

Cryptosporidium spp. �i Eimeria spp.(6,8%), Eimeria spp. �i Strongyloides spp. (0,7%),

iar la 3 vi�ei s-a observat asocierea dintre Eimeria spp., Strongyloides spp. �i Giardia

spp. (0,42%). Eliminări de oochisturi de Cryptosporidium spp. �i Eimeria spp. au fost

identificate în majoritatea fermelor de bovine studiate: 79,31% respectiv 68,96% din

ferme.

Acest studiu este primul studiu sistematic al prevalen�ei criptosporidiozei la

bovine în România �i demonstrează că acest parazit este foarte răspândit, fiind prezent în

79,31% din fermele de bovine din centrul �i nord-vestul României.

B. La iezi. Din cei 412 iezi cu vârsta cuprinsă între o zi şi 6 săptămâni luaŃi în

studiu, 99 de iezi eliminau oochisturi de Cryptosporidium spp., adică 24 % (95% IC

=20,0% - 28,5%).

Prevalen�a cea mai mare a criptosporidiozei la iezi s-a constatat la categoriile de

vârstă 1-2 săptămâni (39,4%), respectiv 2-3 săptămâni (30,2%), eliminări de oochisturi

de Cryptosporidium spp. înregistrându-se încă de la vârsta de 4 zile.

1 2 3 4 5 6


j

Din totalul iezilor examina�i, 349 nu manifestau nici un simptom, în vreme ce 63

de iezi, manifestau simptome exprimate clinic prin diaree galbenă. Dintre cei 63 de iezi

cu diaree, 52 (82,5%) eliminau oochisturi de Cryptosporidium spp., iar 11 (17,5%) nu

eliminau oochisturi. În cazul iezilor fără diaree, din 349 de iezi lua�i în studiu, doar 47

(13,5%) eliminau oochisturi de Cryptosporidium spp.

Criptosporidioza caprină a evoluat înso�ită de simptome exprimate clinic prin

diaree doar în 52,52% din cazuri, în restul cazurilor, aceasta evoluând asimptomatic.

Distribu�ia criptosporidiozei la iezi în func�ie de sex a fost uniformă.

Riscul zoonotic al criptosporidiozei bovine �i caprine poate fi determinat doar

prin tehnici de biologie moleculară care identifică cu exactitate specia implicată în

declan�area infec�iei. Orice efort menit a controla această infec�ie la om �i animale

trebuie să fie direc�ionat spre aceste specii �i categorii de vârstă.

ROLUL CRIPTOSPORIDIILOR ÎN ETIOLOGIA țI PATOGENEZA

SINDROMULUI DE DIAREE NEONATAL Ă LA VI țEI

Acest studiu a avut drept scop analiza evolu�iei criptosporidiozei în cadrul

sindromului de diaree neonatală la vi�ei, urmărindu-se următoarele direc�ii principale:

• stabilirea locului criptosporidiozei în etiologia diareei neonatale, la vi�ei, prin

determinarea frecvenŃei eviden�ierii Rotavirus, Coronavirus, E. coli F5 şi

Cryptosporidium parvum,

• identificarea unor corelaŃii existente între gravitatea manifestărilor clinice, agenŃii

etiologici biotici �i patogeneză, respectiv severitatea modificărilor biochimice şi

hematologice la viŃeii afectaŃi de diareea neonatală.

Cercetările au fost efectuate pe un efectiv total de 110 vi�ei provenind din 3

jude�e din zona de centru �i nord-vest a României. S-au recoltat probe de fecale de la

fiecare individ în parte prin tu�eu rectal, urmărindu-se prezen�a sau absen�a

coproantigenelor de rotavirus, coronavirus, E. coli factorul F5 �i Cryptosporidium spp.,

utilizând kitul Bio-X Duo Digestive ELISA Kit.

Pentru realizarea studiului clinic �i paraclinic în SDN, bolnavii au fost împărŃiŃi,

în funcŃie de gravitatea simptomelor, în două loturi.


k

Lotul nr. 1 a fost alcătuit din 10 viŃei prezentând simptome de enterită catarală.

Lotul nr. 2 a fost alcătuit din 9 viŃei prezentând simptome de enterită hemoragică.

Rezultate

Cryptosporidium parvum este cel mai frecvent agent patogen implicat în SDN cu

o prevalen�ă de 35,45%, în 16,36% din cazuri ca unic agent patogen �i, în 19,09% din

cazuri, în asocia�ie cu al�i enteropatogeni. Infec�ia cu rotavirus a fost identificată în

17,27% din cazuri, din care în 7,27% din cazuri ca unic agent patogen �i în 10% în

asocia�ie cu al�i enteropatogeni. Infec�ia cu coronavirus, a fost identificată în 17,27%

din cazuri, din care în 2,73% din probe ca unic agent patogen �i în 14,54% din probe în

asocia�ie cu Cryptosporidium parvum. Infec�ia cu E.coli factorul F5 a fost identificată

doar în 1,82% din cazuri. 52,27% din probe au fost negative pentru to�i cei 4

enteropatogeni cerceta�i.

Prevalen�a criptosporidiozei a fost cea mai mare în jude�ul Cluj (50%), în vreme

ce, în cazul infec�iilor cu rotavirus �i coronavirus prevalen�ele cele mai mari s-au

înregistrat în jude�ul Satu-Mare, 24,24, respectiv 39,39% (fig. 5).

Infec�ia cu Cryptosporidium parvum a fost cel mai des întâlnită la vârsta de 1-2

săptămâni (56,75%) �i 2-3 săptămâni (46,15%). Infec�iile cu rotavirus �i respectiv

coronavirus au fost cel mai des identificate la categoria de vârstă 1-2 săptămâni în

procente de 35,13 respectiv 29,72%. Infec�ia cu E. Coli, factorul enteropatogen F5, a

fost identificată doar la categoria de vârstă sub o săptămână, la doi vi�ei având 5,

respectiv 7 zile (fig. 6).

Fig. 5. Reprezentarea grafică a ponderii celor 4

enteropatogeni în cele 3 jude�e

Fig. 6. Reprezentarea grafică a ponderii celor 4

enteropatogeni în func�ie de vârstă


l

Sindromul de diaree neonatală la viŃei are o exprimare clinică de gravitate

variabilă care rezultă din interacŃiunea complexă dintre factorii de risc, factorii

declanşatori şi reactivitatea organismului nou-născut. Formele clinice cele mai grave au

fost cele consecutive enteritelor hemoragice în care, alături de deshidratare şi acidoză

metabolică, au evoluat cu efecte agravante anemia şi endotoxemia.

În etiologia SDN la viŃeii cu simptome de enterită catarală nu s-au identificat

agenŃi biotici. La cazurile cu simptome de enterită hemoragică, agenŃii patogeni implicaŃi

au fost reprezentaŃi de Cryptosporidium spp. (66,7%), Eimeria spp. (22,22%), Rotavirus

(11,1%), Coronavirus (11,1%).

Deshidratarea hipertonă şi acidoza metabolică lactică au fost dominantele

patogenetice majore care au marcat sindromul umoral, atât în formele uşoare, cât şi în

cele grave ale sindromului de diaree neonatală. Hipoglicemia evidenŃiată la ambele loturi

de viŃei constituie un element patogenetic major care rezultă în urma anorexiei,

maldigestiei şi malabsorbŃiei.

Fibrinogenul plasmatic reprezintă un indicator umoral foarte sensibil şi fiabil în

afecŃiunile inflamatorii gastro-intestinale la viŃeii nou născuŃi.

CRIPTOSPORIDIOZA NATURAL Ă LA IEZI, ÎNTR-UN FOCAR DIN JUDE țUL CLUJ – OBSERVAțII EPIDEMIOLOGICE, CLINICE, MORFOPATOLOGICE

țI ELECTRONOMICROSCOPICE

Scopul acestui studiu a fost de a descrie un focar natural de criptosporidioză a

iezilor, de la modificările clinice apărute, până la descrierea patogenezei bolii.

În februarie 2009, a fost identificat un focar de criptosporidioză cu diaree apoasă

galbenă, la iezi cu vârsta cuprinsă între o zi �i 3 săptămâni, la o fermă de caprine din

jude�ul Cluj. Fecalele a 58 de iezi mor�i �i 83 de iezi în via�ă au fost prelucrate prin

metode coproparazitologice, în vederea identificării agen�ilor patogeni implica�i. La 10

cadavre s-a făcut examenul necropsic constând în: examen macroscopic, examen

histopatologic �i examen electronomicoscopic.

Rezultate


m

Prevalen�a criptosporidiozei la iezi în cadrul focarului semnalat a fost de 61,70%

(87 / 141).

Manifestările clinice observate au fost diaree la 68,68% din iezi (57 / 83), cifoză,

la 9,64% din iezi (8 / 83) �i deshidratare la 44,58% din iezi (37/83). Mortalitatea iezilor,

în focarul studiat a fost de 41,13%.

Coproeliminări de oochisturi de Cryptosporidium spp. au fost observate la 81,6%

din efectiv (115 / 141).

La examenul anatomopatologic s-au observat cadavre cahectice cu trenul posterior

murdărit cu fecale. Macroscopic, s-a observat conŃinutul intestinal apos, cu fecale

galbene �i ansele intestinale destinse de gaze.

Modificările histologice observate în ileon �i colon au inclus alteraŃii ale

vilozităŃilor caracterizate prin atrofia �i denudarea acestora.

La suprafa�a marginei luminale a enterocitelor s-au eviden�iat oochisturile de

Cryptosporidium, păstrând citoarhitectonica acestora (fig. 7). Unele enterocite parazitate

prezentau distrofie vacuolară.

La nivelul laminei propria s-a observat o congestie a acesteia �i un infiltrat

inflamator discret reprezentat din limfocite �i celule polimorfonucleare.

La nivelul cecumului, mucoasa intestinală a fost intactă �i prezenta numero�i

parazi�i la suprafa�ă (fig. 8).

Fig. 7. Sec�iune la nivelul ileonului distal:

dispari�ia microvililor de pe zonele unde sunt

prezen�i parazi�ii, u�or infiltrat inflamator cu

polimorfonucleate (HE x 1000)

Fig. 8. Sec�iune prin por�iunea proximală a

cecumului: mucoasa intestinala intactă cu

prezen�a a numeroase oochisturi la suprafa�ă

(HE x 400)


n

Criptosporidiile, în sec�iunile histologice �i electronomicroscopice de la nivelul

ileonului, au apărut ca forma�iuni sferice sau ovale, de diverse dimensiuni, înglobate în

marginea în perie a enterocitelor (fig. 9).

Electronomicroscopic, s-a observat tapetarea mucoasei intestinale cu oochisturi de

Cryptosporidium spp. (fig. 10).

Prin mărirea la scară mare a epiteliului ileal cu Cryptosporidium s-a observat

atrofia �i denudarea vilozită�ilor intestinale.

Fig. 9. Scanning electronomicroscopic al

mucoasei ileonului – se observă forma,

oochisturilor de Cryptosporidium la nivelul

mucoasei intestinale (SEM, 3000x)

Fig. 10. Scanning electronomicroscopic al

mucoasei ileonului – se observă tapetarea

mucoasei intestinale cu oochisturi de

Cryptosporidium (SEM, 500x)

CRIPTOSPORIDIOZA EXPERIMENTAL Ă LA IEZI – CERCET ĂRI

PARAZITOLOGICE, CLINICE țI HEMATOLOGICE

Scopul acestui studiu a fost de a evalua dinamica coproeliminărilor de oochisturi

de Cryptosporidium spp. �i de a evalua parametrii sanguini în vederea determinării

răspunsului sistemic, la iezii infecta�i experimental cu oochisturi de Cryptosporidium

spp.

Zece iezi cu vârsta cuprinsă între 7 �i 30 de zile au fost ale�i pentru acest

experiment. Ace�tia au foat împăr�i�i în 2 loturi, fiind infesta�i cu doze diferite. La

iezii din lotul 1, doza infectantă a fost de 2 x 105, iar la iezii din lotul 2, doza infectantă a

fost de 1 x 106 şi a fost administrată o singură dată. Oochisturile de Cryptosporidium spp.

utilizate au provenit de la iezi asimptomatici.


o

Examenul coproparazitologic s-a efectuat utilizând coloraŃia Henriksen, iar

dinamica coproeliminările de oochisturi de Cryptosporidium spp. a fost evaluată folosind

o metodă proprie, şi anume numărarea oochisturilor existente în 100 de câmpuri

microscopice. Pentru determinarea parametrilor hematologici, s-a recoltat sânge de la

fiecare ied în parte, de la nivelul venei jugulare în prima zi anteinfectant �i în ziua a 7-a

postinfectant. Pentru evaluarea diferenŃelor statistice între cele două loturi s-a folosit

testul Wilcoxon Rank Sum Test (Statistix 9.0).

Rezultate

De�i doza infectantă a fost mai mare în cazul iezilor din lotul II, eliminările de

oochisturi de Cryptosporidium au apărut prima dată la un ied din primul lot, în a doua zi

pi. Acest ied a murit în a 6 zi pi.

La lotul I, oochisturile au fost excretate începând cu a 2-a zi pi şi au crescut până

în a 7-a zi pi, după care au început să scadă până în ziua a 15-a pi. După această zi, nu s-

au mai observat eliminări de oochisturi de Cryptosporidium la nici unul din iezii din

primul lot (fig. 11). În cazul lotului II, coproeliminări de oochisturi de Cryptosporidium

au fost observate începând din a 2-a zi pi �i au crescut până în a 9-a zi pi, după care au

scăzut. În a 15-a zi pi, un singur ied mai elimina oochisturi de Cryptosporidium (fig. 12).

Fig. 11. Dinamica coproeliminărilor de

oochisturi de Cryptosporidium, la lotul I

Fig. 12. Dinamica coproeliminărilor de

oochisturi de Cryptosporidium, la lotul II

Din punct de vedere clinic, iezii din ambele loturi au prezentat descărcări diareice

fluide, de culoare galbenă, murdărind coada şi membrele pelvine. De asemenea, s-a

remarcat apatie �i tendinŃă evidentă la decubit. La unii iezi s-a observat uscăciunea

botului �i persistenŃa pliului pielii la nivelul pleoapei superioare, simptome sugerând

Cryptosporidiosis in calves and goat kids: research concerning diagnosis, epidemiology, and etiopathogenesis

p

diferite grade de deshidratare. Un aspect deosebit de important este acela că nici unul din

subiecŃii luaŃi în studiu nu a prezentat modificări ale temperaturii corporale, nici chiar

aceia care prezentau diaree severă.

Tabloul umoral la iezii cu criptosporidioză, infecta�i experimental, nu aduce

elemente patognomonice de diagnostic pozitiv, dar furnizează elemente valoroase de

prognostic şi mai ales de orientare şi fundamentare a unei conduite terapeutice raŃionale.

Valorile hematocritului au fost mai mici anteinfectant decât postinfectant la

ambele loturi de iezi �i nu s-au înregistrat diferen�e semnificative statistic între cele

două loturi (p=0,31) (fig. 13). Valorile eritrocitelor totale �i ale hemoglobinei nu au

suferit modificări ante- �i postinfectant, situându-se la limita superioară a volorilor

fiziologice ale speciei �i categoriei de vârstă.

Comportamentul leucocitelor este dependent de reactivitatea individuală �i de

momentul prelevării probelor. Valoarea leucocitelor totale a scăzut la ambele loturi între

cele două determinări, însă nu există diferen�e semnificative statistic (p=0,95) (fig. 14).

Gravitatea manifestărilor clinice �i modificările tabloului umoral nu sunt

dependente de doza cu care s-a produs infec�ia experimentală.

Fig. 13. Valoarea comparativă a hematocritului

la cele două loturi, ante- �i postinfectant

Fig. 14. Valoarea comparativă a leucocitelor

totale la cele două loturi, ante- �i postinfectant


q

UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND VETERINARY MEDICINE CLUJ-NAPOCA

DOCTORAL SCHOOL COLLEGE OF VETERINARY MEDICINE


SUMMARY OF Ph.D THESIS

PROJECT LEADER Vasile COZMA, Professor Ph.D

CLUJ-NAPOCA 2009


r

UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND VETERINARY MEDICINE CLUJ-NAPOCA

DOCTORAL SCHOOL COLLEGE OF VETERINARY MEDICINE


CRYPTOSPORIDIOSIS IN CALVES AND GOAT KIDS: RESEARCH CONCERNING DIAGNOSIS, EPIDEMIOLOGY,

AND ETIOPATHOGENESIS

SUMMARY OF Ph.D. THESIS

Scientific Coordinator Vasile COZMA, Professor Ph.D

CLUJ-NAPOCA 2009


s

SUMMARY

Criptosporidiosis is a disease found in humans and animals, with a favorable

evolution in the organisms immunocompetents and serious in immunodeficiency

organisms characterized clinically, mainly, by gastrointestinal disorders and occasionally

by respiratory, hepatic and pancreatic disorders. The disease is a zoonosis because is

transmitted from animals to humans.

The zootehnic economical looses, associated with this disease, are not correlated

with mortality, but are related with growth retardation, cost of therapies and veterinary

services.

The attention in protozoan Cryptosporidium is expending from biological and

parasitological academic areas to veterinaries, epidemiologists, pharmacists, specialists in

public health, public water, farmers and common people. The concern in prevention and

treatment of criptosporidiosis is extended from underdeveloped community to

industrialized society, from immunodepressed people to healthy population.

After 1990, resulting from many researchers was found that in water commonly

used by humans and animals, there are frequently Cryptosporidium oocysts. 19 outbreaks

of Cryptosporidium with water origin are cited and approximatively 427000 humans

were affected. All the water treatment and filtration can`t guarantee the absence of

Cryptosporidium oocysts. Water represents the most important vehicle for the

transmission of criptosporidiosis to animals and humans.

Research goals

The first chapter of the personal research plans to evaluate six different diagnostic

techniques (two staining methods, one flotation method, two immunological methods,

and one molecular biology method) in terms of efficiency, sensitivity, and specificity of

cost, time, and ease of completion.


t

Once established the most suitable diagnostic technique from the economic, ease

of achieving, and sensitivity and specificity point of view, further research was carried

out only through this method.

The second chapter of the personal research aims to analyze the evolution of

Cryptosporidiosis in different categories of calves and goat kids, following a few main

directions. Thus, a descriptive epidemiological study was developed, in order to

understand the frequency and prevalence of the disease in calves and goat kids; the

influence of age, sex, and seasonal variations on the disease was followed; the

Cryptosporidium species that affects calves was identified through micro-measurements,

and also through molecular biology techniques; last but not least a study concerning the

parasitosis that affect calves aged one day through eight weeks was completed.

The third chapter of the personal research aimed at determining the place of

Cryptosporidiosis in the etiology of neonatal diarrhea in calves. The research tracked the

frequency of Cryptosporidium spp., E. coli factor F5, Rotavirus and Coronavirus

discharge in calves from the center and northwest regions of Romania and tried to

identify a correlation between the seriousness of clinical manifestations, biotic and

etiologic agents, and the severity of biochemical and hematological anomalies in calves

presenting neonatal diarrhea.

The fourth chapter of the personal research aims to report an outbreak of goat

Cryptosporidiosis, from clinical manifestations to full description of the pathogenesis of

the intestinal Cryptosporidiosis in goat youth.

The last chapter of the personal research intends to assess the dynamics of the

coproelimination of oocysts and the hematological parameters, in order to determine the

systemic response in experimentally infected goat kids with Cryptosporidium spp.

oocysts.

COMPARATIVE ASSESSMENT OF DIAGNOSTIC METHODS UTILIZED IN THE DETECTION OF CRYPTOSPORIDIUM SPP. OOCYSTS


u

This study aims to evaluate six diagnostic techniques: Henriksen stain, Guthner

stain, sucrose flotation method, ELISA method, immunochromatographic method, and

the PCR technique.

A number of 195 fecal samples were studied, coming from calves aged one day

through six weeks. Samples were collected individually from rectal level and kept at a

temperature of 4ºC.

Henriksen Stain. It is a basic method for identifying different types of

Cryptosporidiosis. Through this technique, oocysts appear a very deep red color, well

defined, on a blue-green background, if the smear is made thicker.

Gunther Stain. It is another basic method for identifying different types of

Cryptosporidiosis. Through this technique, oocysts appear blue on a red background.

Sucrose Flotation Method (Steather). This method is based on the flotation and

rising of light oocysts to the surface of the supersaturated sucrose solution, and their

adherence to a glass surface.

Copro-ELISA Method. It is a highly used method for detecting antigens of

Cryptosporidium spp. in feces. To implement this method, the BIO K-070 kit was used

(BioX Diagnostics, Jemelle, Belgium).

Immunochromatographic Method. It is a method of detecting antigens of

Cryptoporidium spp. in fecal samples. This test was performed according to the

manufacturer’s instructions, utilizing BIO K-155 diagnostic kit (BioX Diagnostics,

Jemelle, Belgium).

PCR Technique. To accomplish this technique, these steps were followed: DNA

extraction, amplification through nested PCR, migration of samples in agarose gel, and

reading of results. Extraction was performed using the QIAamp DNA kit (Qiagen). The

amplification itself was performed through nested PCR, utilizing the following primers:

SSU-1 (5`-GAT TAA GCC ATG CAT GTC TAA G-3`), SSU-2 (5` -TTC CAT GCT

GGA GTA TTC AAG- 3`), SSU-3 (5`-CAG TTA TAG TTT ACT TGA TAA TC-3`) �i

SSU-4 (5`-CCT GCT TTA AGC ACT CTA ATT TTC-3`). Movement of amplification

products was achieved through horizontal electrophoresis in 1.5% agarose gel at 80V for

60 minutes. After the movement of samples in the agarose gel, the image of the gel with


v

the DNA fragments was photographed, utilizing the BioDoc-ITTM Imaging System

camera.

The statistical analysis of results was performed using Epi Info 3.5.1, Win

Episcope 2.0, and Statistica software. Thus were calculated: sensitivity, specificity,

positive predictive value, true prevalence, and apparent prevalence, the correlation

coefficient between k tests, Youden index, and Spearman index.

Results

Maximum prevalence was evidenced through Henricksen stain (18.5%), while

minimum prevalence was observed through Steather method (7.4%). Median values were

observed through Copro-ELISA method (16.9%), Gunther stain (16.4%), PCR method

(14.8%), and immunochromatographic method (13.33%). Figure 1 notes the prevalence

of Cryptosporidiosis through the six different diagnostic methods.

Fig. 1. Graphic representation of positive and negative cases of Cryptosporidium spp.,

through the six different diagnostic methods

The highest sensitivity was achieved through the Henriksen stain method

(91.89%), followed by Gunther method (83.78%), PCR method (75%), and copro-ELISA

method (72.97%), and the lowest sensitivity was observed through the Steather method

(44%). The specificity of studied techniques was over 95%, with even 100% for the PCR

and Steather methods.

The coproscopic methods used in the detection of Cryposporidium spp. oocysts

are the cheapest, while the copro-ELISA technique and the PCR method involve high

cost of consumables and require large investment in equipment. The most expedient


w

method is the immunochromatographic method, while the PCR method is the most

laborious.

Between the high sensitivity methods, the stain Ziehl-Neelsen, modified by

Henriksen, is the most convenient from the economic point of view, but also in terms of

ease and time required to achieve.

EPIDEMIOLOGICAL STUDIES CONCERNING CRYPTOSPORIDIOSI S

IN CALVES AND GOAT KIDS

IN THE CENTER AND NORTHWEST REGIONS OF ROMANIA

This study aimed to analyze the evolution of Cryptosporidiosis in calves and goat

kids, following the prevalence, the influence of age, sex and seasonal variations on the

disease, and the identification of Cryptosporidium species that affect calves and goat kids

through micro-measurements and molecular biology techniques.

A total of 708 calves originating from 29 cattle farms and 412 goat kids coming

from 12 goat farms from the center and northwest regions of Romania were studied. The

Henriksen stain was used for the highlight of Cryptosporidium spp. oocysts. Micro-

measurements were conducted on 20 oocysts, with the use of Adobe Photoshop CS 4

software, on images obtained with the Olympus BSX430 microscope with immersion

objective. The Multiplex PCR technique using the gene Hsp 70 was employed in order to

determine the Cryptosporidium species through molecular biology techniques. Specific

primers were used for the following four studied genotypes: Cryptosporidium parvum

(human genotype), Cryptosporidium parvum (bovine genotype), Cryptosporidium canis,

and Cryptosporidium felis.

Results

A. In calves. Between the 708 studies calves, aged from one day to eight

weeks, 198 calves, or about 27.96% (95% IC=24.7%-31.5%) were eliminating

Cryptosporidium spp. oocysts.

Cryptosporidium spp. oocysts were eliminated starting at 4 days old, the highest

prevalence being observed between 2-3weeks (figure 2). The fact that Cryptosporidium


x

spp. infection was diagnosed at such an early age, suggests a high contamination of this

area. The highest intensity of the parasitization with Cryptosporidium spp. was observed

between 1-2 weeks, where 54% of the cases presented average intensity, and 38%

presented elevated intensity, while at ages under one week and over three weeks, a low

intensity was observed (figure 3).

Fig. 2. Cryptosporidiosis prevalence (%) in

calves by age

Fig 3. Intensity of the parasitization with

Cryptosporidium spp. by age

The highest values of Cryptosporidium spp. infection incidence were observed at

the end of winter – beginning of spring, when they reached 70.21%, while at other times

during the year , the incidence was 16.80% ± 5.78%.

Through Cryptosporidium spp. micro-measurements it was detected the

elimination of one single type of oocyst measuring 4.51 ± 0.41 µm in lenght and 4.07 ±

0.33 µm in width, having a slightly oval shape.

Based on the analysis of SSU rRNA gene, trough nested PCR, it was detected in 8

samples, the amplification of a fragment of 638 bp, specific to the Cryptosporidium

genus. Out of the 8 samples, 5 were positive for Cryptosporidium parvum, human

genotype (62.5%), and 3 were positive for the Cryptosporidium parvum bovine genotype

(37.5%) (figure 4). No positive sample was revealed for the Cryptosporidium canis and

Cryptosporidium felis.


y

Fig. 4 Cryptosporidium species identification through PCR technique: column 1 – ruler; columns 2 and 6

– positive samples of Cryptosporidium parvum human genotype; columns 3 and 4 – negative samples for

Cryptosporidium; column 5 – positive sample for Cryptosporidium parvum bovine genotype

The parasitological associations in calves between 0-8 weeks were:

Cryptosporidium spp. and Eimeria spp. (6.8%), Eimeria spp. and Strongyloides spp.

(0.7%), and in 3 calves the association between Eimeria spp., Strongyloides spp., and

Giardia spp. was observed (0.42%). Oocysts elimination of Cryptosporidium spp. and

Eimeria spp. was identified in the majority of the studied cattle farms : 79.31% and

respectively 68.96% of farms.

This is the first systematic study concerning the prevalence of Cryptosporidiosis in

cattle in Romania and demonstrates that this parasite is widespread, being present in

79.31% of the cattle farms in the center and northwest region of Romania.

B. In goat kids. Of the 412 goat kids aged between one day and 6 weeks

taken into the survey, 99 of them or 24% (95% IC = 20.0%-28.5%) were eliminating

Cryptosporidium spp. oocysts.

The highest Cryptosporidiosis prevalence in goat kids was observed between 1-2

weeks of age (39.4%), respectively 2-3 weeks of age (30.2%), oocysts elimination being

recorded starting at 4 days of age.

From the total of examined goat kids, 349 did not present any symptoms, while 63

of them presented symptoms manifested clinically through yellow diarrhea. From the 63

goat kids with diarrhea, 52 (82.5%) were eliminating Cryptosporidium spp. oocysts , and

1 2 3 4 5 6


z

11 (17.5%) were not eliminating oocysts. For the goat kids without diarrhea, from the

349 goat kids taken into the study, only 47 (13.5%) were eliminating Cryptosporidium

spp. oocysts.

Goat Cryptosporidiosis evolved with symptoms expressed clinically through

diarrhea in only 52.52% of the cases, for the rest of the cases, the disease developed

asymptomatically. Cryptosporidiosis distribution in goat kids by gender was uniform.

The zoonotic risk of Cryptosporidiosis in cattle and goats can only be determined

through molecular biology techniques that identify the exact species involved in the onset

of the infection. Any effort designed to control this disease in humans and cattle has to be

directed toward these species and age categories.

THE PLACE OF CRYPTOSPORIDIOSIS IN THE ETIOLOGY OF T HE

NEONATAL DIARRHEA IN CALVES

This study aimed to analyze the evolution of Cryptosporidiosis in the Neonatal

Diarrhea Syndrome in calves, by following these main directions:

• Determining the place of Crytposporidiosis in the etiology of the neonatal diarrhea

in calves, by determining the isolation frequency of Rotavirus, Coronavirus, F5 E.

coli, and Cryptosporidium parvum

• Identifying the correlations between the severity of the clinical manifestations,

biotic etiological agents, and the severity of the hematological and biochemical

anomalies in calves affected by neonatal diarrhea

The research was conducted on 110 calves coming from three different counties in

the center and northwest region of Romania. Fecal samples were collected from each

individual through rectal exam, trying to find the presence or absence of copro-antigenes

of Rotavirus, Coronavirus, F5 E. Coli, and Cryptosporidium spp. using the Bio-X Duo

Digestive ELISA kit.

To accomplish the clinical and paraclinical study in Neonatal Diarrhea Syndrome,

the patients were divided in two groups, based on the severity of their symptoms:


aa

Group No. 1 was made of 10 calves presenting symptoms of catarrhal enteritis

Group No. 2 was made of 9 calves presenting symptoms of hemorrhagic enteritis

Results

Cryptosporidium parvum is the most common pathogen involved in the Neonatal

Diarrhea Syndrome, with a prevalence of 35.45% of the total cases, in 16.36% of them as

a sole pathogen, and in 19.09% of the cases in association with other enteropathogens.

The Rotavirus infection was found in 17.27% of the total cases, from which in 7.27% as a

sole pathogen, and in 10% in association with other enteropathogens. The infection with

Coronavirus was identified in 17.27% of the total cases, from which in 2.73% as a sole

pathogen, and in 14.54% in association with Cryptosporidium parvum. The Factor 5 E.

coli infection was identified in only 1.82% of the total cases. Out of the total sample

cases, 52.27% were negative for all 4 of the studied enteropathogens.

The prevalence of Cryptosporidiosis was highest in the Cluj County (50%), while

the Rotavirus and Coronavirus infections had the highest prevalence in Satu Mare

County, with 24.24% and respectively 39.39% (figure 5).

The infection with Cryptosporidium parvum was most common at the age of 1-2

weeks (56.57%) and 2-3 weeks (46.15%). The infections with Rotavirus and respectively

Coronavirus were mostly identified at the age of 1-2 weeks, in about 35.13% respectively

29.72% of the cases. Factor F5 E. Coli infection was identified only in the age group of

less than a week, in two calves age 5, and respectively 7 days old (figure 6).

Figure 5. Graphic representation of the ratio of

the four enteropathogens in the three counties

Figure 6. Graphic representation of the four

enteropathogens by age


bb

The Neonatal Diarrhea Syndrome on calves has a variable clinical expression,

which results from the complex interaction between the risk factors, the onset factors, and

the newborn’s reactivity. The most severe clinical forms were those consecutive to the

hemorrhagic enteritis in which, besides the dehydration and metabolic acidosis, evolved

anemia and endotoxemia.

In the Neonatal Diarrhea Syndrome in calves with symptoms of catarrhal enteritis,

no biotic agents were identified. In the cases with symptoms of catarrhal enteritis, the

pathogenic agents involved were represented by Cryptosporidium spp. (66.7%), Eimeria

spp. (22.22%), Rotavirus (11.1%), and Coronavirus (11.1%).

Hypertonic dehydration and metabolic lactic acidosis were the major pathogenetic

elements that marked the humoral syndrome, both in the mild and severe forms of the

Neonatal Diarrhea Syndrome. Hypoglycemia, evidenced in both groups of calves,

constitutes a major pathogenetic element that results from the anorexia, maldigestion, and

malabsorption.

The plasmatic fibrinogen represents a very sensitive and reliable humoral indicator

in the gastrointestinal inflammatory diseases in newborn calves.

RECORDING OF AN OUTBREAK OF GOAT CRYPTOSPORIDIOSIS

IN CLUJ COUNTY

The purpose of this study was to describe an outbreak of goat Cryptosporidiosis,

from the clinical manifestations through the full description of the pathogenesis of

intestinal Cryptosporidiosis in young goats.

In February 2009, an outbreak of Cryptosporidiosis with aqueous yellow diarrhea

was identified, in goat kids aged one day through three weeks, in a goat farm in Cluj

County. The feces of 57 dead goat kids and 83 living goat kids were processed through

coproparasitological techniques, in order to identify the pathogens involved. On 10

corpses a necropsic exam was performed, consisting of macroscopic exam,

histopatological examination, and electronomicroscopic exam.


cc

Results

The prevalence of Cryptosporidiosis in goat kids in the outbreak was 61.70% (87

out of 141).

The clinical manifestations observed were diarrhea in 68.68% of goat kids (57 out

of 83), kyphosis in 9.64% of the goat kids (8 out of 83), and dehydration in 44.58% of the

goat kids (37 out of 83). Mortality rate in the studied outbreak was 41.13%.

Coproelimination of Cryptosporidium spp. was observed in 81.6% o the total goat

kids (115 out of 141).

At the anatomical-pathological exam, cachectical corpses with hindquarters soiled

with feces were observed. Macroscopically, there was watery intestinal content, with

yellow feces and the intestines presented relaxed from gases.

Histological changes observed in the ileum and colon include alterations of the

intestinal villosities, characterized mainly through atrophy and denudation.

Cryptosporidium oocysts were found on the surface of the luminal membrane of

the enterocytes, keeping their cytoarchitecture (figure 7). Some of the parasitic

enterocytes presented vacuolar dystrophy.

Concerning the lamina propria, it was observed a congestion of itself and a

discrete inflamatory infiltrate represented by lymphocytes and polymorphonuclear cells.

In the cecum, the intestinal mucosa was intact and presented numerous surface

parasites (figure 8).

Figure 7. Section at the distal ileum: microvilli

disapearance in thea areas where parasites are

present, slight inflammatory infiltrate with

polymorphonuclear cells (HE x 1000)

Figure 8. Section through the proximal portion

of the cecum: intestinal mucosa intact with the

presence of numerous surface oocysts (HE x

400)


dd

Cryptosporidium, in the histological and electron-microscopic sections of the

ileum, appeared as spherical or oval formations, of various dimensions, embedded in the

brush border of the enterocytes (figure 9).

Through the electron-microscopic scanning it was observed the covering of the

intestinal mucosa with Cryptosporidium spp. oocysts (figure 10).

By increasing the scale of the ileum epithelium with Cryptosporidium, the atrophy

and denudation of intestinal villosities can be observed.

Figure 9. Electron microscopic scanning of the

ileum mucosa – the form of the

Cryptosporidium oocysts at the level of the

intestinal mucosa can be observed (SEM,

3000x)

Figure 10. Electron-microscopic scanning of the

ileum mucosa – the covering of the intestinal

mucosa with Cryptosporidium oocysts can be

observed (SEM, 500x)

EXPERIMENTAL INFECTION IN GOAT KIDS

The purpose of this study was to assess the dynamics of Cryptosporidium spp.

oocyst eliminations and to evaluate blood parameters in order to determine the systemic

response in goat kids experimentally infected with Cryptosporidium spp. oocysts.

Ten goat kids aged between 7 and 30 days were chosen for this experiment. These

were divided in two groups, being infected with different doses. In goat kids from first

group, the infective dose was of 2 x 105, and in goat kids from the second group the

infective dose of 1 x 106 administered once per day. The Cryptosporidium spp. oocysts

used, were from asymptomatic goat kids.

The coproparasitological exam was performed using Henriksen stain, and the

dynamics of Cryptosporidium spp. oocysts eliminations was evaluated using a personal


ee

method, namely counting existing oocysts in 100 microscopical fields. In order to

determine the hematological parameters, blood was drawn from each goat kid, from the

jugular vein in the first day before the infection was started and in the 7th day after the

infection began. In order to evaluate the statistical differences between the two groups,

the Wilcoxon Rank Sum Test (Statistix 9.0) was used.

Results

Although the infecting dose was higher in the second group, the Cryptosporidium

oocysts elimination started first in a goat kid from group number one, in the second day

pi. This goat kid died in the sixth day pi.

In group I, the oocysts were excreted starting with the 2nd day pi and increased

until day 7 pi, then started to decrease until day 15 pi. After this day, the elimination of

Cryptosporidium oocysts was not observed anymore in none of the goat kids from first

group (figure 11). In group II, Cryptosporidium oocysts elimination was observed

starting in the 2nd day pi and increased until the 9th day pi, after which it started to

decrease. In the 15th day pi, only one goat kid was still eliminating Cryptoporidium

oocysts (figure 12).

Figure 11. Dynamics of Cryptosporidium

oocysts elimination in group I

Figure 12. Dynamics of Cryptosporidium

oocysts elimination in group II

Clinically, goat kids from both groups presented fluid diarrhea, yellow colored,

soiling of the tail and back limbs. Also, they presented apathy and a tendency to lie flat.

In some goat kids dry nose and upper lid skin fold were observed, symptoms that

suggests various degrees of dehydration. A particularly important aspect was that none of


ff

the subjects taken into study showed changes in body temperature, not even those which

presented severe diarrhea.

The humoral picture in goat kids experimentally infected with Cryptosporidiosis

does not bring any pathognomonic elements of positive diagnosis, but it does provide

valuable prognostic factors and especially the guidance and foundation of a rational

therapeutic behavior.

The hematocrit levels were lower before the infection then after in both groups of

goat kids and did not present any statiscally significant differences between the two

groups (p=0.31) (figure 13). Total erythrocyte and hemoglobin values did not change pre-

and postinfection, being situated at the upper limit of the physiological values for the

species and age group.

The leukocyte behavior is dependent on the individual reactivity and time of

sampling. The total value of the leukocyte decreased in both groups between the two

determinations, but did not present any statistically significant differences (p=0.95)

(figure 14).

The severity of clinical manifestations and humoral picture changes are not

dependent on the specific dose that generated the experimental infection.

Figure 13. The comparative value of the

hematocrit in the two different grous, pre- and

postinfection

Fig. 14. The comparative value of the total

luecocytes in the two groups, pre- and post

infection

ALEXANDRU LUCIAN BEJAN REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT · Prin aceast ă tehnic ă, oochisturile apar...

Documents

Transcript of ALEXANDRU LUCIAN BEJAN REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT · Prin aceast ă tehnic ă, oochisturile apar...