DOZAREA CATALAZEI

CINETICA ENZIMATICA

Enzimele sunt alctuite din proteine sau acizi nucleici produi de celulele vii. Aceti componeni omniprezeni acioneaz n reaciile biochimice drept catalizatori biologici avnd rolul de a crete viteza de reacie. n consecin, prin activitatea lor, enzimele fac posibil desfurarea reaciilor n organismele vii (a reaciilor biochimice) n condiii de temperatur, pH i concentraii de sruri compatibile cu viaa sistemelor biologice.Substana asupra creia enzimele i exercit aciunea catalitic se numete substrat (S) (reactantul). n reaciile catalizate enzimatic substratul se leag reversibil la o anumit poziie din structura enzimei (E), denumit centru activ, i conduce la formarea de produi de reacie. Structura centrilor activi este specific reaciei pe care o catalizeaz, datorit secvenei unice de aminoacizi din structura enzimei. Asemenea catalizatorilor, enzimele nu se transform n timpul reaciei, putnd fi reciclate i refolosite.Activitatea unei enzime este msurat prin viteza reaciei pe care o catalizeaz. Viteza reaciei se exprim prin cantitatea de substan transformat n unitatea de timp.Studiile cantitative asupra activitii enzimatice au nceput dup 1913, an n care Michaelis i Menten au propus, ca mecanism de aciune a enzimelor asupra substratului, formarea unui complex ntre enzim i substrat, urmat de desfacerea acestuia n enzim si produi:

E + S ES Pa. Activitatea enzimaticDeterminrile de activitate enzimatic se realizeaz, de obicei, n condiiile n care concentraia substratului este suficient de mare pentru ca viteza reaciei s fie determinat numai din cantitatea de enzim.La concentraii mici de substrat (mai mici dect cele necesare pentru ca toat enzima s fie transformat n complexul ES), viteza unei reacii enzimatice depinde de concentraia substratului. Relaia dintre viteza unei reacii enzimatice i concentraia substratului, pentru o cantitate dat de enzim, este dat de ecuaia Michaelis Menten:v ,

(1)unde [E]0 i [S]0 sunt concentraiile iniiale ale enzimei, respectiv, substratului, KM este constanta Michaelis reprezentat prin relaia constantelor (+ kb)/ka i este caracteristic aciunii unei enzime date pe un anumit substrat, este viteza maxim de formare a produsului, proporioonal cu concentraia iniial de enzim.Prin rearanjarea expresiei (1) ntr-o form care poate fi analizat prin regresie liniar:

(2)se obine graficul Lineweaver Burk care este reprezentarea lui n funcie de , a crui pant este ; intersecia cu axa y este , iar intersecia cu axa x este .

Fig. 1 Graficul Lineweaver Burk pentru studiul reaciilor catalizate enzimatic

b. Eficiena catalitic a enzimelor

Constanta catalitic a unei enzime, kcat, sau numrul turnover, este numrul de cicluri catalitice (turnover) realizate de centrul activ ntr-un interval dat, mparit la durata intervalului. Aceast mrime este, n termenii mecanismului Michaelis Menten, numeric echivalent cu kb (constanta de vitez pentru formarea produsului din complexul enzimsubstrat). Prin identificarea lui kcat cu kb rezult c eficiena catalitic, , a unei enzime este raportul:

(3)c. Inhibiia i activarea reaciilor enzimatice

Reaciile catalizate de enzime sunt supuse inhibiiei sau activrii de ctre substane care interfer n mecanismul de desfurare al acestora. Principalii factori care pot afecta activitatea enzimei sunt: pH-ul, temperatura, concentraia de sruri, activatorii i inhibitorii.Multe medicamente folosite pentru tratarea bolilor funcioneaz prin inhibiie enzimatic. De exemplu, o strategie important n tratarea sindromului deficienei imunitare (SIDA) const n administrarea constant a unui inhibitor proteazic, special obinut. Medicamentul inhib enzima responsabil de formarea proteinei care acoper materialul genetic al virusului imunodeficienei umane (HIV). Fr formarea acestei proteine protectoare, virusul HIV nu se poate replica n organismul gazd.PRINCIPIUL METODEI

Catalaza este una dintre cele mai rspndite enzime in sistemele vii, care poate crete n prezena oxigenului (aerului). Principala funcie a catalazei n celulele vii este aceea de a preveni acumularea apei oxigenate care rezult din procesele metabolice. Catalaza poate, de asemenea, s participe i la unele procese de oxidare care au loc n celule.

Studiul cineticii de descompunere a H2O2 sub aciunea catalitic a catalazei se realizeaz prin msurarea volumului de oxigen degajat la intervale de timp regulate.STUDIUL ACTIVITII ENZIMATICE A CATALAZEIAmestecul de reacie se prepar ntr-un pahar Erlenmayer n care se introduce, n prealabil, o bar magnetic (petior) i conine m g drojdie, mL soluie de H2O2 20%, msurai cu seringa i V mL ap distilat, astfel nct volumul total al soluiei s fie 50 mL. Citirile de volum de O2 degajat se realizeaz din momentul adugrii H2O2 i continu la interval de 30 secunde pn la atingerea unui volum relativ constant.Influena concentraiei de catalazNr. crt123

mdrojdie, g135

, mL5

Influena concentraiei de H2O2Nr. crt123

mdrojdie, g1

, mL7910

Efectul adaosului de sare de lmie asupra reaciei enzimatice a catalazeiSe prepar ntr-un pahar Erlenmayer un amestec de reacie care conine 3 g drojdie, = 5 mL soluie de H2O2 20%, msurai cu seringa i V mL ap distilat, astfel nct volumul total al soluiei s fie 50 mL. Experimentul se desfoar n prezena a 5 g sare de lmie.PREZENTAREA REZULTATELOR

1. Se reprezint grafic variaia n funcie de timp i se determin vitezele de reacie pentru sistemele studiate.2. Se reprezint vitezele de reacie n funcie de concentraia de enzim, respectiv, substrat.3. Se reprezint graficul Lineweaver Burk.

4. Se determin constanta Michaelis Menten, KM, viteza maxim, vmax, i eficiena catalitic a enzimei utilizate.INTERPRETAREA REZULTATELOR

1. S se justifice alegerea masei de drojdie de 1 g pentru studiul influenei concentraiei de H2O2 asupra vitezei de reacie.2. Pe baza datelor experimentale obinute i a expresiei vitezei de reacie dat de ecuaia Michaelis Menten (1) s se formuleze principalele caracteristici ale reaciilor catalizate enzimatic (variaia vitezelor de reacie cu concentraia de enzim, respectiv, substrat).3. S se evalueze i s se explice efectul adaosului de sare de lmie.4. Cum vor fi influenate v i KM dac jumtate din moleculele de enzim au fost denaturate?5. Cum vor fi influenate v i KM dac se adaug alt substan care se leag reversibil sau ireversibil la centrii activi ai enzimei, dar care nu poate fi descompus de aceasta?

BAREMPRELUCRAREA REZULTATELOR

Total: 15 pctVariaia volumului de O2 degajat n timp pentru o concentraie dat de H2O2( 2 pct)

Variaia volumului de O2 degajat n timp pentru o mas dat de drojdie

( 2 pct)

Efectul adaosului de sare de lmie asupra reaciei enzimatice a catalazei

( 2 pct)

Influena concentraiei de catalaz asupra vitezei de reacie

( 2 pct)

Influena concentraiei de H2O2 asupra vitezei de reacie( 2 pct)

Graficul Lineweaver Burk( 3 pct)

Constanta Michaelis Menten: KM = 5,35 mol/L(0.5 pct)Viteza maxim: vmax = 5,5810-4 L/mols

(0.5 pct)Constanta catalitic: kcat = 2,7910-5 mol/gs(0.5 pct)Eficiena catalitic: 5.2110-5 molL/gs

(0.5 pct)INTERPRETAREA REZULTATELOR

Total: 10 pct1. S se justifice alegerea masei de drojdie de 1 g pentru studiul influenei concentraiei de H2O2 asupra vitezei de reacie. (2 pct)

Comportamentul reaciilor efectuate cu 3 i 5 g de drojdie sugereaz descompunerea tuturor moleculelor de ap oxigenat, ceea ce nseamn ca este un exces de catalaz.2. Pe baza datelor experimentale obinute i a expresiei vitezei de reacie dat de ecuaia Michaelis Menten (1) s se formuleze principalele caracteristici ale reaciilor catalizate enzimatic (variaia vitezelor de reacie cu concentraia de enzim, respectiv, substrat). (2 pct)- pentru o concentraie iniial dat de substrat, [S]0, viteza iniial de formare a produsului este proporional cu concentraia total a enzimei, [E]0.

- pentru [E]0 dat i valori sczute ale lui [S]0, viteza de formare a produsului este proporional cu [S]0.

- pentru [E]0 dat i valori ridicate ale lui [S]0, viteza de formare a produsului este independent de [S]0, atingnd o valoare maxim, cunoscut sub numele de vitez maxim, v = vmax = kb[E]0.3. S se evalueze i s se explice efectul adaosului de sare de lmie. (2 pct)

Viteza de reacie este mai mic, ceea ce nseamnn ca sarea de lmie a acionat ca un inhibitor.4. Cum vor fi influenate v i KM dac jumtate din moleculele de enzim au fost denaturate? (2 pct)

Pentru o concentraie dat de substratambele mrimi i reduc valorile.5. Cum vor fi influenate v i KM dac se adaug alt substan care se leag reversibil sau ireversibil la centrii activi ai enzimei, dar care nu poate fi descompus de aceasta? (2 pct)

Legarea reversibil corespunde blocrii temporare a centrilor activi ai enzimei, n competiie cu substratul, deci va diminua activitatea enzimatic, fr ns, s denatureze enzima. Acelai efect l prezint i legarea ireversibil, cu deosebirea c se denatureaz moleculele de enzim.APTITUDINI EXPERIMENTALE

Total: 5 pct

_1288714329.unknown

_1288714410.unknown

_1288776522.unknown

_1288776593.unknown

_1288766968.unknown

_1288770743.unknown

_1288771749.unknown

_1288714464.unknown

_1288714372.unknown

_1288714389.unknown

_1288714344.unknown

_1288427819.unknown

_1288714133.unknown

_1253947518.unknown

_1136315816.unknown