ADN_recombinant

8/7/2019 ADN_recombinant

1/6

12/11/200

TehnologiTehnologiii ADNADNrecombinantrecombinant

Analiza genelor

Secveniere

PCR

Southern-blot

Hibridare in situ

ADN ProteineARN

Northern-blot

RTPCR

Hibridare in situ

Western-blot

Secveniere

Analiza funciei

Analiza

histochimic

Utilizarea tehnicilor deUtilizarea tehnicilor de

analiz a acizilor nucleicianaliz a acizilor nucleiciAAnalizanaliza ADN:ADN:

depistarea mutaiilor genice diagnostic precis albolilor genetice (prenatal, postnatal precoce);

identificarea polimorfismului individual dactiloscopie genomic (analiza filiaiei);

depistarea ADN strin (bacterian, viral) diagnosticulbolilor infecioase i gradului de infectare.

Analiza ARNm:Analiza ARNm:

analiza expresiei genice esut-specific;

evaluarea gradului de expresie a genei normale /

patologice.

Izolarea acizilor nucleiciIzolarea acizilor nucleiciIzolarea ADN

Colectarea materialului biologic (celule nucleate dinorice esut)

Lezarea celulelor (nucleilor) prin aciunea detergenilor

Izolarea nucleilor (opional) prin lezarea celulelor nsoluii hipotonice

Precipitarea acizilor nucleici n prezena alcoolilori asrurilor(70% etanol)

Deproteinizarea: prin aciunea proteazelor, urmat deprelucrarea cu solveni organici (fenol, cloroform)

Izolarea ARNm

Colectarea materialului din esutul de interes la stadia deinteres

Lezarea celulelor n prezena detergenilor i a inhibitorilorde ARN-aze

Deproteinizarea cu utilizarea solvenilororganici

Precipitarea selectiv a ARN n prezena srurilor (LiCl,CH3COONa)

Precipitarea ARN n prezena alcoolului.

ADNrecombinantADN recombinant

molecul de ADN obinutdin segmente de origine

diferit, capabil sfuncioneze


2/6

12/11/200

Scopul tehnologiei ADN recScopul tehnologiei ADN rec

Clonarea genei/secvenei de interes cu scop de:multiplicare;

izolare i formare a bibliotecilor de ADNrec;analiz molecular.

Expresia genic cu scop de:analiz a funciei genei clonate;obinerea produsului proteic.

Etapele obinerii ADNEtapele obinerii ADN recombinantrecombinant1. Izolarea ADN de cercetat i a vectorilor de clonare

2. Clivare enzimatic a ADN de cercetat i vectoruluide clonare

3. Ligarea fragmentului de ADN de interes cu vectorulde clonare obinerea ADN recombinant

4. Introducerea ADN recombinant ntr-o gazd declonare - transformare

5. Clonarea genei de intres prin replicarea vectorului

6. Expresia genei de intres prin sinteza proteinei

7. Selecia celulelor transformate prin tratare cuantibiotice i utiliznd marcherei radioactivi saufluoresceni

Etape necesare pentru manipulareaEtape necesare pentru manipularea

ACIZILOR NUCLEICIACIZILOR NUCLEICI

- Cum se izoleaz ADN sau ARN dintr-o celul?- Cum se obin fragmente de ADN de cercetat?

- FR (ER, SR, RFLPs, hri de restricie)- ADNc (ADN complimentar unei mol. ARNm);

- Cum se separ fragmentele de AN i cum se apreciazlungimea comparare a ADN la diferite persoane(electroforeza AN)?;

- Cum se vizualizeaz ADN, avnd dimensiunisubmicroscopice?

- Principiile clonrii ADN in vivo (vectori de clonare,gazde de clonare) i clonrii ADN in vitro;

- Denaturarea ADN in vitro- Hibridizarea mol. ADN (ADN/ADN; ADN/ARN)

Componentele necesare pentruComponentele necesare pentru

tehnologiatehnologia ANDAND recrec = clonarea ADN= clonarea ADN inin vivovivo::

-ADN de clonat (de cercetat): FR, ADNc

-Vector de clonare:

- mol ADN capabil s insereze ADN strin- s transfere ADN de clonat ntr-o cel- s se replice independent de replicarea ADN cel gazd

- Enzime de restricie = restrictaze

- Gazd de clonare compatibil cu vectorul

- Sistem de selecie a clonelor analizate

- Set de enzime pentru manipularea ADN

Vectorul Dimensiunile fragmentuluiinserat

Gazda declonare

Plasmide Pn la 10 kb (ADN

genomic, ADNc)

Bacterii,

Drojdii

Bacteriofagi Pn la 25 kb (ADNgenomic, ADNc)

Bacterii

Cosmide 30-45 kb (ADN genomic) Bacterii

BAC (Cromozom artificialal bacteriilor)

Pn la 300 kb (ADNgenomic)

Bacterii

YAC (Cromozom artificialal drojdiilor)

0,2-2.0 Mb (ADN genomic) Drojdii

Dimensiunile inseriilor clonate n diferiiDimensiunile inseriilor clonate n diferiivectorivectori

Vectorul:-se replic autonom n celula gazd (conine punct ori)-are capacitate s insereze i s transfereADN strin (conine situsuri derestricie)-conine gene de rezisten la antibiotice (capacitate de a fi selectate)

Celula bacterianCelula bacterian


3/6

12/11/200

Vector plasmidicCromozom artificial

al drojdiilor (YAC)

Ligarea inseriilor n vector

ObObinerea FRinerea FR fragmentelor de restricie prinfragmentelor de restricie prinaciunea specific a ER (enzimelor de restricie)aciunea specific a ER (enzimelor de restricie)

Situsuri recunoscute de enzime de restricie

RFLPs polimorfismul FR la dou persoane X i Z


4/6

12/11/200

SR secven palindromic de nucleotide, recunoscuti clivat de enzimele de restricie

ER edonucleaz situs specific de origine bacteriancare recunoate un SR i cliveaz ADN bicatenar

Hri de restricie dispunerea relativ a situsurilor derestricie ntr-o molecul de ADN

FR fragment ADN bicatenar obinut prin clivare cuajutorul restrictazelor

RFLPs Polimorfismul Lungimii Fragmentelor deRestricie, ce identific diferenele individuale alemoleculelor de ADN

M

--

++

10 kb

8 kb

6 kb

4 kb

2 kb

12 kb

10 kb

6 kb

5 kb

2,5 kb

2,5 kb

10 kb

6 kb

5 kb

Vizualizarea ADN

Colorarea specific Vizualizare cu sonde marcate

Fuxn bazic(in situ)

Bromur deetidiu

(n geluri)

Fluorescente

(reci)

Radioactive

(calde)

Sunt necesare

cantiti mari de ADN

Este necesar de tiut

structura secvenei

ADN de cercetat

Clonarea in vivo, ntr-o celbactrerian, a unei geneumane

Probleme:

Genele umane sunt mari; Conin secvene

reglatoare diferite de celea bacteriilor;

Conin introni ce nu pot finlturai ce celulabacterian.

Soluie:Soluie:Obinerea unui ADNc pe bazaObinerea unui ADNc pe bazaARNm caracteristic geneiARNm caracteristic genei

intint

Etapele obinerii ADNc (ADNcomplementar)

Izolarea ARN+ poli(A)

Hibridarea poli(A) cu oligo(dT)

Sinteza ADNc cu ajutorulrevertazei

Hidroliza ARN

Sinteza ADN bicatenar cuajutorul ADN-polimerazei


5/6

12/11/200

Rolul practic al tehnicilor de analiz aacizilor nucleici:

1. Cercetare secvenierea ADN, formarea bibliotecilor degene, studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de

reglare, studiul consecinelor mutaiilor.

2. Depistarea persoanelor purttoare de mutaii - prenatalsau postnatal, cu scop de prevenire a naterii copiilor cuanomalii genetice sau manifestrii unor patologii severe.

3. Terapie genic (alegerea genei int, construireavectorilor de gene etc.).

4. Depistarea ADN strin (viral sau bacterian) ndiagnosticul bolilor infecioase.

5. Identificarea polimorfismelor individuale n analizafiliaiei, n criminalistic.

Clonare in vivo Clonare in vitro (PCR)

Amplificare ADN (clonare)

Hibridizare molecular

Analiz molecular

Molecule de ADN

Clonarea ADNClonarea ADN

== multiplicarea unei mol ADN prin replicaremultiplicarea unei mol ADN prin replicare

repetatrepetat

In vivo

Tehnologia ADN rec

Utilizarea celulei gazd de clonare

Replicarea ntr-unvector de clonare cuutilizarea aparatuluide replicare a celuleigazd

Cu posibilitateaobinerii produsuluiproteic

In vitro

Tehnica PCR

Este relizat neprubet

Replicarea uneisecvene de interescu ajutorul unui

aparat de replicareartificial

Clonarea in vitro PCR

(reacia ciclic de polimerizare anoilor copii de ADN)

Componentele necesare pentru

clonarea in vitro (PCR):- ADN de cercetat

- Primeri specifici secvenei de clonat complimentari secvenelor flancante

- Taq-polimeraza ADN-polimeraz termostabil

- Dezoxinucleozidtrifosfai (dNTP)

- Instalaie de modificare ciclic a temperaturii:- t de denaturare ADN- t de renaturare (ADN+primer)- t de polimerizare (elongarea catenelor

noi de ADN)

Etapele tehnicii PCREtapele tehnicii PCR

Denaturarea ADN la 96oC

A. Pregtirea amestecului cu toate componentele reactante

Rcirea pn la temperatura de renaturare a primerilor

Elongarea catenelor ADN la 72oC

B. Repetarea automat a procedurelor de denaturare-renaturare-elongare de 30-35 ori

C. Analiza produilor PCR- electroforeza

- colorarea

- interpretarea rezultatelor


6/6

12/11/200

Biblioteci de geneBiblioteci de gene

Biblioteci genomice conin secvene de ADN

genomic, obinut prin digestie enzimaticBiblioteci ADNc conin secvene de ADNc,obinute n baza setului de ARNm

Biblioteci cromozomiale conin secvenecaracteristice unui cromozom

Etapele obinerii

bibliotecii genomice

Izolarea ADN genomic

Restricia ADN genomic

i vectorial

Ligarea ADN vectorial cu

fragmente ADN genomic

Introducerea moleculelor

recombinate n gazd

Selecia clonelor

Etapele obinerii bibliotecii ADNcEtapele obinerii bibliotecii ADNc

Izolarea ARNm

Sinteza ADNc

Ligarea linkerilor

la capetele ADNc

Restricia ADNc ia vectorului

Selecia clonelor

Ligarea ADNc -

vector

Transformarea

gazdei potrivite

ADN_recombinant

Documents

Transcript of ADN_recombinant