STRUCTURĂ ACIZI NUCLEICI

Curs general

Moleculele vieţiiViata depinde de stocarea stabila şi compacta a informaţiei

genetice ; Activitatile moleculelor celulare sunt guvernate de

principiile de baza ale chimiei; Apa celulară, ionii anorganici, şi mici molecule organice reprezintă aproximativ 75-80% din greutatea celulei vii; Macromoleculele (proteine, polizaharide, ADN) reprezinta restul.

Celule Procariote

Organisme unicelulare

Două tipuri pricipale: bacterii şi archaea

Relaţii structurale simple

Celule eucarioteOrganisme unicelulare şi multicelulare

Plante şi animale

Structural mult mai complexe: organite, citoschelet...

Structura celulei animale

Structura celulei vegetale

Complexitatea structurală a

organismului uman

NucleulSepară: ADN de citosol; transcriptia de translaţie

Caracteristici: - membrana externă; membrana internă; porii

nucleari; nucleoli

La Eucariote ADN este împachetat în cromozomi

Fiecare cromozom conţine o singură moleculă lineară de ADN asociată cu proteinele.

Intregul ADN compactat în cromozomii unui organism este localizat în genom. Secvenţierea şi alte tehnici au evidenţiat că peste 90% din genomul vertebratelor nu codifică pentru ARNm sau alte tipuri de ARN. La organismele multicelulare acest ADN conţine multe regiuni care sunt similare dar nu identice.

Imagine de cromozomi în metafază evidenţiaţi prin tehnica fluorescentă de hibridizare in situ (FISH)

Acizii nucleici

Acizii nucleici sunt substanţe care au fost pentru prima dată izolate

din nucleii celulelor. Există acizi nucleici şi în citoplasma celulelor.

Două tipuri de acizi nucleici:

ADN (acid dezoxiribonucleic) localizat în principal în nucleul

celulelor (când acesta este individualizat) ca în cazul eucariotelor);

ARN (acizi ribonucleici), prezenţi în principal în citoplasma

celulelor dar şi în nucleu.

Acizii nucleici ADNşi ARN au rol esenţial în sinteza proteinelor,

compuşi fundamentali ai celulei, suportul marii majorităţi a activităţilor

biologice.

ADN este suportul eredităţii;

ARN reprezintă acidul nucleic care permite sinteza proteică

Structuri generale macromolecule

Toţi acizii nucleici au o structură generală comună

Principalele cinci baze din structura acizilor

nucleici

A, G, T, C sunt prezente în ADNA, G, U, C sunt prezente în ARN

Structurile ceto-enol ale bazelor azotate

Forţele de stivuire

Stivuirea inelelor de adenină din cristalul 9-metil-adenină.

Suprapunerea parţială a inelelor reprezintă o asociere tipică a bazelor în structuri cristaline şi în dubla elice a acizilor nucleici

Terminologie nucleozide

Baze azotate Ribonucleozide DezoxiribonucleozideNume S/3L Nume S/3L S/1L Nume S/3L S/1L

Baze Pyr

Pirimidinice

nuclozide Pyd Y

Pirimidinice

2’dezoxiribonucleozide dPyd dY/Yd

pirimidinice

Citozină Cyt Citidină Cyd C 2’.dezoxicitidina dCyd dC/Cd

Uracil Ura Uridină Urd U 2’-dezoxiuridina dUrd dU/Ud

Timină Thy Ribozil-timină Thd T (2’-dezoxi)timina dThd dT/Td

Baze Purinice Pur nucleozide Puo R

Purinice

2’dezoxiribonucleozide dPuo dR/Rd

purinice

Adenina Ade Adenozina Ado A 2’-dezoxiadenozina dAdo dA/Ad

Guanina Gua Guanozina Guo G 2’-dezoxiguanozina dGuo dG/Gd

Xantina Xan Xantozina Xao X 2’-dezoxixantozina dXao dX/Xd

Hipoxantina Hyp

Inozina Ino I

Conformaţia nucleozidelor

Conformaţie C3’-endo

Conformaţie C2’-endo

conformaţie“envelope”

conformaţie “twist”

Izomeri de rotaţie în jurul legăturii glicozidice

Orientările sterice permise bazelor purinice şi pirimidinice în raport cu ataşarea lor la unitatea ribozică

Terminologie generală nucleotide

Nume SimboluriNucleozid x’- fosfat Nuc-5’P NMP x’- difosfat Nuc-5’PP NDP x’- trifosfat Nuc-5’PPP NTPCitidină 5’- fosfat Cyd – 5’.P CMP 5’- difosfat Cyd - 5’PP CDP 5’- trifosfat Cyd - 5’PPP CTPUridină 5’- fosfat Urd - 5’P UMP 5’- difosfat Urd - 5’PP UDP 5’- trifosfat Urd - 5’PPP UTPdtimină 5’- fosfat dThd - 5’P dTMP 5’- difosfat dThd - 5’PP dTDP 5’- trifosfat dThd - 5’PPP dTTPAdenozină 5’- fosfat Ado –5 ’P AMP

5’- difosfat Ado - 5’PP ADP 5’- trifosfat Ado - 5’PPP ATPGuanozină 5’- fosfat Guo - 5’P GMP

5’- difosfat Guo - 5’PP GDP 5’- trifosfat Guo - 5’PPP GTP

Structura generală

nucleotide

Conformaţia unei unităţi nucleotidice este determinată de şapte unghiuri de torsiune

Structura ATP

Complexul ATP-magneziu

Complexul ATP-magneziu

cAMP

UDP-glucoza

S-adenozilmetionina (SAM)

Reactii de transfer de grupari metil

Acetil-CoA

Acetil CoA

NAD(P)+

NAD+

NADP+

FAD

Constituenţii ADN şi ARN

Acid nucleic

PentozaNMP majore

NMP minore

Pyr Pur

ARN D-ribozaU A Foarte

diverse ARNt

C G

ADN 2’-deoxi – D-riboza

dT dA Derivaţi metilaţi ai

A şi CdC dG

Structura generală a acizilor nucleici

Formarea legăturilor fosfodiester

ADN-dublu helix format din catene complementare

Informaţia genetică este

purtată de molecule de ADN foarte

lungi, şi codificată în secvenţa lineară

de nucleotide A, T, C şi G ;

Molecula de ADN, în formă

de dublă elice, compusă dintr-o

pereche de catene complementare

formate din nucleotide care sunt

menţinute împreună prin legături de

hidrogen care se realizează între

perechile de baze G-C şi A-T ;

Tipuri de legături de hidrogen (I)

Împerecheri tip Watson-Crick Alte tipuri de împerecheri

Împrechere de adenine în structura cristalului de 9-metil-adenină

Împerecheri Hoogsteen între A şi T

Împerechere ipotetică între C şi T

Tipuri de legături de hidrogen (II)

Tipuri de legături de hidrogen (III)

Tipuri de legături de hidrogen (IV)

ADN - dublu helix format din catene antiparalele

Fiecare catenă de ADN posedă o polaritate chimică datorată legăturii dintre glucide şi grupările fosfat, care alternează la nivelul scheletului.

Cele două catene ale unei molecule

de ADN sunt antiparalele, adică posedă

orientare inversă;

Fiecare din cele două catene pot

servi ca matriţă pentru sinteza celeilalte

catene.

Astfel, aceeaşi informaţie genetică

este purtata de cele două catene care

formează dubla elice.

Dublul Helixcaracteistici structurale

Structura ADN B

Imaginea se bazează pe studiile cu raze X realizate

pe dodecamerul d(CGCGAATTCGCG)

Structura ADN B

Vedere pertenticulară pe axa helixului. În schemă legăturile fosforice sunt marcate în albastru iar bazele în roşu. Sint marcate în alb bazele, legăturile fosfodiester şi legăturile de hidrogen dintre două baze.

Vedere de-a lungul axei helixului

Caracteristicile conformaţiilor elicei ADNCaracteristici Conformaţie B Conformaţie A Conformaţie ZSens de răsucire drept drept stâng

Număr pb/tur 10,4 (10,0-10,7) 11 12 (6 dinucleotide)

Pasul (înălţinea pe ax)/pe plan de baze

3,4nm0,34 nm

2,8 nm0,26 nm

4,5 nm0,37 nm

Înclinare baze faţă de ax/rotaţia planului bazelor

10

360

200

330

90

-600/dinucleotid

Diametru 2 nm 2,3 nm 1,8 nm

conformaţii

dPyd:pentoză legătura glicozidică

2Eanti

3Eanti

2Eanti

dPuo: pentozălegătura glicozidică

2Eanti

3Eanti

2Esyn

Fosa: mare mică

Mare şi profundăÎngustă şi profundă

Îngustă şi profundăMare şi profundă

-Îngustă şi profundă

Structura ADN A

Vedere de-a lungul axei helixului

Structura ADN A

Vedere perpenticulară pe axa helixului

Structura ADN Z

Vedere de-a lungul axei helixului

Structura ADN Z

Vedere perpenticulară pe axa helixului

Trecerea ADN B în ADN Z

Trecerea ADN-B în ADN Z, reprezentat la nivelul unui fragment de 4 pb, implică răsucirea cu 1800 a fiecărei perechi de baze în raport cu lanţul oză-fosfat

ADN suferă separări reversibile ale catenelor

Metode de determinare a mărimii acizilor nucleici

Metodele de determinare a dimensiunilor acestor macromolecule se bazează pe diferite caracteristici. Mărimea poate fi determinată prin mai multe metode:

Microscopie electronică: datorită dimensiunilor lor acizii nucleici pot vizualizaţi prin această tehnică. Metoda se potriveşte foarte bine moleculelor de ADN de mărime medie (câteva mii la 200 000 pb)

Electroforeza în gel:

Este o tehnică de separare a moleculelor în funcţie de masa lor moleculară. Condiţiile de densitate de sarcină asemănătoare sunt realizate în mod natural, de către scheletul oză-fosfat. De asemenea, dependenţa logaritmică, distanţă de migrare în funcţie de mărime, este bine respectată. Pentru separarea moleculelor de acizi nucleici de diferite dimensiuni sunt folosite geluri de agaroză cu porozităţi variate (Figura 2.2). Pentru facilitarea estimărilor cantitative există colecţii de polimeri „marcheri de masă moleculară” utilizaţi pentru etalonarea separărilor. De altfel, această metodă de separare este omniprezentă în manipulările de biologie moleculară. Electroforeza se poate realiza şi în geluri de poliacrilamidă pentru situaţiile în care este necesară separarea moleculelor polinucleotidice mici sau oligonucleotidelor. Prin electroforeza în gel de poliacrilamidă este posibilă identificarea unor fragmente care diferă numai printr-un singur nucleotid. Din acest motiv tehnica este foarte utilă în secvenţializarea acizilor nucleici şi în determinarea regiunilor de polimorfism normal sau patologic determinat de existenţa unor mutaţii.

Mărimea unor molecule de ADN din diferite surse, comparată cu cea a unei proteine fibroase, colagenul, şi celulele procariote şi eucariote.

ADN/particule/ organisme

n de baze(kb)

Masă(MDa)

Lungime(nm)

(nm)

număr de cromoz

omi

Virusuri ADNSV40fag X174fag

5,25,448

3,23,632

1,7x10-3 (1,7m)1,8x10-3 (1,8 m)17x10-3 (17 m)

222

ProcarioteE. coli

4000 2600 1,36 2 1

EucarioteDrosofilaOm

62 000125 000

4100080 000

2141

22

2x42x23

Colagen 3x1000 aminoacizi

0,33 0,3x10-3 (0,3 m) 1,5

CeluleBacteria E. coliMamifere

2x10-3 (0,5x2 m)aprox 10x10-3 (10 m)

Moleculele ADN de mărime mare sunt analizate şi prin:

a) metoda clasică de ultracentrifugare cu toate că forţele de frecare existente între aceste molecule limitează câmpul aplicaţiilor (molecule de până la 1,5 x 106 pb); Prin această tehnică pot fi separate, în gradient de densitate de clorură de cesiu, următoarele: i) fragmente de ADN care au un conţinut diferit în guanină şi citozină; ii) ADN genomic bacterian; iii) ADN plasmidial; iv) ARN total, etc. Diferitele tipuri de ARN ribozomal de la eucariote şi procariote poate fi separat foarte simplu prin ultracentrifugare în gradient de zaharoză

Separarea acizilor nucleici prin ultracentrifugare: a) Separare ADN prin ultracentrifugare în gradient de CsCl; b) separare ARN prin ultracentrifugare în gradient de zaharoză

Electroforeză în câmp pulsatoriu. a) principiu de separare; b) electroforegramă obţinută în urma separării unor fragmente

mari de ADN. Vizualizarea a fost realizată în urma colorării cu bromură de etidium.

Polimerizarea nucleotidică

Structura unei molecule ARN: a) evidenţierea înlănţuirii nucleotidelor şi vectorizarea catenei; b) reprezentările prescurtată şi simbolică.

Hidroliza acizilor nucleiciHidroliza acizilor nucleici

Degradarea unui polinucleotid poate să se refere la: i) legătura fosfodiester atunci când se produce o depolimerizare; ii) unităţile nucleotidice dacă se rupe legătura glicozidică şi se degradează componentele. În ambele cazuri hidroliza poate fi de natură chimică sau enzimatică.

Hidroliza chimică a acizilor nucleici

Tratamentul acid afectează la fel ARN şi ADN:

Comportamentul ARN şi ADN la hidroliză bazică este foarte diferit:

Condiţii Produşi de hidroliză

ARN ADN

AcidepH 1,0 + încălzirepH 4,0

pentoze + fosfaţi + bazebaze purinice + AN apurinici

Alcaline NMP (2’ sau 3’) -

Produşii de degradare chimică a acizilor nucleici

Schema mecanismului de hidroliza ARN prin cataliza bazică: 1. Hidroxilul din 2’ este deprotonat de către ionul hidroxid; 2. Alcoxidul, nucleofil, atacă gruparea fosfodiester cu formarea unui diester ciclic 2’: 3’; 3. Un al doilea hidroxid provoacă hidroliza uneia sau alteia dintre legăturile ester: se obţin izomeri 2’ şi 3’ fosfat.

Scindarea enzimatică

Enzimele care catalizează hidroliza legăturii fosfodiester din structura acizilor nucleici, fosfodiesterazele, sunt numite şi nucleaze. Acestea sunt prezente în toate celulele şi sunt foarte utile în metabolismul acizilor nucleici şi proteinelor. O parte dintre a ceste nucleaze sunt secretate de către pancreasul exocrin, în intestin, şi participă direct la digestie hranei. Aceste enzime prezintă niveluri de specificitate comparabile cu cele ale peptidazelor şi proteazelor. Ele se pot clasifica în funcţie de:

a) modul lor de atac al catenei: i) exonucleaze, enzimele care acţionează la nivelul extremităţii catenelor; ii) endonucleaze, enzimele care atacă în interiorul catenelor;

b) specificitatea lor faţă de substrat: i) pentru tipul de acid nucleic: ribonucleaze pentru ARN, deoxiribonucleaze pentru ADN şi nucleaze pentru ambele; ii) pentru tipul de structură: mono- sau dublu catenară;

c) specificitatea lor de recunoaştere a situsurilor: i) specificitate pentru baze; ii) specificitate pentru secvenţe;d) tipul de rupere a legăturii fosfodiester: i) exonucleazele şi endonucleazele de tip d scindează extremitatea 5’ şi duc la formarea de 3’NMP; ii) exonucleazele şi endonucleazele de tip p scindează extremitatea 3’ şi determină formarea 5’NMP (Figura 2.8);

Scindarea enzimatică

Nucleaze Substrate1 Tăieturătip2; specificitate

Produşi

Exonucleaze

fosfodiesteraza (venin de şarpe) ARN, ADN s

p extremitatea 3’

5’-NMP

fosfodiesteraza (splină) ARN, ADN s

d extremitatea 5’

3’-NMP

exonucleaza I (E. coli) AND p extremitatea 3’

5’-NMP

exonucleaza III (E. coli) AND p extremitatea 3’

5’NMP+ADNs

Endonucleaze

endonucleaza S1 (Aspergillus oryzae)

ARN,ADN s,d

p aleatoare

5’-NMP +ON în 5’ P

ribonuclează T1 (Aspergillus oryzae)

ARN s pG/N

5’-NMP +ON în 3’ P

ribonucleaza A (pancreas) ARN s d-Pyr/N 3’-NMP +ON în 3’ P

Deoxiribonucleaza II (timus) ADN s d sPyr/dPur ON în 3’ P

Exemple de enzime de restricţie şi situsurile

recunoscute de acestea

Exemple de enzime de restricţie şi palindroamele recunoscute de acestea cu marcarea situsurilor de clivare şi a axei de simetrie: a)

obţinerea de capete coezive; b) obţinerea de capete drepte

Endonucleaza (sursa) Număr de situsuri de tăiereVirus SV40 fag X174 fag

EcoRI (E. coli RY13) 1 0 5BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H) 1 0 5HaeIII (Haemophilus aegypticus) 19 11 >50

Metode spectrofotometrice

Determinarea absorbţiei în ultraviolet cu ajutorul unui spectrofotometru permite verificarea purităţii unei soluţii de ADN sau ARN. În urma determinării densităţii optice se va obţine un pic la 260 nm. Pentru estimarea purităţii este necesară calcularea raportului densităţilor optice la 260 nm/280 nm care, în mod normal, trebuie să fie apropiat de valoarea 1,8-2,0. În cazul ADN, un raport mai ridicat indică o contaminare cu ARN. Dacă există o contaminare cu proteine (280 nm) sau fenol (270 nm), raportul va fi net inferior valorii de 1,8. Dacă ADN şi ARN sunt puri, cantitatea poate fi apreciată astfel:

unitatea DO (260 nm) = 50 ng/l pentru ADN dublu-catenarunitatea DO (260 nm) = 33 ng/l pentru ADN monocatenar

unitatea DO (260 nm) = 40 ng/l pentru ARN

Utilizarea de mini-gelulri

Determinarea secvenţei primare a acizilor nucleici

Metoda chimică Maxam W. GilbertMetoda chimică Maxam W. Gilbert

Metoda „dideoxi” a lui F. Sanger

Sinteza în fază solidă a catenelor unui polinucleotid prin metoda „fosforamidiţilor”

Denaturarea ADN

Măsurarea absorbţiei moleculelor denaturate

Determinarea Tm

Analiza denaturării ADN

Renaturarea ADN

Estimarea absorbanţei în funcţie de structură şi temperatură

Absorbanţa relativă a ADN monocatenar şi bicatenar

Estimarea denaturarii termice

Electroforeza şi autoradiografia ADN

Ultracentrifugarea

Ecuaţiile Svedberg

Ultracentrifugarea ADN în gradient de CsCl

Ultracentrifugarea ARN în gradient de sucroză

Enzime de restricţie

Super-helixurile ADN

Linking number

Writhing number

Forme suprarăsucite

Structuri topoizomere

Topoizomeri şi topoizomeraze

Separarea topoizomerilor ADN SV40 DNA evidenţiază existenţa mai multor topoizomeri cu un număr diferit de suprarăsuciri

Rolul topoizomerazelor în replicarea ADN

Moleculele de ADN se pot îndoi şi încolăci în spaţiu conducând la modificări de topologie cum ar fi formarea supra-răsucirilor

Topoizomerazele sunt enzime care controlează topologia ADN şi realizează etape esenţiale în diferite etape ale replicării având drept rezultat înlăturarea constrângerilor.

Topoizomeraze

Topoizomeraza de tip I relaxează ADN prin inducerea de tăieturi la nivelul unei singure catene a duplexului ADN

Topoizomeraza de tip II modifică topologia ADN prin scindarea si resudarea ambelor catene

Mecanism topoizomeraze

Modelul activităţii catalitice a topoizomerazei II (ADN giraza) din E. coli

ADN giraza înlătură super-răsuricirile pozitive care apar în mod normal la nivelul furcii de replicare

Separarea moleculelor de de ADN circular replicate este realizată de topoizomeraza de tip II

Topoizomeraza de tip II separă cromatidele lineare surori

Discuţii

De ce T în ADN şi U în ARN

De ce deoxiriboză în ADN şi riboză în ARN

De ce 2 helixuri (catene ) în ADN şi una în ARN

ADN de la diferite organisme:

Virusurile

Procariotele

Eucariotele

ADN din mitocondrii (ADNmt)

Tipuri de legături de hidrogen care sunt specifice structurii secundare a ARN

Tipuri de baze modificate prezente în

structura acizilor nucleici

Structura ARN de transport: a) Motivele elementare de structură 2-D; b) Structura terţiară în formă de L.

Tipuri de structuri secundare posibile ale ARNr de tip 16S: a) la archebacterii; b) eucariote, drojdii; c)

mitocondrie de mamifer (bovine)

Structura ARNr de 16 S de la E. Coli de 1542 nucleotide bazată pe compararea secvenţelor de la diferite tulpini (se presupune ca aceasta structura este conservata evolutiv)

Sinteza moleculelor de ARNm: a) transcripţia ARNm policistronic la procariote; b)

transcripţia şi maturarea ARNm la eucariote; ARN transcris de la nivelul unei unităţi complexe (albastru)

poate fi procesat pe mai multe căi pentru a conduce la unul sau

la mai multe unităţi ARNm monocistronice funcţionale. Liniile punctate marcheză

înlăturarea intronilor.

Moleculele de ADN ARN posedă conformaţii diferite

Inversiunile repetitive formează structuri “foldback”

Schema unei molecule de ARNt încărcată: a) schema generală a structurii secundare a moleculei; b) modul de

formare a legăturii ăntre ARNt şi aminoacil

Recunoasterea codon

anticodon

Tipuri de molecule de ARNt. Sunt marcate

elementele de identitate majore în cele patru tipuri. Fiecare bază din structura ARNt este reprezentată de

cercuri pline. Cercurile roşii indică poziţiile

identice pentru recunoaşterea ARNt de către aminoacil-ARNt sintetază. Bazele din

structura anticodonului care reprezintă elemente de identificare sunt subliniate.

Diferitele tipuri de ARN

Moleculele de ARN mesager Moleculele de ARN de transfer: structura secundară sub

formă de «frunză de treflă»; structura terţiară 3-D în L a moleculelor ARNt

Moleculele de ARN ribozomal; particulele ribozomale

Ribozimele

Moleculele snARN

Comparaţie ARNm la procariote şi eucariote

Procariote: operonii bacterieni – ARNm este policistronic; Eucariote: ARNm este monocistronic şi conţine exoni şi introni.

Exemple de structuri adoptate de ARNr

Structura ribozomilor la procariote & eucariote

Structura generală a ARNt

Exemple de molecule ARNsn

Structura “cap de ciocan” a unei ribozime

ADN mitocondrial şi din cloroplasteSe consideră că mitocondriile au evoluat din bacterii care prezintă o relaţie

simbiotică cu celulele ancestrale care conţin un nucleu eucariot. Majoritatea genelor originale din aceste organite au fost transferate genomului nuclear în timpul evoluţiei, păstrând diferite gene în organitele diferitelor organisme;

ADNmt de la mamifere conţine numai aprox 16 kb; acesta nu conţine introni şi prezintă numai o mică regiune necodantă. ADNmt de la plante şi drojdii este mult mai mare. Toate tipurile de ADNmt codifică pentru ARNr, ARNt şi pentru câteva proteine implicate în transportul mitocondrial al electronilor şi în sinteza ATP;

Majoritatea ADNmt este moştenit mai degrabă din ou (ovul) decât din spermă, mutaţiile în ADNmt fiind moştenite pe linie maternă;

Ribozomii mitocondriali se aseamănă cu ribozomii bacterieni ca structură, sensibilitate la cloramfenicol şi rezistenţă la cicloheximidă;

Codul genetic pentru ADNmt de la animale şi fungi diferă de cel bacterian şi de cel al genomului nuclear prin aceea că numeroşi codoni codifică pentru aminoacizi sau semnale STOP alternative; Mitocondriile plantelor par să folosească codul standard nuclear şi bacterian;

Mutaţiile ADNmt pot determina maladii neuromusculare umane, probabil datorită necesităţii crescute de ATP a acestor ţesuturi. În general pacienţii prezintă un amestec de mitocondrii care conţin ADNmt normal şi mutant în celule (heteroplasmie). Severitatea fenotipică este mai mare cu cât proporţia de ADNmt este mai mare;

ADN din cloroplaste este circular şi conţine aproximativ 120-160 kb, în funcţie de speciile de plante. Acestea codifică pentru aproximativ 120 de proteine şi folosesc codul genetic standard.

ADNmitocondrial

uman