1

Tehnologia ADN-ului recombinant

I. Noţiuni generaleIzolarea unei gene oferă posibilitatea determinării secventei nucleotidice. Transformând secvenţele de ADN

ale unei gene în secvenţe de aminoacizi prin folosirea codului genetic duce la o determinare directă a

structurii proteinei codificate de respectiva genă şi, implicit funcţia respectivei gene poate fi modificată.

Funcţia poate fi, de asemenea, studiată prin modificarea directă a unui fragment a secvenţei de ADN urmată

de reintroducerea respectivei gene în genomul de provenienţă. Mai mult, o genă poate fi transferată de la un

organism la altul.

Un organism conţinând o genă străină se numeşte transgenic. Organismele transgenice pot fi folosite fie în

cercetare, fie cu aplicaţii comerciale. Una din aceste aplicaţii este aceea de a realiza produşi genici umani,

cum ar fi insulina în bacterii transgenice purtătoare a respectivei gene umane.

ADN recombinant se realizează prin inserarea unui ADN străin într-o moleculă replicativă (cum este

plasmidul bacterian), care mai apoi va amplifica acel fragment şi vor rezulta molecule clone a ADN-

ului inserat.

Enzimele de restricţie fragmentează ADN-ul în locusuri ţintă rezultând fragmente predefinite, cu

„capetele lipicioase” (sticky ends) potrivite pentru inserţia unui vector care a fost fragmentat de

aceeaşi enzimă.

După ce o genă a fost clonată, secvenţa de nucleotide poate fi determinată şi folosită pentru studiul

funcţiei şi evoluţiei respectivei gene.

Tehnologia ADN-ului recombinant este folosită pentru a produce microbi, plante sau animale care

transportă gene de la o altă specie. Mai poate fi folosită în diagnosticul prenatal al bolilor genetice

umane.

II. TehnicaOrganismul studiat care va fi folosit în donarea de ADN pentru analiză se numeşte organism donor.

Procedura de bază este de extragere şi fragmentare a ADN-ului din genomul donor în fragmente conţinând

una sau mai multe gene şi de a permite acestor fragmente să se insereze individual în mici molecule de

ADN replicative autonom cum ar fi plasmidele bacteriene. Aceste molecule vector impreuna cu inserţiile lor

se numesc ADN recombinant deoarece conţin combinaţii noi de ADN de la genomul donor cu ADN-ul vector

dintr-o sursă complet diferită (în general plasmide bacteriene sau virus). Bacteriile sunt însămânţate pentru a

creşte în colonii ce conţin o populaţie foarte mare de fragmente identice ale inserţiei ADN, iar această

populaţie se numeşte populaţie de clone ADN. Ulterior, este în general de dorit să se introducă ADN-ul

clonat în celulele organismului donor original pentru a realiza manipularea structurii şi funcţiei genomului.

Etapele tehnicii:1. Izolarea ADN-uluiPrimul pas în producerea ADN-ului recombinant este de a izola donorul şi vectorul ADN. Procedura folosită

pentru obţinerea vectorului de ADN depinde de natura vectorului. Plasmidele bacteriene sunt frecvent

utilizate ca vectori, dar aceste plasmide trebuie purificate de ADN-ul genomic bacterian.

2. Fragmentarea ADNDescoperirea enzimelor de restricţie a făcut posibilă tehnologia ADN-ului recombinant. Enzimele de

restricţie sunt produse de către bacterii ca un mecanism de apărare împotriva bacteriofagilor. Enzimele

2

acţionează ca si „foarfeci moleculari” tăind ADN-ul fagilor şi astfel inactivându-l. Este important că enzimele

de restricţie nu fragmentează aleator, ci ele fragmentează la nivelul unor secvenţe ADN ţintă aceasta fiind

una dintre caracteristicile cheie care le face utile manipulării ADN-ului. Spre exemplu, enzima de restricţie

EcoRI de la Escherichia coli, recunoaşte următoarea secvenţă de 6 perechi de nucleotide din ADN-ul

oricărui organism.

Acest tip de segment se numeşte ADN palindromic ceea ce înseamnă că ambele catene au aceeaşi

secvenţă de nucleotide cu orientare antiparalelă. Enzima EcoRI taie în cadrul acestei secvenţe, dar sub

forma unor tăieturi în zig-zag între nucleotidele G şi A.

În urma fragmentării în zig-zag, rămâne o pereche de capete “lipicioase” monocatenare identice (sticky

ends). Aceste capete se numesc lipicioase pentru că pot crea legături de hidrogen cu secvenţele

complementare.

3. Legarea fragmentelor de ADN

Atât ADN-ul donor cât şi cel vector sunt denaturate prin utilizarea enzimei de restricţie care produce capete

lipicioase şi apoi amestecate într-un tub test, permiţând astfel capetelor lipicioase ale ADN-ului vector şi ale

ADN-ului donor să se lege şi să formeze molecule recombinante.

4. Amplificarea ADN-ului recombinant

După ce vectorul pătrunde în celula gazdă este capabil de replicare, deoarece plasmidele posedă în mod

normal o origine replicativă. Totuşi, acum că ADN-ul donor inserat este o parte a plasmidei, ADN-ul donor se

replică automat împreună cu vectorul. Astfel, vor avea loc numeroase cicluri de diviziune celulară şi vectorii

recombinanţi vor trece prin mai multe runde de replicare. Coloniile bacteriene rezultate vor conţine miliarde

de copii ale ADN-ului donor unic inserat. Aceste copii amplificate ale fragmentului de ADN donor reprezintă

clonele de ADN.

III. Aplicaţii ale tehnologieiGenele clonate pot fi transferate într-un alt organism gazdă pentru a crea microbi, plante sau animale

transgenice ce nu ar putea fi niciodată produse prin utilizarea procedurilor standard. Aceste tehnici îşi

găsesc o largă utilizare în cercetarea de bază şi permit aplicaţii largi în cultivarea plantelor, creşterea

animalelor, în microbiologia industrială şi medicină.

Actualmente, multe proteine cum ar fi insulina umană, hormonul de creştere uman şi o varitate largă de

produse farmaceutice sunt produse în masă de către bacterii sau fungi manipulaţi genetic.

Una dintre aplicatiile cele mai controversate ale tehnologiei transgenice este terapia genică umană.

Tratamentul bolilor genetice umane prin introducerea unor tipuri sălbatice exogene pentru a corecta

deficienţa de funcţie apărută în urma mutaţiilor, defineste terapia genica. Terapia genică include: terapia

germinală şi terapia somatică.

Scopul terapiei germinale este de a introduce celule transgenice în linia germinală. Această terapie nu va

obţine doar o vindecare a persoanei tratate ci va purta şi genotipul corectat în generaţiile următoare.

Protocolul include extragerea unui embrion timpuriu (în stadiul de blastocist) cu genotipul mutant şi

3

injectarea cu celule transgenice conţinând tipul normal, sălbatic, iar mai apoi reimplantarea embrionului în

uter. Totuşi, până în prezent terapia genică germinală nu a fost utilizată la oameni.

Terapia genică somatică încearcă corectarea unui fenotip bolnav prin tratarea unor celule somatice ale

persoanei afectate. Metoda se adresează bolilor al căror fenotip este cauzat de gene exprimate predominant

într-un anumit ţesut. Metoda se realizează prin scoaterea unor celule de la un pacient cu genotip defectiv şi

transformarea lor în celule transgenice prin introducerea unor copii ale tipul sălbatic clonat. Celulele

transgenice sunt apoi reintroduse în corpul pacientului, unde vor realiza o funcţie normală a genei

respective.

Alte aplicatii. Terapia somatică aplicată în neoplasmele maligne include introducerea unor gene cu funcţii

anticanceroase în celulele tumorale (gene supresoare), transferul de „gene suicid” (gena toxinei difterice),

alterarea celulelor tumorale astfel ca acestea sa devină mai imunogenice, alterarea celulelor stem normale,

ca acestea să devină rezistente la efectele toxice ale chimioterapiei. S-au mai încercat aplicaţii în boli

infecţioase cronice, cum este SIDA: imunizarea intracelulară (celulele devine rezistente la infecţie) şi

inducerea unui răspuns imun mai eficient. Chiar şi boala Parkinson ar putea fi tratată prin injectarea de

fibroblaste modificate genetic ce ar secreta dopamină la nivelul creierului.

Concluzii. Tehnologia ADN-ului recombinant a permis ca gene individuale să fie izolate în laborator şi apoi

caracterizate la nivel molecular. Tehnologia se bazează pe enzimele de restricţie, ce fragmentează ADN-ul

în porţiuni bine definite. Fragmentele restricţionate au capete lipicioase, permiţându-le să fie inserate într-un

vector capabil de replicare într-o bacterie. Astfel de hibrizi moleculari sunt cunoscuţi sub denumirea de ADN

recombinant. Bacteria amplifică o singură moleculă de ADN recombinant pentru a forma clone ADN.

Organismele transgenice, modificate prin inserţia unui ADN exogen specific, şi-au găsit un loc central în

biotehnologie deoarece permit modificări specifice ale genomului. Terapia genică umană este o aplicaţie

specială a tehnologiei transgenice: terapia germinală tinde să incorporeze celule transgenice în linia

germinală astfel ca acestea să fie transmise descendenţilor, iar terapia somatică introduce în ţesuturi celule

modificate genetic.