4. LIMFOCITELE Limfocitele sunt celule cu rol esenial n cadrul sistemului imun, fiind implicate n imunitatea adaptativ (specific), cu roluri importante att n rspunsul imun celular ct i n cel umoral. Limfocitele sunt singurele celule care prezint toate trsturile caracteristice sistemului imun adaptativ: diversitate specificitate memorie imunologic recunoatere self / nonself. Majoritatea limfocitelor secret diverse molecule proteice numite citokine, care sunt hormoni cu rol imunomodulator. Au fost descrise i limfocite care aparin sistemului imun nnscut - celulele natural killer. Toate celelalte celule ale sistemului imunitar au roluri accesorii n imunitatea adaptativ (capteaz i prelucreaz antigenul, activeaz limfocitele, secret diverse molecule cu rol imunoefector, etc.). Din punct de vedere histologic, limfocitele fac parte din esutul limfoid. Sistemul imun este format din organe i esuturi distribuite n diverse regiuni ale corpului. Exist: organe limfoide primare - n care se formeaz i se matureaz limfocitele. organe limfoide secundare - organele care capteaz antigenul i unde exist un mediu favorabil interaciunii ntre limfocite i antigene. Organele limfoide primare sunt mduva hematogen i timusul. Mduva hematogen este sursa tuturor limfocitelor care populeaz esuturile limfoide. Organele limfoide secundare sunt: Splina Ganglionii limfatici esutul limfoid asociat mucoaselor MALT (mucous associated lymphoid tissue) esutul limfoid de la nivel cutanat SALT (skin associated lymphoid tissue). Limfocitele reprezint 20-40% din totalul leucocitelor din snge, sau n cifre absolute ntre 1500-3000/mmc, n medie 2500/mmc. La nivelul limfei, aproximativ 99% dintre celule sunt limfocite. Limfocitele au capacitatea de a migra n esuturi i organele limfoide. LIMFOCITE IMPLCATE N IMUNITATEA ADAPTATIV Limfocitele apar la microscopul optic, pe frotiul colorat policromatic (Giemsa sau Wright), cu dou morfologii: limfocite mici i mari. Limfocitele mari, numite i large granular lymphocytes sau LGL, reprezint aproximativ 5-10 % din totalul limfocitelor. Din aceast clas cele mai importante sunt celulele NK (natural killer), cu rol n imunitatea nnscut (nespecific), ndreptat contra celulelor infectate viral i tumorale. Limfocitele implicate n imunitatea specific (adaptativ) sunt cele mici. Aceast categorie cuprinde limfocitele T (LT) i limfocitele B (LB). Exist unele tipuri de LB i LT care aparin sistemului imun nnscut (limfocitele B-1 i limfocitele T ). 1

Limfocitele T sau B care nu au venit n contact cu antigenul se numesc naive. Limfocitele naive sunt celule aflate n faza G0 a ciclului celular i prezint urmtoarele caracteristici: Au diametrul de 6-7 microni. Au un nucleu ovoid sau reniform, care ocup 90% din suprafaa celulei i prezint cromatin nuclear dens. Perinuclear apare un inel de citoplasm colorat albastru deschis. Citoplasma conine puine organite celulare i 5-15 granulaii azurofile. Reticulul endoplasmic este slab dezvoltat. Interaciunea cu antigenul determin activarea limfocitelor naive, cu intrarea n ciclul celular prin progresia ctre faza G1 i apoi S, G2 i M. Pe msur ce avanseaz n ciclul celular, diametrul se dubleaz (14 - 15 microni) i se transform n limfoblati. Limfoblatii sunt celule metabolic active, cu organite dezvoltate. Raportul ntre citoplasm i nucleu este modificat n favoarea citoplasmei. Limfoblatii prolifereaz i n final se difereniaz n celule efectoare sau n celule de memorie. Celulele efectoare contribuie la eliminarea antigenului: Plasmocitele sunt celulele rezultate prin diferenierea i maturarea limfocitelor B. Plasmocitele sintetizeaz anticorpi. Au un reticulul endoplasmic abundent, care faciliteaz rata nalt de sinteze proteice, i un aparat Golgi bine reprezentat. Celulele efectoare de pe linia T includ limfocitele T helper (LTH) care secret citokine i limfocitele T citotoxice (LTC). Celulele efectoare au o durat de via relativ redus (zile sptmni). Unii dintre limfoblatii B i T se transform n celule de memorie. Acestea sunt responsabile de imunitatea pe termen lung fa patogenul respectiv. Limfocitele de memorie sunt similare morfologic cu limfocitele inactive, de care se deosebesc prin prezena sau absena anumitor receptori membranari. Limfocitele mici se mpart funcional n LB i LT. Aceste dou tipuri de limfocite nu se pot diferenia morfologic, prin microscopie optic, ci funcional, prin testele de rozetare: Dac se pun n contact limfocitele cu hematii de oaie sau berbec, numai LT se leag de aceste hematii, adic rozeteaz. La microscop se vizualizeaz mici conglomerate celulare formate dintr-un LT central nconjurat de o coroan de hematii de oaie, care se numesc rozete E. Dac se pun n contact limfocitele cu hematii de oarece, numai LB se leag de aceste hematii, producndu-se rozete M. Diferitele linii limfocitare pot fi difereniate pe baza existenei pe suprafaa membranei a unor receptori specifici. Aceti receptori pot recunoscui de anticorpi monoclonali specifici. Toi anticorpii care reacioneaz cu o anumit molecul de membran formeaz un grup numit cluster of differentiation (CD). Pn acum au fost descoperii aproximativ 200 de receptori, care sunt folosii pentru caracterizarea fenotipic a diferitelor limfocite.

2

LIMFOCITELE T Limfocitele T (LT) reprezint funcional o populaie celular heterogen. Au fost numite limfocite T pentru c se matureaz n timus. Clasele de LT seamn morfologic i toate rozeteaz cu hematiile de oaie. Ele se difereniaz numai prin receptorii sau markerii de suprafa, care se evideniaz cu anticorpi monoclonali. LT sunt produse n mduva hematogen i se matureaz n timus. Timusul stimuleaz dezvoltarea doar a limfocitelor care au pe membran receptori care recunosc structuri non-self, iar restul sunt eliminate. Selecia realizat de timus este foarte riguroas - aproximativ 95% din totalul limfocitelor care au migrat din maduv sunt distruse prin apoptoz. Timusul elibereaz limfocite T mature, dar care nu au venit nc n contact cu antigenul (limfocite naive). LT naive sunt transportate de ctre circulaia sangvin la organele limfoide periferice. La acest nivel exist venule al cror perete prezint o structur special (HEV - high endothelial venules), care permite trecerea LT. Astfel, LT naive migreaz n circulaia limfatic, prin intermediul creia ajung din nou n cea sangvin. Astfel se realizeaz un circuit prin care LT sunt intens recirculate, pentru a crete probabilitatea ntlnirii cu antigenul specific. Limfocitele T naive au o durat de via de civa ani. Sunt celule inactive, cu cromatin condensat, citoplasm redus i activitate metabolic sczut. O caracteristic definitorie pentru cele mai multe LT este faptul c nu pot recunoate antigene libere, n stare nativ. LT recunosc doar antigene prezentate de diverse celule ale sistemului imun. Aceste celule prezint antigene cu ajutorul unor structuri specializate aflate pe membran, numite molecule ale complexului major de histocompatibilitate (major histocompatibility complex - MHC). Din punct de vedere funcional, limfocitele T se mpart n: Limfocite T citotoxice (LTC) - au pe suprafa receptorul specific CD8. Recunosc peptidele antigenice rezultate din degradarea agenilor patogeni intracelulari, peptide care sunt prezentate ctre LT citotoxice mpreun cu moleculele complexului major de histocompatibilitate de tip I (MHC I). Rolul acestor limfocite este de a distruge celulele int infectate. Limfocitele T helper (LTH) - prezint pe suprafa receptori CD4. Pot s recunoasc peptide antigenice care rezult n urma prelucrrii agenilor patogeni extracelulari, peptide prezentate mpreun cu molecule MHC II. Limfocitele T supresoare - reprezint o subpopulaie de limfocite T a crei existen este controversat. Aceste limfocite au efecte inhibitorii n cadrul rspunsului imun. Izolarea i clonarea limfocitelor T supresoare este un subiect de disput. Nu s-a ajuns n prezent la un consens, dac aceste limfocite constituie o subpopulaie separat a limfocitelor T. Receptorii de suprafa ai LT mature Receptorii de suprafa ai limfocitelor T sunt: Receptorii de recunoatere a epitopului - reprezint principala cale de activare a LT. Receptorul pentru antigen al limfocitelor T este denumit TCR (T -cell receptor). TCR este cuplat pe membran cu receptorul CD3, cu care formeaz un complex funcional. 3

Complexul TCR-CD3 recunoate epitopul i este prezent pe toate subtipurile de LT. CD4 i CD8 sunt coreceptori care recunosc moleculele MHC aezate pe celele prezentatoare de antigen (APC) sau pe celulele somatice. Receptori cu rol accesor n activarea LT. Receptorii cu rol n adeziunea intercelular permit LT s adere intim de alte celule. Receptorii cu rol n recunoaterea epitopului Un limfocit prezint pe membran un numr de aproximativ 105 TCR. Receptorul pentru antigen al LT face parte din superfamilia imunoglobulinelor. TCR este asociat pe membran cu receptorul CD3, care are rolul de a transmite semnale de activare n interiorul celulei. Fiecare receptor TCR este format din 2 lanuri proteice i . Fiecare dintre lanuri are un segment intracitoplasmatic foarte scurt (5 - 12 aminoacizi situai la captul C - terminal al lanului), un segment transmembranar (21 - 22 aminoacizi), i cte dou domenii extracelulare (60 - 75 aminoacizi). Lanurile sunt aezate fa n fa: Domeniile dinspre exterior sunt variabile i se noteaz cu V. Domeniile situate proximal de membran sunt constante i se noteaz cu C. Fiecare domeniu variabil are, la rndul su, trei regiuni hipervariabile (similare regiunilor determinante ale complementaritii ale imunoglobulinelor - CDR). Lanul prezint n plus nc o regiune hipervariabil, care ns nu este implicat n recunoaterea antigenului. Cele dou domenii variabile se asociaz i formeaz o cavitate numit situsul de recunoatere pentru antigen, sau paratop, asemntor cu paratopul imunoglobulinelor. Genele care codific domeniile variabile ale TCR seamn structural cu genele domeniilor variabile ale imunoglobulinelor, iar variabililitatea este de asemenea obinut prin procese de recombinare genic. Situsurile de recunoatere nu se leag de molecula de antigen pe toat lungimea. Contactele sunt punctiforme, prin 6 secvene scurte de aminoacizi la nivelul regiunilor hipervariabile (CDR): CDR1 i CDR2 se leag cu domeniile polimorfe ale MHC (1 + 2 ale MHC I i 1 + 1 n cazul MHC II). CDR3 se leaga de epitop, avnd structuri complementare. Regiunea dintre buclele constante C i inseria pe membrana limfocitar a lanurilor TCR se numete zona balama a TCR. Ea d mobilitatea TCR, foarte important pentru contactul lor cu moleculele MHC. Recunoaterea epitopului de ctre LT are cteva caracteristici generale: TCR recunosc un epitop ca non-self dup structura liniar sau primar. TCR nu pot recunoate antigenele native, ci numai fragmentele peptidice prelucrate de celulele APC. TCR recunosc epitopii numai dac acetia sunt prezentai n complex cu moleculele prezentatoare MHC, de pe membranele APC sau a celulelor somatice (fenomen de restricie MHC). Funciile receptorilor TCR sunt: TCR recunosc antigenul. TCR declaneaz stimulii activatori pentru LT. TCR nu poate s transmit singur semnalul activator pentru c TCR are un segment intracitoplasmatic foarte scurt, iar enzimele care activeaz LT sunt aezate

4

profund n citoplasma LT. De aceea transducia semnalului se face prin intermediul receptorului CD3. CD3 este un receptor membranar cu structur complex, aezat lng receptorul TCR. CD3 este o molecul accesorie, cu rol de transmitere intracelular a semnalelor activatoare determinate de interaciunea TCR - antigen. Coreceptorii CD4 i CD8 n funcie de prezena pe suprafaa membranei a coreceptorilor CD4 sau CD8, limfocitele T se mpart n: LT CD4 - majoritatea limfocitelor care prezint pe suprafa CD 4 are funcia de LT helper. LT CD 4 pot recunoate doar antigenul care este prezentat mpreun cu molecule MHC II. LT CD8 - cele mai multe limfocite care au pe suprafa acest coreceptor funcioneaz ca LT citotoxice. LT CD8 recunosc peptide antigenice prezentate mpreun cu MHC I. CD4 este un monomer glicoproteic cu o greutate molecular de aproximativ 55 kDa. Segmentul extracelular prezint 4 domenii, iar segmentul intracelular este lung i bogat n resturi de serin. Prin bucla exterioar N-terminal, CD4 se leag de domeniul monomorf al MHC II, care este domeniul alfa2. Segmentul intracitoplasmatic particip la activarea metabolic a LTH, prin activarea unor enzime intracelulare. CD4 este i receptorul de care se ataeaz virusul HIV. CD 8 este un coreceptor dimeric format din dou lanuri: / sau /. Fiecare lan prezint un segment extracelular, transmembranar i intracitoplasmatic. Cele dou segmente extracelulare au cte un domeniu. Cele dou domenii se asociaz i au un aspect immunoglobulin-like. Ele particip la cooperarea dintre LTC i APC. n timpul cooperrii, segmentul extracelular al CD8 se leag de domeniul monomorf al MHC I, care este alfa3. Segmentul intracitoplasmatic al CD8 este foarte lung. El particip la activarea metabolic a LTC prin activarea unor enzime intracelulare. Receptorii cu rol accesor Pe suprafaa limfocitului T exist molecule care contribuie suplimentar la activarea acestuia, prin intreaciunea cu liganzi corespunztori de pe suprafaa APC sau celulelor int: CD28 i CD45. O parte dintre aceti receptori au rol i n transmiterea intracelular a semnalului activator. Receptorii de adeziune intercelular Aceti receptori permit stabilirea de contacte ntre LT i APC sau celulele somatice i permit cooperarea dintre ele. Principalii receptori implicai n aderarea LT sunt: LFA1, CD2, VLA. LFA1 sau antigenul asociat funciei limfocitare face parte din familia integrinelor. Integrinele sunt receptori celulari care permit aderarea de endoteliu, de proteinele matricei extracelulare i de alte celule (APC, celulele int). Receptorii VLA fac parte din familia integrinelor. Moleculele VLA1 i 2 sunt caracteristice pentru LT. VLA sunt molecule de adeziune la endoteliu (VLA4) i la proteinele din matricea extracelular. Ele dau LT posibilitatea s se deplaseze prin esuturi i s se concentreze intratisular n zona unde se gsesc antigenele. 5

Receptorul CD2 se mai numete LFA2. CD2 face parte din superfamilia imunoglobulinelor i se gsete pe membrana tuturor LT i pe NK. Moleculele de adeziune au o serie de funcii eseniale pentru rspunsul imun: Prin aceste molecule LT stabilesc permanent contacte cu APC sau cu celulele somatice pe care le controleaz dac prezint sau nu antigene. Contactele sunt antigenindependente, adic se fac indiferent dac APC sau celula somatic prezint sau nu antigene pe suprafa. Cuplurile de adeziune LFA1-ICAM1 i CD2-LFA3 au rol n aceast etap iniial a recunoaterii antigenice. Receptorii de adeziune nu particip direct la recunoaterea epitopilor, dar au un rol esenial n recunoatere pentru c realizeaz un contact intim ntre LT i APC. Contactul se face pe suprafee mari de membran i dureaz mult, favoriznd contactul moleculelor MHC i TCR, care sunt aezate n locuri diferite pe membrane i pentru a se ntlni fac micri de difuzie lateral. Cuplurile de adeziune se desfac dup recunoaterea antigenelor, sau dac celula APC sau somatic nu prezint antigene. n acest fel LT i continu circuitul prin organism, adic se face recircularea LT. Receptorul CD2 are rol i n activarea metabolic a LT. Rolul activator al CD2 este indispensabil mai ales cnd concentraia de epitopi prezentai spre TCR este sczut, astfel c numai recunoaterea epitopilor de ctre TCR-CD3 nu este suficient pentru activarea LT. LIMFOCITELE B Denumirea de limfocite B provine de la bursa lui Fabricius, un organ al psrilor, unde au fost descoperite prima dat i care reprezint locul unde se matureaz. Aceast denumire a fost meninut, deoarece mduva hematogen este organul unde se matureaz la oameni (bone marrow). LB reprezint 15-30% din totalul limfocitelor mici circulante. Ele au o serie de caractere generale: LB au durata de via scurt, de cteva sptmni. LB sunt celule puin recirculante, sunt cantonate n ariile burso-dependente din organele limfoide secundare - ganglionii limfatici i splin. Limfocitele B mature se disting fa de alte limfocite prin sinteza i prezena pe membran de monomeri de imunoglobuline (anticorp). Acestea intr n structura receptorului pentru antigen al limfocitelor B (B-cell receptor - BCR). Fiecare limfocit B prezint aproximativ 1,5 X 105 molecule de BCR pe membran. Structura BCR BCR este format din: monomeri de imunoglobuline heterodimerul Ig/Ig Imunoglobulinele care intr n structura BCR au fost denumite mIg (membrane bound immunoglobulin). Moleculele de mIg au aceeai specificitate pentru antigen ca i imunoglobulinele care vor rezulta n urma activrii limfocitului B pe membrana cruia se afl i transformrii acestuia n plasmocit. Structura anticorpilor solubili i cea a anticorpilor aflai pe membrana limfocitelor B este similar, cu excepia unei mici poriuni de la nivelul captului C - terminal. 6

Toate toate clasele de imunoglobuline pot avea rol de mIg, dar cel cel mai important rol l au mIgM i mIgD. Recunoaterea antigenelor de ctre LB are unele caractere: LB recunosc epitopii dupa structura lor conformaional, spaial sau tridimensional. LB recunosc antigene solubile native, adic neprelucrate de celulele prezentatoare de antigen. Nu este necesar prezentarea antigenelor pe moleculele MHC. PLASMOCITELE Plasmocitele apar prin activarea LB i diferenierea lor terminal n urma stimulrii antigenice i de ctre LTH. Procesul de difereniere implic modificri morfologice i imunofenotipice. LB trec prin stadiile succesive de: imunoblast B, plasmoblast, preplasmocit i plasmocit. Pe parcurs celulele pierd antigenele LB de repaus i de activare. Apar noi markeri de suprafa, de exemplu CD38 i CD71 cu rol n proliferare. Diferenele morfologice i structurale ale plasmocitelor fa de LB exprim funcia lor de sintez i de secreie a imunoglobulinelor, care asigur RIU. Caracterele morfologice sunt: Au form oval i diametrul ntre 7 i 25 de microni. Nucleul este sferoidal, cu zone dense de heterocromatin orientat n spie de roat . Citoplasma este abundent i intens bazofil, datorit coninutului mare de ARN. Citoplasma conine reticul endoplasmic rugos abundent, cu muli ribozomi. CELULELE NATURAL KILLER (NK) Celulele natural killer se gsesc n timus i n organele limfoide periferice. Receptorul pentru antigen (NK-R) este un heterodimer, format dintr-un lan invariabil , care poate fi cuplat cu 3 tipuri diferite de lanuri . Celulele natural killer recunosc antigene glicolipidice. Celulele NK pot recunoate antigen i prin intermediul altor receptori: receptori de tip lectinic FcR (recunoatere mediat de anticorpi) Celulele NK au urmtoarele caractere: Au diametrul de 10-15 microni. Au mai mult citoplasm, care conine granulaii dense.

NK au rol n imunitatea nnscut sau nespecific. Intervin n primele momente ale unei infecii virale i elimin o parte dintre celulele self infectate. n acest mod se ofer organismului rgazul pentru proliferarea clonelor de LB i LT antigen-specifice, care vor eradica infecia. De asemenea, celulele NK recunosc i distrug celulele tumorale. i aceast recunoatere este imunologic nespecific. Celulele natural killer au capacitatea de a sintetiza citokine care moduleaz rspunsul imun, cele mai importante fiind: interferon 7

interleukina 4 (IL-4) interleukina 10 (IL-10)

8