10.12.2014

1

ADN

Secveniere

PCR

Southern-blot

Hibridarea in situ

ARN

Northern-blot

RT-PCR

Hibridarea in situ

Proteine

Western-blot

Secveniere

Analiza histochimic

Analiza funciei

Utilizarea tehnicilor de analiz a acizilor nucleici

Analiza ADN:

depistarea mutaiilor genice diagnostic precis al bolilor genetice (prenatal, postnatal precoce);

identificarea polimorfismului individual dactiloscopie genomic (analiza filiaiei);

depistarea ADN strin (bacterian, viral) diagnosticul bolilor infecioase i gradului de infectare.

Analiza ARNm:

analiza expresiei genice esut-specific;

evaluarea gradului de expresie a genei normale / patologice;

Depistarea ARN strin (viral) diagnosticul bolilor infecioase i gradului de infectare.

10.12.2014

2

Izolarea acizilor nucleici

ADNColectarea materialului biologic

(celule nucleate din orice esut)

Izolarea nucleilor (opional)

prin lezarea celulelor n soluii hipotonice

Lezarea celulelor (nucleilor)

prin aciunea detergenilor

Deproteinizarea:

prin aciunea proteazelor, urmat de prelucrarea cu solveni organici (fenol, cloroform)

Precipitarea acizilor nucleici

n prezena alcoolilor i a srurilor (70% etanol)

Colectarea materialului biologic

din esutul de interes la stadia de interes

Lezarea celulelor

n prezena detergenilor i a inhibitorilor de ARN-aze

Deproteinizarea

cu utilizarea solvenilor organici

Precipitarea selectiv a ARN

n prezena srurilor (LiCl, CH3COONa)

Precipitarea ARN

n prezena alcoolului.

Izolarea acizilor nucleici

ARN

ADN recombinantADN recombinant

molecul de ADN obinut din segmente de origine

diferit, capabil s funcioneze

10.12.2014

3

Scopul tehnologiei ADN rec

multiplicare;

izolare i formare a bibliotecilor de ADNrec;

analiz molecular.

Clonarea genei/secvenei de interes cu scop de:

analiz a funciei genei clonate;

obinerea produsului proteic.

Expresia genic cu scop de:

Etapele obinerii ADN recombinant

Selecia celulelor transformate prin tratare cu antibiotice i utiliznd marchereiradioactivi sau fluoresceni

Expresia genei de interes prin sinteza proteinei

Clonarea genei de interes prin replicarea vectorului

Introducerea ADN recombinant ntr-o gazd de clonare transformare

Ligarea fragmentului de ADN de interes cu vectorul de clonare obinerea ADN recombinant

Clivare enzimatic a ADN de cercetat i vectorului de clonare

Izolarea ADN de cercetat i a vectorilor de clonare

Etape necesare pentru manipularea

ACIZILOR NUCLEICI

- Cum se izoleaz ADN sau ARN dintr-o celul?- Cum se obin fragmente de ADN de cercetat?

- FR (ER, SR, RFLPs, hri de restricie)- ADNc (ADN complimentar unei mol. ARNm);

- Cum se separ fragmentele de AN i cum se apreciaz lungimea comparare a ADN la diferite persoane (electroforeza AN)?;

- Cum se vizualizeaz ADN, avnd dimensiuni submicroscopice?

- Principiile clonrii ADN in vivo (vectori de clonare, gazde de clonare) i clonrii ADN in vitro;

- Denaturarea ADN in vitro

- Hibridizarea mol. ADN (ADN/ADN; ADN/ARN)

10.12.2014

4

Componentele necesare pentru

tehnologia AND rec = clonarea ADN in vivo:

ADN de clonat (de cercetat): FR, ADNc

Vector de clonare

Enzime de restricie = restrictaze

Gazd de clonare compatibil cu vectorul

Sistem de selecie a clonelor analizate

Set de enzime pentru manipularea ADN

Vectorul Dimensiunile fragmentului

inserat

Gazda de

clonare

Plasmide Pn la 10 kb (ADN genomic, ADNc)

Bacterii,

Drojdii

Bacteriofagi Pn la 25 kb (ADN genomic, ADNc)

Bacterii

Cosmide 30-45 kb (ADN genomic) Bacterii

BAC (Cromozom artificial

al bacteriilor)

Pn la 300 kb (ADN genomic)

Bacterii

YAC (Cromozom artificial

al drojdiilor)

0,2-2.0 Mb (ADN genomic) Drojdii

Dimensiunile inseriilor clonate n diferii vectori

Vectorul:-se replic autonom n celula gazd (conine punct ori)-are capacitate s insereze i s transfere ADN strin (conine situsuri de restricie)-conine gene de rezisten la antibiotice (capacitate de a fi selectate)

10.12.2014

5

Celula bacterian

Vector plasmidicCromozom artificial

al drojdiilor (YAC)

Ligarea inseriilor n vector

10.12.2014

6

Obinerea FR fragmentelor de restricie prin aciunea specific a ER (enzimelor de restricie)

Situsuri recunoscute de enzime de restricie

10.12.2014

7

RFLPs polimorfismul FR la dou persoane X i Z

ER edonucleaz situs specific de origine

bacterian care recunoate un SR i cliveaz ADN bicatenar

SR secven palindromic de nucleotide,

recunoscut i clivat de enzimele de restricie

FR fragment ADN bicatenar obinut prin clivare

cu ajutorul restrictazelor

RFLPs Polimorfismul Lungimii Fragmentelor de

Restricie, ce identific diferenele individuale ale moleculelor de ADN

Hri de restricie

dispunerea relativ a situsurilor de restricie ntr-o molecul de ADN

M

-

+

10 kb

8 kb

6 kb

4 kb

2 kb

12 kb

10 kb

6 kb

5 kb

2,5 kb

2,5 kb

10 kb

6 kb

5 kb

10.12.2014

8

Vizualizarea ADN

Colorarea specific Vizualizare cu sonde marcate

Fuxn bazic(in situ)

Bromur de etidiu

(n geluri)

Fluorescente

(reci)

Radioactive

(calde)

Sunt necesare

cantiti mari de ADN

Este necesar de tiut

structura secvenei

ADN de cercetat

10.12.2014

9

Clonarea in vivo, ntr-o cel bactrerian, a unei gene umane

Probleme: Genele umane sunt mari; Conin secvene reglatoare

diferite de cele a bacteriilor; Conin introni ce nu pot fi

nlturai ce celulabacterian.

Soluie:Obinerea unui ADNc pe baza ARNm caracteristic genei

int

Etapele obinerii ADNc (ADN complementar)

Sinteza ADN bicatenar(ADN-polimeraza)

Hidroliza ARN(ARN-aza H)

Sinteza ADNc cu ajutorul revertazei(ARN-polimeraz-ADN-dependent)

Hibridarea poli(A) cu oligo(dT)

Izolarea ARN poli(A)+

Rolul practic al tehnicilor de analiz a acizilor nucleici:

Cercetare secvenierea ADN, formarea bibliotecilor de gene, studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de reglare, studiul consecinelor mutaiilor.

Depistarea persoanelor purttoare de mutaii - prenatal sau postnatal, cu scop de prevenire a naterii copiilor cu anomalii genetice sau manifestrii unor patologii severe.

Terapie genic (alegerea genei int, construirea vectorilor de gene etc.).

Depistarea ADN strin (viral sau bacterian) n diagnosticul bolilor infecioase.

Identificarea polimorfismelor individuale n analiza filiaiei, n criminalistic.

10.12.2014

10

Molecule ADN

ClonareADN

Clonare in vivo

Clonare in vitro (PCR)

Analizmolecular

Hibridare molecular

Clonarea ADN= multiplicarea unei mol ADN prin replicare repetat

in vivo

Tehnologia ADN recombinat

Utilizarea celulei gazd de clonare

Replicarea ntr-un vector de clonare cu utilizarea aparatului de replicare a celulei gazd

Cu posibilitatea obinerii produsului proteic

in vitro

Tehnica PCR

Este realizat n eprubet

Replicarea unei secvene de interes cu ajutorul unui aparat de replicare artificial

Clonarea in vitro PCR

(reacia ciclic de polimerizare a noilor copii de ADN)

10.12.2014

11

Componentele necesare pentru

clonarea in vitro (PCR):- ADN de cercetat

- Primeri specifici secvenei de clonat complimentari secvenelor flancante

- Taq-polimeraza ADN-polimeraz termostabil

- Dezoxinucleozidtrifosfai (dNTP)

- Instalaie de modificare ciclic a temperaturii:- t de denaturare ADN- t de renaturare (ADN+primer)- t de polimerizare (elongarea catenelor

noi de ADN)

Etapele tehnicii PCR

Denaturarea ADN la 96oC

A. Pregtirea amestecului cu toate componentele reactante

Rcirea pn la temperatura de renaturare a primerilor

Elongarea catenelor ADN la 72oC

B. Repetarea automat a procedurelor de denaturare-renaturare-elongare de 30-35 ori

C. Analiza produilor PCR- electroforeza

- colorarea

- interpretarea rezultatelor

10.12.2014

12

Biblioteci de gene

Biblioteci genomice conin secvene de ADN genomic, obinut prin digestie enzimatic

Biblioteci ADNc conin secvene de ADNc, obinute n baza setului de ARNm

Biblioteci cromozomiale conin secvene caracteristice unui cromozom

Etapele obinerii

bibliotecii genomice

Izolarea ADN genomic

Restricia ADN genomic

i vectorial

Ligarea ADN vectorial cu

fragmente ADN genomic

Introducerea moleculelor

recombinate n gazd

Selecia clonelor

10.12.2014

13

Etapele obinerii bibliotecii ADNc

Izolarea ARNm

Sinteza ADNc

Ligarea linkerilor

la capetele ADNc

Restricia ADNc i

a vectorului

Selecia clonelor

Ligarea ADNc -

vector

Transformarea

gazdei potrivite