Post on 29-Jan-2016
description
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE „GR. T. POPA” IAŞI
FACULTATEA DE MEDICINĂ
TEZĂ DE DOCTORAT
- REZUMAT -
BIOCOMPATIBILITATEA UNOR BIOMATERIALE
DESTINATE INGINERIEI TISULARE
– MODALITĂŢI DE EVALUARE –
Conducător științific
PROF.UNIV. DR. ELENA CARMEN COTRUTZ
Doctorand
ANA MARIA MANOILESCU (HOLICOV)
IAȘI - 2015
2
CUVINTE CHEIE:
Testarea biocompatilității
Teste de viabiliate/citotoxicitate/proliferare celulară
Inginerie tisulară
3
4
5
6. APLICAREA TESTELOR DE VIABILITATE CELULARĂ / CITOTOXICITATE
ÎN PENTRU EVALUAREA BIOCOMPATIBILITĂȚII BIOMATERIALELOR CU
APLICAȚII MEDICALE – STUDIU BIBLIOGRAFIC
Motivația studiului
Pentru a evidenția importanța studiului comparativ al metodelor de evaluare a
biocompatibilității materialelor cu potențiale aplicații medicale, am efectuat un scurt studiu
bibliografic din care să reiasă numărul de articole publicate în domeniu precum și numărul de
articole care studiază aspecte ale biocompatibilității in vitro și care utilizează diferite metode,
unele dintre ele aplicate sau comparate în prezenta teză de doctorat. Scopul acestui studiu
bibliografic a fost de a releva tipurile de teste de evaluare a biocompatibilității cel mai
frecvent utilizate în publicațiile de profil. Un scop secundar al acestui studiu a fost acela de a
evidenția modul în care testele utilizate pentru evaluarea biocompatibilității (tipul de test,
subcategoria de test) sunt adaptate cerințelor prezentului. Termenii au fost căutați în titlu și
rezumat.
Rezultate
Termenul MTT este în general mai utilizat în literatura de specialitate pentru a defini
testele pe bază de săruri de tetrazoliu. Astfel, pentru termenul „biomaterial tetrazolium” am
obținut 616 rezultate față de 1443 pentru termenul „biomaterial MTT”, ceea ce demonstrează
utilizarea mai frecventă a termenului MTT pentru testele pe bază de săruri de tetrazoliu. În
același timp, căutarea defalcată după clasificarea biomaterialelor pentru termenul „biomaterial
tetrazolium” a determinat valori care, însumate, ajung la valoarea de 499, o diferență notabilă
față de căutarea cu termenul generic.
Explorând subcategoriile de teste metabolice pe bază de săruri de tetrazoliu, am
remarcat utilizarea aproape exclusivă a testului MTT (1437 rezultate) față de celelalte
variante, mai performante sau mai puțin toxice pentru celule (așa cum am demonstrat într-un
experiment ulterior). Majoritatea testelor MTT au fost aplicate materialelor polimerice (935
rezultate), urmate la egală distanță de materialele metalice (263 rezultate) și compozite (160
rezultate). Pentru materialele ceramice, căutarea pentru testul MTT a adus numai 79 rezultate.
Astfel, rezultatele globale per subcategorie de test care utilizează săruri de tetrazoliu
au arătat dominația absolută a testului MTT (1437/1443 în funcție de tipul de căutare pe
terminologie „însumate în funcție de clasificarea biomaterialelor” / „biomaterial MTT”), la
mare distanță se situează rezultatele evaluării biocompatibilității prin alte teste cum ar fi MTS
(174 rezultate), WST-1 (85 rezultate), XTT (66 rezultate) și CCK-8 (51 rezultate).
O căutare similară într-un studiu bibliografic efectuat însă pe motorul de căutare
Google Scholar și pentru teste utilizate în evaluarea viabilității celulelor tumorale, în reviste
cu tematică oncologică (87) a demonstrat că testele MTT si MTS domină și pentru respectiva
tematică, în timp ce testele WST-1 (272 citări), AlamarBlue (resazurina – 134 citări),
PicoGreen (30 citări) și CyQuant (94 citări) sunt în inferioritate.
În concluzie, abordarea prezentului studiu din teza de doctorat este perfect justificată și
regăsește doar puține corespondențe în literatura de specialitate. Se pare că testul cel mai
utilizat în evaluarea biomaterialelor rămâne testul MTT. Chiar dacă variantele sale (teste
metabolice pe bază de săruri de tetrazoliu) sunt disponibile la preturi acceptabile, utilizarea lor
este destul de redusă, insignifiantă chiar în raport cu numărul de citări pentru testul clasic
MTT. Am remarcat unele articole (citate ulterior în teză) care, în ciuda complexității
metodelor de sinteză și evaluare fizico-chimică a unui biomaterial, apelează la metode
simpliste și lipsite de precizie în realizarea testelor de biocompatibilitate in vitro. În capitolul
următor al tezei, am abordat exact acest aspect, evaluarea comparativă a unor teste de
determinare a citotoxicității unor biomateriale cu aplicații biomedicale, cu scopul de a selecta
testele optime pentru astfel de protocoale de lucru.
6
7. EXPLORAREA COMPARATIVĂ A UNOR TESTE DE VIABILITATE/
CITOTOXICITATE/PROLIFERARE CELULARĂ UTILIZATE PENTRU
EVALUAREA BIOCOMPATIBILITĂȚII UNOR BIOMATERIALE CU APLICAȚII
MEDICALE.
Motivația studiului
Având în vedere faptul că în marea majoritate a aplicațiilor clinice/experimental
biologice a biomaterialelor acestea ajung în contact și cu o componentă celulară a unui țesut
sau organ, este importantă definirea metodelor de testare specifice pentru fiecare tip de
eșantion studiat.
Descrierea studiului
Este prezentat modul de aplicare optimă a testelor de citotoxicitate pentru eșantioane
din biomateriale metalice și polimerice. Metodele de testare utilizate au fost subliniate în
capitolul de studiu bibliografic, dar problemele practice ale testării includ și momentul
discuțiilor referitoare la condiționarea biomaterialului.
În prezentul studiu am demonstrat rezultate ale aplicării unor variate teste folosite în
evaluarea biocompatibilității unor biomateriale cu aplicații medicale, alături de realizarea unor
comparații utile în alegerea unui set de teste elocvente pentru scopul propus.
Testele pe care le-am aplicat în evaluarea biocompatibilității unor materiale polimerice
sau metalice sunt enumerate și detaliate, cu expunerea detaliilor de tehnică și adaptărilor
necesare în funcție de tipul de material testat.
Teste metabolice
Cele mai multe metode din această categorie includ, așa cum s-a observat ca și consecință a
studiului bibliografic:
1. teste care exploatează reducerea sărurilor de tetrazoliu;
Am dorit să comparăm evaluarea viabilității a două linii celulare, osteoblaste umane și
celule de osteosarcom uman, cu ajutorul acestor două kituri. Inițial am testat sensibilitatea
kitului CCK-8 pe două linii celulare osoase (HOS (ostesarcom uman) și HOB (osteoblaste
umane) descrise în capitolul material și metode, des utilizate pentru testarea
biocompatibilității materialelor cu aplicabilitate medicală (în special materialele destinate
implanturilor osoase, plăcilor de osteosinteză cu/fără acoperiri speciale).
Rezultate: Pentru linia celulară tumorală, absorbanța variază linear cu concentrația
numărului de celule până la 5x105 celule per godeu (concentrația maximă testată), fapt datorat
probabil activității metabolice mult mai intense decât pentru celulele normale. Referitor la
comparația între fiabilitatea testului MTT și CCK-8 (deși fac parte din aceeași categorie,
descrisă în introducerea acestui experiment), am realizat o comparație între sensibilitățile
celor două teste atât pe celule tumorale cât și celule normale.
Influența pH-ului asupra rezultatelor testelor metabolice de viabilitate/proliferare/
citotoxicitate tip MTT Am decis efectuarea de unui experiment care să ilustreze variațiile în reducerea
sărurilor de tetrazoliu, comparativ pentru materiale polimerice neutre și ușor acide și de
asemenea pentru celule cu fenotip normal versus celule cu fenotip tumoral.
Rezultate: Așa cum au arătat și alți autori, dar pe celule tumorale, de obicei mai
rezistente la variații de pH, capacitatea celulară de reducere a formazanului (celule HepG2 –
carcinom hepatic) dispare la un pH de 5,9, pentru o incubare de 72 ore. Sub pH de 5,
capacitatea de reducere a formazanului dispare, atât pentru celulele incubate pentru o durată
redusă la pHul respectiv (sub 5) sau o durată prelungită la 72 de ore. În experimentul efectuat,
durata incubării a fost de la 24 la 192 ore. Atât acidifierea mediului prin incubarea prelungită
fără schimbarea mediului cât și aciditatea latentă a polimerului celulozic testat au determinat o
incapacitate de reducere a formazanului pentru ambele tipuri celulare testate. Testul MTT, în
7
ciuda avantajelor determinate de costul redus sau de timpul redus de lucru (în cazul kitului
CCK-8), prezintă inconvenientul unui timp de incubare de 1-4 ore (de obicei incubarea de 1
oră nu prezintă rezultate consistente, iar incubarea prelungită crește toxicitatea compusului
asupra celulelor) și, de asemenea, al dependenței de variațiile de pH. Este așadar important de
precizat, atunci când este cazul, modul de evoluție a pHului în mediul de incubare pentru
materialul de testat.
2. Teste pe bază de resazurină/resorufină – testul CellTiterBlue;
Testele bazate pe principiul transformării resazurinei în resorufină sunt similare celor
din categoria MTT, implicit sunt teste metabolice. Acest gen de teste aduce ca și avantaj
posibilitatea de cuantificare a resorufinei produse, de obicei această cantitate fiind
proporțională cu numărul de celule viabile. Cuantificarea resorufinei se poate face și prin
evaluarea absorbanței, dar această metodă nu este folosită în mod curent, deoarece evaluarea
fluorimetrică este mult mai sensibilă.
Evaluarea toxicității testului Cell TiterBlue
Pentru a evidenția acest elemente și în cazul utilizării kitului CellTiterBlue, am utilizat
pentru testarea unor pelicule de chitosan (normal total biocompatibile), două linii celulare
(una normală – HOB, una tumorală – HOS, protocoalele fiind identice ca pentru testarea cu
kiturile MTT și CCK-8).
Rezultate: Am observat o diferență de intensitate a fluorescenței în funcție de mediul
de cultură utilizat și de timpul de incubare.
Astfel, o extensie a timpului de incubare dincolo de 4 ore a determinat efecte toxice
evidente asupra celulelor cultivate pe peliculele de chitosan. Valorile RLU (unități de
luminiscență, proporționale direct cu viabilitatea celulară) au scăzut după 4 ore de incubare,
rămânând semnificative la 6 ore dar suferind o prăbușire bruscă la toate citirile mai mari de 8
ore de incubare. În același
timp, viabilitatea celulelor
din setul control (celule
HOS netratate cu
resazurină) a crescut în
timp și valorile RLU au
crescut exponențial,
corespunzător cu
proliferarea celulară.
Efectele toxice ale
resazurinei au fost
evidențiate și prin
observație microscopică în
contrast de fază.
Morfologia celulară se
modifică de la 1 la 4 ore de
expunere la reactiv,
celulele devenind rotunde,
semn de suferință celulară
accentuată. Modificările
sunt evidente la 24 de ore,
majoritatea celulelor
adoptând morfologia
sferică. Această morfologie
corespunde cu indicii de
viabilitate foarte reduși,
evidențiați cu ajutorul
kitului ATPGlo.
8
3. Testul de detectare a producției de ATP (test metabolic)
Testele de determinare a proliferării/viabilității celulare care exploatează activitatea
luciferazei sunt din ce în ce mai răspândite și utilizate și în teste de screening. ATP este un
marker extrem de util în aprecierea viabilității celulare. Acest sistem de testare este foarte
avantajos deoarece este omogen, bazându-se pe o reducere a numărului de manevre aplicat
plăcii de cultură în care se realizează testul de viabilitate. Un alt avantaj al utilizării testelor pe
bază de detectare a ATP prin chemiluminiscență este reprezentat de sensibilitatea mult mai
mare decât a testelor pe bază de tetrazoliu sau resazurină. Am testat comparativ viabilitatea cu
kiturile avute la dispoziție pentru două linii celulare (HOB și HOS, descrise mai sus,
proliferate și însămânțate după protocoalele descrise pe larg la materiale și metode) și pentru
cele două tipuri de pelicule utilizate în comparațiile testelor pe bază de săruri de tetrazoliu.
Rezultate:
Factori care influențează rezultatele testului pe baza detectării ATP
- temperatura: O etapă de congelare/decongelare nu afectează consistent rezultatele
testului. Ulterior însă, de la 2 la 4 recongelări, compusul reconstituit pierde din fiabilitatea
răspunsului și rezultatele sunt alterate. Așadar, atunci când nu se lucrează detectări de
viabilitate la scară largă și care ar impune utilizarea întregului volum reconstituit de 10mL
reactiv CellTiterGlo, este utilă și accesibilă aliquotarea acestui reactiv în vederea utilizării
raționale pentru experimente la scară redusă.
- compuși chimici care pot rezulta din degradarea parțială a biomaterialului de
studiu (în special micro/nanoparticule, hidrogeluri, scaffolduri); orice compus chimic care
influențează sau realizează depleția ATP poate modifica rezultatele acestui test. Am observat,
pentru concentrații de ATP între 1nM-10mM o reducere semnificativă a luminiscenței pentru
mediul cu roșu fenol și glucoză. Sensibilitatea maximală a fost notată pentru mediul de cultură
fără roșu fenol și fără glucoză, pentru concentrații de ATP între 10nm-10µM. La concentrații
ale ATP peste 100µM, rezultatele au fost uniforme. Având în vedere că în intervalele de
studiu în care modificările sensibilității testului sunt semnificative se încadrează marea
majoritate a probelor biologice, în funcție de sensibilitatea de care avem nevoie în realizarea
testului de biocompatibilitate, vom folosi mediul adecvat experimentului.
- tipul de placă utilizat la citirea reacției luminiscente. Pentru citirea rezultatelor la
testul CellTiterGlo, având în vedere realizarea lizei celulare, din volumele de lizat din
godeurile de lucru se preiau 40µL care sunt plasați în godeurile unei plăci de cultură cu 384
godeuri, cu pereți opaci, albi și fundul opac, producător Greiner. Spațierea godeurilor de citire
este singura soluție pentru evitarea fenomenului de cross-talk. Soluția este facilă din punct de
vedere al designului experimental, dar este un coșmar din punct de vedere practic, pentru că
pipetările se realizează manual pentru a respecta spațierea între godeuri. Din acest motiv, nu
se poate utiliza o pipeta multicanal în acest caz.
Teste de evaluare a integrității membranare includ dar nu se limitează la:
- testul de excludere cu albastru tripan;
- testul de includere a iodurii de propidiu
- testul cu roșu neutru
- testul de evaluare a pierderii de LDH
- testul cu SytoxGreen
Rezultate
Testul cu albastru tripan este util numai pentru numărarea celulelor care vor fi aplicate
pe materialele de studiu. Acea etapă rămâne una obligatorie în testarea unui biomaterial,
indiferent de natura acestuia.
Am testat remanența PI pentru celule aderente la suprafața unui biomaterial metalic
pentru o durată de 4 ore. Am remarcat că intensitatea marcării cu PI scade accelerat și
cuantificarea celulelor la un anumit interval este dificilă și presupune multe erori de
9
interpretare. Astfel, testul cu PI nu este recomandat pentru evaluarea biocompatibilității, nici
pentru materiale metalice nici polimerice.
Explorarea citotoxicității biomaterialelor cu aplicații medicale prin teste time-
course versus teste end-point Sondele fluorescente tip CellTracker sunt utile în evaluarea motilității și localizării
celulare la suprafața sau în volumul unui biomaterial. Probele CellTracker sunt non-toxice și
disponibile într-o gamă largă de fluorofori care pot fi alese în funcție de echipamentul de
citire disponibil (combinație laseri/filtre). Prin proprietățile lor chimice, aceste probe permit
co-localizare cu anticorpi și alte probe de investigare a comportamentului celular (exemplu –
alte sonde fluorescente pentru componente subcelulare). Sondele CellTracker sunt excelente
pentru monitorizarea proliferării celulare, migrării, fenomenelor chemotaxice și invazivității
celulare. Sondele pot traversa membranele biologice cu ușurință, ceea ce le face incorporabile
în celulele vii, fără a afecta viabilitatea sau expresia fenotipică a acestora (citare articol
celltracker fluor probes). Deoarece structura chimică a sondelor presupune transformarea lor
în produși care nu mai pot traversa membranele intacte, aceștia rămân localizați intracelular.
Fig. 1. Profilul de intensitate medie a fluorescenței pentru 3 tipuri de sonde fluroescente în
comparație cu profilul similar al Sytox Green, pentru un experiment de cultivare a celulelor
HOS pe pelicule polimerice PPVA-colagen pentru durate variabile de incubare (1-8 zile).
Profilul intensităților medii ale fluorescențelor sondelor studiate variază atât între ele
dar mai ales în comparație cu stabilitatea SytoxGreen. Este de menționat însă că reactivul
SytoxGreen nu pătrunde decât în celulele cu o permeabilitate a membranei afectată iar astfel
acest test este util în configurația descrisă la material și metode (evaluarea numărului total de
celule viabile prin substracția numărului de celule evaluate în etapele experimentului din
valoarea totală a celulelor obținută prin permeabilizare cu un detergent). Aceleași observații
sunt valabile și pentru celelalte variante de sonde fluorescente, cu mențiunea că pentru sonda
CTG extincția a fost mai lentă iar intensitatea fluorescenței a prezentat valori mai ridicate
decât în cazul CTB. CTG este util ca sondă individuală pentru evaluarea proliferării celulare
în cadrul testelor de biocompatibilitate dar pune probleme de interpretare în cazul folosirii
combinate cu alte sisteme de detectare a unor procese patologice, deoarece cele mai fiabile
sunt cuplate cu un fluorofor în aceeași parametri de exitație/emisie.
Pentru urmărirea individuală a proliferării celulare la suprafața unor probe de
biomateriale mecanice, CTG devine o recomandare, mai ales pentru testele cu durată de 4 -5
zile. În cazul în care există dorința și posibilitatea de a cupla această marcare cu alte teste care
să evidențieze procese patologice care ilustrează toxicitatea materialului, se recurge la sondele
10
CTB sau cel mai bine la sondele CTR cu varianta CTFR (far-red). Aceasta din urmă prezintă
o suprapunere spectrală minimă cu majoritatea fluoroforilor, neinterferând nici cu o eventuală
fluorescență intrinsecă a materialului de testat. Pentru sonda CTR am remarcat o preferință
pentru celulele NDHF care au prezentat o intensitate a marcării aproape egală cu cea pentru
CTG, dar numai până în ziua a 3-a de marcare.
Practic acest gen de marcare recomandă o durată a testului de 4 maxim 5 zile, pentru o
menținere a fluorescenței în limitele unei interpretări corecte, interpretare care nu trebuie să
influențeze efectul eventual toxic al biomaterialului de studiat. Testele cu cell tracker nu sunt
utile pentru materiale care ar putea elimina amine și tioli.
Testele de evaluare a cantității de ADN
Conținutul în acizi nucleici al unui volum de solvit în care se regăsesc celule (lizate)
este un indicator fidel al numărului de celule din respectivul volum. Mai multe teste de
proliferare speculează această proprietate; din variantele cunoscute, cităm aici testul CyQuant,
descris la material și metode și utilizat în prezentul material de studiu și testul PicoGreen.
Pentru evaluarea modului în care celulele depuse pe pelicule polimerice în plăci de
polistiren clare cu 96 godeuri (Corning) proliferează și se dezvoltă, am testat 4 linii celulare și
anume – fibroblaste dermice umane (NDHF), celule de osteosarcom uman (HOS), celule
osteoblastice normale (HOB) și celule epiteliale MCF10A. Metodele de cultivare, prol iferare
și detașare pentru pasaje sunt descrise la capitolul materiale și metode. În prezentul
experiment, numărul de celule a pornit de la 3x104 pentru ziua 0. Ulterior, am apreciat
valorile de multiplicare a cantității de ADN pentru fiecare godeu.
Aplicarea testului CyQuant NF pentru cele 4 linii celulare a permis analiza în timp real
a datelor pentru cele 8 zile ale experimentului. La finele acestuia, am interpretat și corelat
datele obținute pentru viabilitatea celulară pe pelicule de chitosan.
Pentru a compara și corela testele metabolice de apreciere a viabilității celulare cu
testele de evaluare a cantității de ADN în același scop, am aplicat, pe aceleași pelicule
polimerice folosite la testul CyQuant (pelicule de chitosan) și testele MTT și CellTiterBlue.
Rezultatele au fost din nou variabile în funcție de tipul celular folosit. Activitatea
metabolică a fost mai intensă și implicit evaluarea numărului de celule a fost mai importantă
pe măsura progresiei în timp a experimentului. Astfel, numărul estimat de celule HOS a
prezentat valori ale multiplicării celulare de la 3,2 la 9,87 ori, fapt care diferă semnificativ de
profilul estimat de aprecierea cantității de ADN realizată de testul CyQuant. Chiar evoluția
de-a lungul celor 8 zile de experiment a fost diferită, testul MTT prezentând abateri mai
importante de la evoluția teoretică linear ascendentă. De altfel, testul MTT, pe lângă
problemele de tehnică și interpretare semnalate mai sus, în raport cu materialul de testat,
evaluează activitatea metabolică celulară și, pe baza acesteia realizează a aproximare a
viabilității și proliferării celulare. Lanțul de aprecieri induce, fără îndoială, destule erori.
Deși este mult mai sensibil decât testul MTT, evoluția este de multe ori non-lineară,
variațiile numărului de celule raportat la rezultatele testului CyQuant fiind destul de mari.
Corelații între rezultatele variatelor metode de evaluare a biocompatibilității
Metodele de detectare a viabilității/proliferării celulare în cadrul unor teste de evaluare
a biocompatibilității unor materiale cu aplicabilitate în domeniul biomedical au fost prezentate
mai sus. Având în vedere multitudinea de aspecte care trebuie luate în considerare pentru
fiecare metodă în parte, am realizat o comparație între testele metabolice și cele de detectare a
conținutului ADN respectiv cele care speculează integritatea membranară pentru a determina
viabilitatea/proliferarea. Comparația a fost realizată între variațiile numărului de celule pentru
testele metabolice și variațiile conținutului de ADN pentru testele specifice (de detectare a
acizilor nucleici). Pentru testele care speculează integritatea membranară, s-a realizat direct
variația numărului de celule (așa cum s-a descris în capitolul material și metode, tehnica
SytoxGreen).
11
Având în vedere că observațiile comparative dintre aceste teste sunt pur vizuale, am
efectuat o evaluare de corelație între rezultatele acestor teste, pentru cele 4 linii celulare luate
în studiu și pentru peliculele de chitosan, ca biomaterial de studiu.
Evaluarea nivelului de corelație dintre valorile de multiplicare ale numărului de celule
pentru testele MTT și CellTiterBlue și multiplicarea cantității de ADN pentru testul CyQuant
s-a realizat prin tehnica celor mai mici pătrate, in Excel. Nu am ales o tehnică statistică prea
sofisticată, deoarece testul dorește doar să evidențieze corelațiile între cele două tipuri de
teste, pentru a putea opta ușor în cazul evaluării compatibilității unui biomaterial.
Rezultate:
Fig. 2. Corelații între estimarea proliferării celulare prin testele MTT și CyQuant pentru 4
linii celulare (HOS – human osteosarcoma; NDHF – normal dermal human fibroblast; HOB –
human osteoblast; MCF10A – celule fenotip epitelial).
Fig. 3. Corelații între estimarea proliferării celulare prin testele MTT și CellTiterBlue pentru
4 linii celulare (HOS – human osteosarcoma; NDHF – normal dermal human fibroblast; HOB
– human osteoblast; MCF10A – celule fenotip epitelial)
12
Fig. 4. Corelații între estimarea proliferării celulare prin testele SytoxGreen și CyQuant
pentru 4 linii celulare (HOS – human osteosarcoma; NDHF – normal dermal human
fibroblast; HOB – human osteoblast; MCF10A – celule fenotip epitelial)
Am remarcat, pentru celulele cu fenotip tumoral (HOS) dar și pentru fibroblastele
dermice (NDHF) crescute pe peliculele de chitosan, o bună corelație a proliferării celulare
(determinată prin tehnica MTT) cu evoluția cantității de ADN (0,7<R2<1). O corelație
similară s-a remarcat și pentru celulele NDHF (R2=0,908). Deși pare ciudat, fibroblastele
dermice au un profil corelat pentru testele metabolice și cele de detecție a ADN, posibil
datorită modului de creștere, a suprafeței atinse (sunt celule aderente cu o geometrie și cu
expansiuni ale membranei total diferite de celulele tumorale.
În ceea ce privește corelația rezultatelor, pentru toate celulele studiate, cu excepția
liniei epiteliale MCF10A, crescute pe peliculele de chitosan, am observat o corelație bună a
proliferării celulare (determinată prin cele două tehnici metabolice, MTT și CellTiterBlue -
0,75<R2<1). Pentru celulele HOS, valoarea înregistrată a corelației a fost ușor inferioară în
cazul celulelor HOB și NDHF. Valorile înregistrate au fost, în speță pentru HOS R2=0,753,
pentru HOB R2=0,83 iar pentru NDHF R2=0,82. Din aceste rezultate, putem concluziona că,
pentru celulele tumorale HOS și pentru celulele cu fenotip normal utilizate în prezentul
experiment, testele metabolice de viabilitate și proliferare celulară au dat rezultate corelate, cu
excepția liniei MCF10A care este recunoscută a fi o linie pretențioasă la care condițiile de
testare pot influența ușor viabilitatea. În cazul acestei linii R2=0,56. Astfel, în testarea
citotoxicității unor biomateriale se pot utiliza ambele tipuri de teste, cu un grad crescut de
confidență, dar alegerea testului de elecție se ba orienta spre tipul materialului de testat și pe
eventualele interferențe pe care le pot determina asupra activității celulelor testate.
Pentru corelația între testele SytoxGreen (de cuantificare numerică a celulelor viabile)
și CyQuant, modificările multiplicării numărului de celule evaluate cu testul SytoxGreen au
fost raport cu variația multiplicării cantității de ADN, evaluată prin testul CyQuant. În ceea ce
privește corelația rezultatelor, pentru toate liniile celulare luate în studiu și crescute pe
peliculele de chitosan, am remarcat o corelație bună a proliferării celulare (determinată prin
cele două tehnici SytoxGreen care speculează permeabilitatea membranară și CyQuant, de
evaluare a cantității de ADN, 0,87<R2<1). Pentru celulele HOS și NDHF, valorile înregistrate
ale corelațiilor au fost similare. Valorile înregistrate au fost de R2=0,949, pentru NDHF și
R2=0,941 pentru HOS. Corelațiile similare pentru celulele HOS și NDFH arată că aceste
celule, chiar cu fenotip diferit, pot fi utilizate cu succes pentru evaluarea proliferării celulare,
în situația în care se optează pentru unul dintre cele două teste (SytoxGreen sau CyQuant).
13
Test direct versus test indirect
Pentru evaluarea modului de citire a rezultatelor testelor de viabilitate/proliferare care
prezintă un produs de reacție solubilizabil care trebuie interpretat spectrofotometric sau
fluorimetric, am efectuat un experiment care să ilustreze profilul citirilor de
absorbanță/fluorescență în cazul citirilor directe, în godeul unde s-a efectuat experimentul
versus cazul citirilor indirecte, în care un volum din produsul de reacție este transferat într-o
altă placă destinată exclusiv interpretării rezultatelor. În cadrul acestui experiment, am ales
pelicule polimerice de chitosan deacetilat, formate prin depunerea soluției dizolvate în plăci
cu 96 godeuri. Celulele utilizate pentru această evaluare au fost selectate ca și pentru celelalte
teste din experimentele prezentate mai sus: HOS (celule de osteosarcom uman), HOB
(osteoblaste umane), NDHF (fibroblaste dermice umane), MCF10A (celule epiteliale).
Cultivarea și proliferarea celulelor menționate este descrisă la capitolul material și metode.
Testul efectuat pentru determinarea viabilității celulare a fost un test metabolic ieftin și
probabil cel mai des folosit în evaluarea de primă intenție a biomaterialelor cu aplicații
medicale – testul MTT.
Rezultate:
Fig. 5. Rezultatele citirii absorbanțelor pentru metoda directă și indirectă pentru 4
linii celulare (HOS – human osteosarcoma; NDHF – normal dermal human fibroblast; HOB –
human osteoblast; MCF10A – celule fenotip epitelial)
Pentru celulele NDHF, citirile directe au ilustrat o supraestimare a viabilității în cadrul
citirilor directe, probabil prin ușoara acțiune a DMSO folosit la dizolvarea granulelor de
formazan asupra peliculei polimerice folosite. Comparativ, rezultatele urmează același profil,
dar este recomandabilă citirea indirectă pentru o mai apreciere mai corectă a rezultatelor și
mai ales reducerea pe cât posibil a amplitudinii unuia dintre factorii de eroare ai acestui test,
atât de des utilizat. Valorile procentuale ale viabilității estimate prin testul MTT au variat de
la 6,89% pentru viabilitatea estimată la 1 zi de la cultivarea celulelor pe polimer până la
9,64% la 8 zile de cultură.
Toate celelalte evaluări pentru testul MTT în raport cu celulele HOS, HOB, MCF10A
au arătat o supraestimare de citire a absorbanței pentru testul direct. Discrepanța între cele
două tipuri de citire a fost mai importantă în cazul celulelor HOB, probabil datorită
interacțiunilor cu materialul și a unor dificultăți de dizolvare a granulelor de formazan.
14
Influența tipului celular asupra evaluării biocompatibilității unor materiale cu
aplicații medicale
Pentru a demonstra importanța alegerii liniei celulare pentru testele de
biocompatibilitate, am ales cele 4 linii celulare ilustrate la capitolul material și metode - HOS
(celule de osteosarcom uman), HOB (osteoblaste umane), NDHF (fibroblaste dermice
umane), MCF10A (celule epiteliale). Rata cea mai intensă de proliferare se regăsește la
celulele cu fenotip tumoral HOS. Urmează ca rată de proliferare, celulele HOB și NDHF, cu
mențiunea ca fibroblastele dermice umane adoptă o morfologie particulară, cu puncte multiple
de atașare la substrat și cu o inhibiție evidentă de contact după o perioadă de proliferare mai
intensă. Celulele epiteliale normale MCF10A proliferează mai lent și în condiții de cultură
speciale, ilustrate la metode.
Rezultate: Rezultatele evaluării au arătat o viabilitate excelentă a celulelor tumorale
HOS, cu o variație minimă de la 1 la 8 zile (1,13%). Pentru celulele NDHF (utilizate adesea în
testele de evaluare preliminară înainte de realizarea unor modele de testare in vivo la animal
prin implantare subcutanată), variația viabilității între limitele desfășurării experimentului a
fost de 14,48%. Pentru celelalte două linii celulare cu fenotip normal (HOB și MCF10A)
diferențele au fost similare și mai mari decât pentru celelalte două tipuri celulare (34 ,18%
pentru HOB și 34% pentru MCF10A). Fiecare linie celulară răspunde diferit la condițiile de
cultură și de contact cu biomaterialul chiar dacă acesta este biocompatibil. Din datele de mai
sus se observă că același tip de test determină rezultate diferite în funcție de tipul celular
utilizat. Deși utilizarea celulelor cu fenotip tumoral este mai convenabilă, este recomandabilă
alegerea unui tip celular corespunzător aplicației specifice a materialului de testat precum și
respectarea unor condiții de testare cât mai apropiate de mediul de utilizare a materialului. Se
observă că acele celule mai sensibile au tendința de a da rezultate subestimate odată cu
creșterea duratei studiului. Am extins durata experimentelor la 8 zile pentru a ilustra această
evoluție și pentru a recomanda, în concluzie, timpi de evaluare de 1-4 zile.
Numărul celulelor utilizate în testele de viabilitate.
Un parametru important și adesea ignorat este numărul de celule utilizabil pentru
testele efectuate pe biomateriale pentru evidențierea biocompatibilității.
Fig. 6. Profilul proliferativ al celulelor osteoblastice cu fenotip tumoral (HOS) și fenotip
normal (HOB) în funcție de densitatea celulară de distribuție pe biomaterialul polimeric depus
în godeurile unei plăci cu 96 godeuri. Error bars – Confidence interval 95%
15
Valorile numerice pentru celulele cu fenotip tumoral crescute pe pelicule sunt
apropiate dar ușor inferioare celor din godeurile de control (fără pelicule). Creșterea densității
celulare la însămânțarea pe biomaterial peste aceste valori în godeurile plăcilor de 96 poate
duce la o interpretare eronată mai ales pentru testele metabolice (care au și așa numeroase
surse de eroare internă, așa cum au subliniat experimentele de mai sus).
Influența condiționării biomaterialului de evaluat asupra rezultatelor testelor de
biocompatibilitate
Pentru materialele cu consistență crescută, condiționarea respectă norme bine-
cunoscute și statutate în standardele de biocompatibilitate. Există însă situații particulare, în
care condiționarea materialului de testat poate pune probleme de viabilitate celulară, probleme
care nu sunt relaționate cu natura materialului ci cu modul de efectuare a experimentului. Este
obiectivul prezentului experiment, de a demonstra importanța modului de dezvoltare a unui
experiment de biocompatibilitate în funcție de condiționarea materialului de lucru.
Pentru experimentul de față am ales ca material de studiu titanul, recunoscut a fi un
biomaterial de elecție atât pentru implantologia orală cât și pentru biomateriale în domeniul
ortopediei. Pentru a diferenția clar condițiile de lucru, am ales discuri de titan cu diametrul de
1cm pentru prima condiționare și pulbere de titan (Sigma #366994) (particule cu diametrul
mai mic de 40µM), pentru cea de-a doua.
Pentru acest experiment am ales una dintre liniile celulare utilizate și în experimentele
precedente: NDHF fibroblaste dermice umane pentru pulberea metalică. Fibroblastele sunt
utilizate frecvent în testarea materialelor metalice, alături de osteoblaste sau celule de
osteosarcom uman.
Pentru discurile de titan am ales varianta cu aplicarea paralelă a unei linii de celule
normale și una tumorală (HOS/HOB). Aplicarea celulelor pe suprafețele discurilor de Ti a
demonstrat o proliferare bună la suprafață.
Rezultate:
Fig. 7. Proliferarea celulelor HOS la suprafața discurilor de Ti în două momente consecutive
(4 și 6 zile de cultivare, cu evidențierea celulelor neviabile (dead) și a numărului total de
celule după permeabilizare (total)
16
Ulterior, am analizat comparativ numărul de celule obținut pentru cele două linii
celulare și am observat o creștere accelerată a celulelor cu fenotip tumoral în raport cu cele cu
fenotip normal, date concordante cu rezultatele obținute la cultivarea pe pelicule polimerice.
Profilul proliferativ este relativ linear în primele 3-4 zile, apoi indicele proliferativ este
diminuat proporțional pentru liniile normală și tumorală, prin suprapopularea suprafeței de
testat.
Adaptarea dimensiunilor probei de testat la contextul experimental este esențială.
Pentru a ilustra importanța acestui eveniment, adesea ignorat, am evaluat viabilitatea celulară
pentru celule tumorale (indice proliferativ crescut, pentru a vizualiza mai bine diferențele de
proliferare) pentru discurile de Ti de 10mm în diferite plăci de cultură în care acestea pot fi
conținute, anume plăci cu 6, 12 și 24 godeuri. De asemenea, pentru a ilustra supraaprecierea
viabilității în cazul utilizării numai a unui simplu test metabolic în plăci diferite, am folosit o
metodă de izolare a suprafeței de lucru. Astfel, în jumătate din godeurile de lucru, am utilizat
o tehnică de imobilizare a materialului de testat astfel încât celulele să poată adera și prolifera
numai la suprafața materialului de testat. Este cunoscut faptul că, celulele aderente nu sunt
viabile dacă nu descoperă, în timp util de la distribuția lor pe o suprafață, zone de aderență
unde să se ancoreze și să prolifereze. Celulele HOS sunt astfel de celule, aderente și cu un
indice de proliferare crescut, specific celulelor tumorale (celule osteosarcom uman).
Montajul experimental a constat în amplasarea pieselor de testat (discuri de Ti cu
diametrul de 10mm) în godeurile unor plăci cu 6, 12 și respectiv 24 godeuri. În jumăta te din
godeurile folosite din fiecare placă pentru experiment, piesa a fost lăsată liberă iar în cealaltă
jumătate, piesele au fost imobilizate cu ajutorul unei pelicule de agaroză. Agaroza este un
substrat la care celulele nu aderă și de la suprafața căreia pot fi îndepărtate ușor prin spălare
ușoară. Am preparat o soluție de agaroză 1,5% (wt/vol) prin combinarea a 0,15g agaroză
(Sigma #A9539) cu 10 mL PBS steril. Amestecul a fost plasat în cuptorul cu microunde și
adus în 30 de secunde aproape de punctul de fierbere, dar fără a-l atinge. Ulterior, după
dizolvarea completă a agarozei, vasul cu soluția de agaroză a fost menținut pe o placă
încălzită la 85°C pentru împiedicarea unei gelificări premature. Se distribuie agaroza rapid
pentru a nu se gelifia înainte de a realiza o peliculă în jurul și în contact cu discul metalic,
astfel încât nivelul superior al agarozei să fie la nivelul suprafeței libere (de contact cu
celulele) a discului de testat.
Rezultatele privind viabilitatea (exprimată aici nu procentual din control deoarece
variațiile ar fi fost insesizabile ci în unități de densitate optică la citirea absorbanței) prezintă
variații pentru plăcile cu godeuri supradimensionate în raport cu eșantionul de testat. Astfel, în
godeurile plăcilor de 6 se observă o supraevaluare a viabilității/proliferării exprimată prin
valori mai mari ale densității optice măsurate prin absorbanță. Aceste valori corespund unei
cantități mai mari de formazan, produsă în godeurile fără agaroză în raport cu cele în care
suprafața activă de testat s-a rezumat numai la suprafața propriu-zisă a discului de titan (diam
10mm). Celulele care se răspândesc pe lângă eșantion și care proliferează pe plasticul
godeului influențează clar rezultatul final al evaluării realizate. De altfel, valorile absorbanței
în godeurile în care s-a amplasat numai proba sunt mai mici decât cele din godeurile control
(unde s-au amplasat numai celule și mediu, fără eșantion metalic) deoarece, în primul caz,
probele acoperă o anumită suprafață a godeului și mai efectuează și mișcări la manipularea
plăcii, ceea ce afectează numărul celulelor viabile. Valorile rezultate din testul MTT pentru
constructul cu stabilizatorul din agaroză sunt mai mici, dar în același timp sunt mai apropiate
de realitatea biologică, celulele a căror viabilitate ne interesează fiind doar cele în contact
imediat cu materialul. Având în vedere că pentru plăcile cu 24 godeuri, spațiul dintre eșantion
și pereții godeului este suficient de mare pentru a permite schimbul de mediu și manipularea
fără afectarea suprafeței de testat și având în vedere că acest spațiu este suficient de mic încât
să nu altereze valorile densității optice în raport cu martorul, se recomandă utilizarea acestor
plăci fără constructul de agaroză. Practic este recomandată utilizarea unor godeuri cu
17
dimensiuni cât mai apropiate de dimensiunile eșantionului pentru a permite atât manipularea
facilă cât și o evaluare coerentă a numărului de celule cu un test de viabilitate ieftin.
Am remarcat o viabilitate extrem de redusă pentru experimentul în care celulele au
fost co-incubate și practic dispuse în godeuri în același timp cu particulele pulberii de Ti. Din
rezultatele viabilităților la 24 și 48 de ore se constată că pentru testarea unor astfel de
materiale este necesară o abordare diferită. Astfel, competiția pentru substratul de aderență
(plastic) determină în acest caz moartea celulară în proporții accentuate. Rata viabilității a fost
foarte redusă chiar și pentru concentrații reduse de pulbere de Ti. Acest lucru se poate datora
nu numai competiției pentru substratul de aderență (particulele fiind primele care se depun pe
fundul godeului împiedică aderența fibroblastelor) ci și prin afectarea ciclului multiplicativ și
interferenței cu sistemele de endocitoză/fagocitoză ale celulelor.
Pentru a evidenția vizual evenimentele la 48 ore de la co-incubare, am realizat imagini
în microscopie de contrast de fază și fluorescență după aplicarea testului cu SytoxGreen (în
plăcile unui experiment paralel, cu același număr de celule/godeu și aceleași concentrații de
pulbere de Ti).
200l MC + 50g/mL Ti
200l MC + 20g/mL Ti
200l MC + 10g/mL Ti
200l MC + 5g/mL Ti
Fig. 8. Morfologia (microscopie contrast fază) și viabilitatea (SytoxGreen – în verde celule
neviabile) celulelor NDHF co-incubate cu pulbere de Ti în diferite concentrații
Se observă paucitatea celulelor aderate și cu o morfologie specifică fibroblastelor
viabile la suprafața godeului. Cu cât concentrația particulelor de Ti a fost mai mare, cu atât
viabilitatea a fost mai redusă, fapt evidențiat de marcarea cu SytoxGreen (care pătrunde
18
numai în celulele neviabile sau cu permeabilitate membranară compromisă. Astfel, tehnica de
co-incubare a celulelor cu biomateriale metalice condiționate ca pulberi nu este indicată.
Testarea indirectă (prin difuziune) a biocompatibilității unor biomateriale
În general citotoxicitatea poate fi evaluată prin conctactul direct dintre celule și
biomaterialul de studiu sau indirect, după incubarea materialului pentru o perioadă
determinată de timp cu mediu de cultură specific celulelor cu care se va lucra.
Rezultatele evaluării comparative a citotoxicității unor materiale prin testul cu
membrană filtrantă versus aplicarea lichidului de extracție, pentru materiale metalice și
polimerice sunt prezentate în continuare.
Fig. 9. Evaluarea citotoxicității comparativ prin testul cu membrană filtrantă versus aplicarea
lichidului de extracție pentru minidiscuri de Ti. Error bars – Confidence interval 95%
Realizarea testului cu ajutorul constructului cu membrane de acetat de celuloză este
mai simplă și presupune un număr redus de manipulări, diminuând potențialele diluții și
alterări ulterioare ale celulelor, alterări care nu sunt corelate cu testul în sine efectuat.
Membranele sunt situate în permanență la aceeași distanță de materialul de testat, sunt ușor de
prelevat și de testat cu diferite kituri de evaluare a viabilității prin simplul transfer într-o nouă
placă cu godeuri. Din momentul transferului și până la efectuarea propriu-zisă a testului,
timpul scurs trebuie minimizat pe cât posibil.
Tipul celular utilizat în testarea biomaterialelor este un punct sensibil și deseori
ignorat în cadrul proceselor de evaluare a biocompatibilității. Evaluarea biomaterialelor cu
potențiale aplicații medicale (în special ortopedice) utilizează linii celulare diferite. Astfel,
folosirea de linii celulare diferite duce adesea la obținerea de rezultate diferite (134). De
exemplu, folosirea a două linii celulare diferite de osteosarcom și cultivarea lor pe compuși cu
hidroxiapatit determină expresia unor proteine de adezivitate, în timp ce folosirea celulelor
stem mezenchimale din măduva osoasă exprimă altă categorie de proteine de adezivitate. Deși
celulele MG63 aparțin unei linii tumorale, fiind osteoblaste relativ imature dar cu trăsături de
osteoblaste formatoare de os, ele sunt folosite frecvent în teste de adezivitate proliferare și
diferențiere la suprafața biomaterialelor datorită unei expresii constante a unor markeri
specifici. Celulele mezenchimale stromale primare derivate din variate țesuturi dar în special
din măduvă osoasă sunt utilizate extensiv pentru explorarea capacității biomaterialelor de
formare a osului. Utilizarea celulelor derivate din celulele stromale mezenchimale cum ar fi
celulele stem mezenchimale induse este destul de rară.
Din experiența descrisă mai sus, rezultă că un test de cuantificare a ATP (test de
integritate membranară) este o necesitate în evaluarea modernă a biocompatibilității.
În cazul în care se dorește evaluarea directă a numărului de celule viabile la suprafața
materialului, se recomandă testul SytoxGreen care nu este deloc mai scump ci doar puțin mai
laborios la citirea și interpretarea rezultatelor, acolo unde este nevoie de două citiri, una
pentru celulele neviabile și una cu numărul total de celule neviabile după permeabilizarea cu
detergent.
Astfel, apare ca deosebit de importantă alegerea tipului celular, nu numai în raport cu
potențiala aplicație tisulară a biomaterialului de studiat dar și cu potențialul proliferativ al
celulei și cu tipul de test de viabilitate/proliferare utilizat.
19
8. TESTE DE MIGRARE LA SUPRAFAȚĂ PENTRU EVALUAREA
BIOCOMPATIBILITĂȚII – EVALUARE COMPARATIVĂ
Motivația studiului
Migrarea celulară este un eveniment care, combinat cu potențialul proliferativ
caracterizează statusul fiziologic celular. Procesele de migrare celulară sunt prezente într-o
gamă largă de procese fiziologice, de la dezvoltare embrionară la regenerare tisulară sau
vindecare a leziunilor. Pentru evaluarea proliferării ȘI migrării celulare la suprafața
biomaterialelor am efectuat o serie de experimente pentru a demonstra importanța adaptării
metodelor cunoscute la condițiile experimentale. De asemenea, am realizat, în colaborare cu
colectivul de la disciplina Biologie Celulară și Moleculară, UMF Iași, un dispozitiv simplu de
realizare a testului de cicatrizare, dispozitiv experimental pe care l-am testat pentru
proliferarea și migrarea celulară la suprafața unor pelicule polimerice cunoscute a fi
biocompatibile (pentru certificarea funcționalității acestui construct). Motivația producerii și
testării acestui dispozitiv a fost reprezentată de alterarea suprafețelor biomaterialelor de testat
prin „zgârierea” cu vârful de pipetă precum și de prețul prohibitiv al unor produse similare.
Pentru biomaterialele cu acoperiri delicate, pentru cele polimerice sensibile, dispozitivul
artizanal propus este ideal pentru testarea migrării celulare, deoarece respectă mecanic și
chimic suprafața de contact cu eșantionul de testat.
Sistem artizanal de realizare a testului de cicatrizare
Fig. 10. Dop siliconic artizanal, decupat lateral, într-o placă de 96 godeuri
Pentru al doilea model de dop, tuburile de turnare au fost manufacturate prin turnare și
au prezentat un fund rectangular, cu laturile de 3mm/1mm.
Toate dopurile de silicon au fost sterilizate prin autoclavare la 120°C iar potențiala
toxicitate a fost testată prin testul MTT. Dopurile realizate s-au dovedit a fi non-citotoxice
pentru incubări de 5-7 zile. În consecință, am aplicat aceste dopuri artizanale în experimentele
următoare.
Test de cicatrizare simplu combinat cu evaluarea proliferării celulare prin testul
cu SytoxGreen
Pentru efectuarea testului de cicatrizare la suprafața unor biomateriale polimerice de
testat, am decis să efectuez o comparație între rezultatele testului clasic prin zgârierea
monostratului celular și aplicarea dispozitivului artizanal din silicon tehnic sterilizat (dop
circular). Am folosit pelicule de chitosan depuse în godeuri după metoda precizată într-un
capitol anterior
În cazul peliculelor transparente, metoda este relativ simplă, iar constructul artizanal
are avantajul de a oferi o zonă de dehiscență uniformă, cu o suprafață ușor de calculat.
Tehnica de zgâriere prezintă dezavantajul potențialei afectări mecanice a peliculei de testat,
fapt care alterează clar rezultatele.
20
Rezultate:
Fig. 11. Evaluare comparativă a ariei cicatrizate (scratch – zgâriere versus dop artizanal
rotund – circular stopper). Error bars - Confidence interval 95%
Din analiza ariilor de cicatrizare se observă că, inițial, dar mai ales la 24 de ore, ratele
de ocluzie sunt diferite, în favoarea sistemului cu dop circular. La 36 de ore, valorile de
cicatrizare sunt apropiate dar net în favoarea sistemului artizanal cu dop circular. Fără
îndoială, există sisteme comerciale care funcționează după un principiu similar, dar în cazul
sistemului experimentat în această lucrare, prețul este de circa 50 de ori mai mic. Importantă
însă este recomandarea de a renunța la efectuarea testului de cicatrizare prin zgâriere în cazul
testelor care explorează migrarea celulară pe suprafețe polimerice ale unor biomateriale cu
potențiale aplicații biomedicale. Testul cu opritor este mult mai fiabil și oferă rezultate de
acoperire mai bune și mai apropiate de realitate.
În comparație cu produsele disponibile comercial, constructul artizanal prezintă o serie
de avantaje – este netoxic pentru perioada relativ scurtă de incubare cu celulele, este ușor
customizabil dimensional, se poate autoclava și prezintă un preț de producție extrem de redus.
Astfel, produsele disponibile comercial sunt fie pentru plăci cu godeuri mai mari (plăci cu 24
godeuri CBA-120 CytoSelect™ 24-well Wound Healing Assay, CellBiolabs Cambridge, UK)
și cu dimensiune fixă (nu pot fi utilizate pentru testarea unor discuri metalice cu grosime de 1
mm), fie pentru godeuri de 96 dar cu profil exclusiv rotund. În plus, preturile acestor sisteme
la producător este absolut prohibitiv (500 euro o placă de 24 și 300 euro inserturile cu dop
rotund). Evident însă, pentru o standardizare și utilizare în evaluări de screening, sunt
necesare teste mecanice și ameliorări tehnice. Având în vedere posibilitățile actuale de
printare 3D, aceste detalii pot fi ușor rezolvate.
9. PREPARAREA ȘI TESTAREA UNUI SUPORT POLIMERIC POROS
FUNCȚIONALIZAT PENTRU PROLIFERAREA CELULARĂ
Motivația studiului
În această parte a tezei, am propus, alături de colectivul Disciplinei de Biologie
Celulară și Moleculară de la UMF Iași, funcționalizarea și evaluarea biocompatibilității unui
biomaterial polimeric sintetic, cu potențiale aplicații în terapia regenerativă.
Ideea originală a acestui experiment a fost aceea de a realiza un suport spumat
(microporos) de PVA fosforilat realizat printr-o procedură modificată și de a-i testa
biocompatibilitatea prin cele mai fiabile metode, selectate în lumina rezultatelor din studiile
comparative precedente.
21
Gradul de umflare a hidrogelului analizat crește odată cu reducerea cantității de
reticulant (glutaraldehidă) și mai ales procesul de umflare continuă și după 3 ore, moment
care reprezintă pragul limită de umflare pentru utilizarea unui grad de reticulare crescut. După
acest prag, în special pentru hidrogelul cu grad de reticulare redus, gradul de umflare scade
într-o măsură importantă. Dimensiunile porilor reprezintă un element important în generarea
unui suport poros pentru sisteme celulare. Dimensiunile medii ale porilor nu trebuie să fie
prea mari (>500µM) și nici prea mici, pentru a permite celulelor o migrare convenabilă în
interiorul acestui construct. Analiza spumelor în stare uscată și parțial hidratată în microscopie
electronică de baleiaj a demonstrat o reducere a dimensiunii porilor în cadrul procesului de
hidratare.
PPVA poros uscat PPVA parțial hidratat
Fig. 12. Variații ale dimensiunilor porilor în funcție de starea de hidratare la spuma PPVA
Analiza imagistică a porozității pentru cele două tipuri de spume a demonstrat o distribuție
mai omogenă a porilor pentru compoziția 1:1 decât pentru varianta 2:1. În schimb, traveele de
suport ale porilor au fost mai groase la compoziția 2:1 față de cea 1:1, putând favoriza mai
ușor aderența celulară.
Ca și dimensiuni medii, porii au variat mult între cele două compoziții. Dacă pentru
compoziția 2:1 dimensiunile porilor au variat între 2-51µM (valori măsurate pe un eșantion de
imagine), pentru materialul 1:1 dimensiunile au fost mult mai mari, variind între 4-51µM.
Pentru ca materialul să fie permisiv pentru celule, dimensiunile porilor trebuie să depășească
30 de microni și astfel, materialul 1:1 pare cel mai indicat pentru o dezvoltare ulterioară a
unor pori mai mari, element potențial realizabil prin varierea raportului HCl:CaCO3.
După determinarea generală a structurii și morfologiei spumelor de PPVA, etapa
următoare a constat în evaluarea biocompatibilității in vitro.
Testul de hemoliză
Am observat din graficele rezultate că hemocompatibilitatea pentru materialul
PPVA:CaCO3 2:1 este mai apropiată de controlul negativ decât materialul 1:1 și implicit este
încă un argument, alături de dimensiunile porilor, pentru utilizarea în teste de contact cu linii
celulare cu fenotip osteoblastic.
Estimarea viabilității celulare prin măsurarea absorbției și difuziei luminii sau analiza
directa in sistem FSS/SSC
Determinarea viabilității celulare este necesară pentru decelarea biocompatibilității
materialelor de testat. O metodă simplă și fiabilă de a evalua viabilitatea celulară este
excluderea unui colorant fluorescent. Iodura de propidiu (PI) este un fluorofor impermeabil
pentru celulele viabile în timp ce penetrează celulele neviabile, cuplându-se la ADN dublu-
catenar. PI este excitat de radiațiile cu lungime de undă de 488 nm și are o emisie maximă la
22
617 nm. Rezultatele au arătat o viabilitate foarte bună pentru ambele materiale în contact cu
celulele osteoblast-like, toate datele fiind raportate la controalele negative
Fig. 13. Rezultatele viabilității celulare (HOS) exprimată procentual și determinată prin
analiza FACS cu PI pentru materialele PPVA 1:1 și 2:1
Evaluarea biocompatibilității spumelor PPVA prin teste de inhibiție de contact
Pentru testele de inhibiție de contact, am realizat un experiment simplu în plăci cu 6
godeuri în care am amplasat 3 mL mediu de cultură MEM complet (10%FCS, 1% penicilină -
streptomicină, 1%Glutamax) și 1x106 celule HOS (osteosarcom uman) împreună cu probe de
1x1x1 cm din materialele de studiu. Pregătirea celulelor, cultivarea, proliferarea, detașarea și
numărarea au fost descrise la capitolul material și metode. Imaginile preluate la 72 de ore de
la incubare arată o proliferare celulară bună în imediat contact cu cele două materiale depuse
în godeurile plăcii de 6. Densitatea celulară pare ușor mai crescută în imediat contact cu
materialul de studiat. Realizarea testelor de viabilitate cu ajutorul kiturilor CellTiterBlue (pe
bază de resazurină-resorufină) și CellTiterGlo (pe bază de dozare chemiluminometrică a ATP)
au determinat obținerea de rezultate similare, cele două tipuri de spume prezentând o
biocompatibilitate foarte bună.
Fig. 14. Evaluarea comparativă a viabilității spumelor PPVA prin testul resazurină-resorufină
23
Fig. 15. Evaluarea comparativă a viabilității spumelor PPVA prin testul de dozare a ATP
Viabilitatea celulară pentru materialul PPVA 2:1 a variat de la 97,84% la 24 de ore la
92,46% la 72 de ore, ușoara reducere a viabilității în raport cu godeurile de control fiind
datorată relativ ușoarei acidifieri observată în experimentul de determinare a evoluției pH-ului
în timp.
Viabilitatea celulară în contact cu materialul PPVA 1:1 a variat de la 96,77% la 24 de
ore la 90,31% la 72 de ore. Reducerea procentuală a viabilității a fost puțin mai accentuată
decât la materialul PPVA 2:1, dar se menține la valori deosebit de ridicate (în jur de 90%).
În concluzie, viabilitatea celulară pentru celule osteoblast-like la 24 și 72 de ore este
foarte bună și recomandă utilizarea materialului produs ca și suport poros pentru proliferare
celulară și eventuala utilizare în terapia regenerativă.
Testarea in vivo este importantă pentru testarea biomaterialelor deoarece testele in
vitro nu pot înlocui testele in vivo (la testele in vitro nu se poate evalua răspunsul inflamator,
influenţa asupra sistemului imun, remodelarea tisulară).
Testele in vivo furnizează date despre interacţiunea a diferitelor tipuri de celule,
despre efectele factorilor hormonali, despre interacţiunile cu matricea extracelulară şi cele cu
celulele sanguine, proteinele ţi alte molecule din organism.
Testele suplimentare referitoare la viabilitatea celulară în contact cu materialul evaluat
au adus informații complementare utile în perspectiva utilizării acestuia ca și suport pentru
ingineria tisulară. Testele de hemocompatibilitate determină relația imediată a materialului cu
celulele sângelui iar testele de citotoxicitate completează tabloul biocompatibilității. Testele
utilizate au fost selectate dintre cele evaluate în capitolul precedent, fiind cele care au cele mai
puține surse de eroare. Ca urmare a acestor evaluări, am putut realiza diferențele între cele
două compoziții testate, din punct de vedere al biocompatibilității. În consecință, pentru
testele mai sofisticate și costisitoare au putut fi selectate numai probele cu un indice de
biocompatibilitate mai important. Apare astfel ca foarte importantă o etapizare a aplicări
testelor de viabilitate disponibile în vederea evaluării cât mai coerente a unui biomaterial cu
potențiale aplicații în domenii biomedicale (inginerie tisulară).
24
10. CONCLUZII FINALE
1. Studiul bibliografic demonstrează că testele MTT si MTS domină topul metodelor de
evaluare a viabilității/proliferării celulare, în timp ce testele WST-1 (272 citări),
AlamarBlue (resazurina – 134 citări), PicoGreen (30 citări) și CyQuant (94 citări). Pentru
testarea biomaterialelor, am obținut date diferite și interesante – am remarcat utilizarea
aproape exclusivă a testului MTT (1437 rezultate) față de celelalte variante, mai
performante sau mai puțin toxice pentru celule (testele MTS (174 rezultate), WST-1 (85
rezultate), XTT (66 rezultate) și CCK-8 (51 rezultate), LDH (275 rezultate), CyQuant (13
rezultate), PicoGreen (33 rezultate)).
2. Testele care utilizează celule aderente sunt, în mod evident, cele mai utile pentru
evaluarea biocompatibilității unor materiale care au potențial de utilizare în contact direct
cu țesuturile umane.
3. Testul MTT deși este cel mai frecvent utilizat în testarea biocompatibilității
biomaterialelor, deoarece prezintă un cost redus de utilizare, prezintă inconvenientul unui
timp de incubare de 1-4 ore )cu creșterea toxicității compusului asupra celulelor) și al
dependenței de variațiile pH. De asemenea, testul MTT este un marker al intensității
metabolice a celulelor vii și doar indirect (sau aproape deloc) un marker al proliferării
celulare.
4. Testele pe bază de resazurină-resorufină utilizate pentru determinarea biocompatibilității
pun probleme la citirea și interpretarea viabilității celulare. Incubarea peste 4 ore
determină efecte citotoxice, existând, de asemenea, inconvenientul unor
manipulări/incubări care impietează asupra unei eventuale proceduri de screening.
5. Testele de evaluare a viabilității prin determinarea cantității de ATP sunt fiabile dar
influențate de o serie de factori. La un număr de 2 - 4 recongelări, compusul reconstituit
pierde din fiabilitatea răspunsului și rezultatele sunt alterate. Compoziția mediului de
cultură și prezența roșului-fenol influențează interpretarea rezultatelor biocompatibilității.
Tipurile de plăci utilizate la interpretarea rezultatelor sunt esențiale pentru validitatea
datelor prin prezența diferitelor tipuri de interferențe.
6. Din testele de evaluare a biocompatibilității pe baza integrității membranare, testul cu PI
nu este recomandat nici pentru materiale metalice nici pentru cele polimerice, testul cu
albastru tripan realizează o supraevaluare a viabilității, fiind util numai pentru numărarea
celulelor care vor fi aplicate pe materialele de studiu.
7. Testele de aderență și migrare beneficiază de kiturile fluorescente Cell Tracker care pot
extinde durata testului pe 4 maxim 5 zile, pentru o menținere a fluorescenței în limitele
unei interpretări corecte, interpretare care nu trebuie să influențeze efectul eventual toxic
al biomaterialului de studiat. Testele cu cell tracker nu sunt utile pentru materiale care ar
putea elimina amine si tioli.
8. Pentru testarea biocompatibilității unor pulberi (metalice, metalice acoperite, particule,
nanoparticule) este necesar ca aceste eșantioane de testat să fie adăugate după obținerea
subconfluenței celulare în godeurile de test.
9. Evaluarea citotoxicității prin utilizarea metodei indirecte (cu utilizarea lichidului de
extracție) nu dă rezultate mulțumitoare, mai exact viabilitatea celulară este supraevaluată.
Pentru testele de aderență și migrare celulară se recomandă a renunța la efectuarea testului
de cicatrizare prin zgâriere în cazul testelor care explorează migrarea celulară pe suprafețe
polimerice ale unor biomateriale cu potențiale aplicații biomedicale. Testul cu opritor este
mult mai fiabil și oferă rezultate de acoperire mai bune și mai apropiate de realitate.
Constructul artizanal realizat în cadrul tezei este netoxic pentru perioada relativ scurtă de
incubare cu celulele, este ușor customizabil dimensional, se poate autoclava și prezintă un
preț de producție extrem de redus în raport cu produsele existente pe piață.
10. S-ar recomanda aplicarea unui test de citotoxicitate combinat cu explorare imagistică și
cuantificare. Eventual explorare imagistică SEM.
25
11. Un studiu personal s-a finalizat cu obținerea unui material bazat pe un polimer
biodegradabil, cu o structură poroasă demonstrată, util ca de suport pentru proliferarea
celulară a celulelor cu fenotip osteoblastic. Materialul descris a fost caracterizat fizico-
chimic și biologic și testat după metodele considerate cele mai fiabile ca urmare a
studiului precedent. Rezultatele au arătat o bună biocompatibilitate a spumei produse și un
potențial de dezvoltare pentru un scaffold destinat ingineriei tisulare.
12. Nu există o metodă unică, rapidă, ieftină, cantitativă de evaluare a viabilității la interfața
cu biomaterialul. Este necesară o selectare a metodologiei nu numai în raport cu
rezultatele urmărite ci și cu tipul materialului și costurile estimate ale investigațiilor de
urmat. Soluția ideala rămâne transfecția GFP sau utilizarea unor metode fizice care evită
transfecția.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 1. Wiese KG, Heinemann DE, Ostermeier D, Peters JH. Biomaterial properties and biocompatibility in cell culture of a
novel self-inflating hydrogel tissue expander. J Biomed Mater Res. 2001;54(2):179-88. 2. Lu J, Laudinet J, Williams S. Mechanical stimulation and evaluation of hydrogel biomaterial. Bio-medical materials and
engineering. 2008;18(4-5):335-7.
3. Nishi C, Nakajima N, Ikada Y. In vitro evaluation of cytotoxicity of diepoxy compounds used for biomaterial
modification. J Biomed Mater Res. 1995;29(7):829-34. 4. Kawagoishi N, Nojiri C, Senshu K, Kido T, Nagai H, Kanamori T, et al. In vitro evaluation of platelet/biomaterial
interactions in an epifluorescent video microscopy combined with a parallel plate flow cell. Artificial organs.
1994;18(8):588-95.
5. Ciapetti G, Cenni E, Pratelli L, Pizzoferrato A. In vitro evaluation of cell/biomaterial interaction by MTT assay. Biomaterials. 1993;14(5):359-64.
6. Cenni E, Ciapetti G, Pratelli L, Pizzoferrato A. [In vitro and in vivo evaluation of the blood-biomaterial interaction].
Minerva cardioangiologica. 1992;40(9):297-316.
7. Jacker HJ, Meyer R, Gruttner S. [The toxicologic evaluation of biomaterials. 1. Results of biomaterial tests in cultures of human amnion epithelial cells and human fibroblasts]. Die Pharmazie. 1985;40(7):472-5.
8. Park JB, Lakes RS. Introduction to Biomaterials. Biomaterials: Springer; 1992. p. 1-6.
9. Narayan RJ, Bhaduri SB, Fischman G, Michael Rigsbee J, Zhang X. Next generation biomaterials. Materials Science and Engineering: C. 2007;27(3):345-6.
10. Lakes RS. Biomaterials: an introduction: Springer; 2007.
11. Park JB, Bronzino JD. Biomaterials: principles and applications: crc press; 2002.
12. Park JB, Lakes RS. Metallic implant materials. Biomaterials. 2007:99-137. 13. Lakes R. Composite biomaterials. JD Bronzino, ed. 1995:598-610.
14. Williams D. The relationship between biomaterials and nanotechnology. Biomaterials. 2008;29(12):1737-8.
15. Colvin VL. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature biotechnology. 2003;21(10):1166-
70. 16. Collet D, Lefebvre F, Quentin C, Rabaud M. In vitro studies of elastin-fibrin biomaterial degradation: preservative
effects of protease inhibitors and antibiotics. Biomaterials. 1991;12(8):763-6.
17. Cehreli M. Biomechanics of dental implants : handbook of researchers. Hauppauge, N.Y.: Nova Science; 2011. p. p.
18. McKinney RV, Lemons JE, American Academy of Implant Prosthodontics. The Dental implant : clinical and biological response of oral tissues. Littleton, Mass.: PSG Pub. Co.; 1985. xv, 205 p. p.
19. Caswell CW, Clark AE. Dental implant prosthodontics. Philadelphia: Lippincott; 1991. xvii, 331 p., 2 p. of plates p.
20. Garg AK. Implant dentistry : a practical approach. 2nd ed. Maryland Heights, Mo.: Mosby/Elsevier; 2010. xii, 338 p. p.
21. Pivodova V, Frankova J, Ulrichova J. Osteoblast and gingival fibroblast markers in dental implant studies. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czechoslovakia. 2011;155(2):109-16.
22. Steflik DE, Parr GR, Sisk AL, Lake FT, Hanes PJ, Berkery DJ, et al. Osteoblast activity at the dental implant-bone
interface: transmission electron microscopic and high voltage electron microscopic observations. Journal of
periodontology. 1994;65(5):404-13. 23. Boyd WD, Johnson WE, 3rd, Sultan PK, Deering TF, Matheny RG. Pericardial reconstruction using an extracellular
matrix implant correlates with reduced risk of postoperative atrial fibrillation in coronary artery bypass surgery patients.
The heart surgery forum. 2010;13(5):E311-6.
24. Romanos GE, Schroter-Kermani C, Weingart D, Strub JR. Health human periodontal versus peri-implant gingival tissues: an immunohistochemical differentiation of the extracellular matrix. The International journal of oral &
maxillofacial implants. 1995;10(6):750-8.
25. Zhu Q, Safavi KE, Spangberg LS. Integrin expression in human dental pulp cells and their role in cell attachment on
extracellular matrix proteins. Journal of endodontics. 1998;24(10):641-4. 26. Charoenpanich A, Wall ME, Tucker CJ, Andrews DM, Lalush DS, Loboa EG. Microarray analysis of human adipose-
derived stem cells in three-dimensional collagen culture: osteogenesis inhibits bone morphogenic protein and Wnt
signaling pathways, and cyclic tensile strain causes upregulation of proinflammatory cytokine regulators and angiogenic
factors. Tissue engineering Part A. 2011;17(21-22):2615-27. 27. Meyer U, Meyer T, Schlegel W, Scholz H, Joos U. Tissue differentiation and cytokine synthesis during strain-related
bone formation in distraction osteogenesis. The British journal of oral & maxillofacial surgery. 2001;39(1):22-9.
26
28. Schmalz G, Arenholt-Bindslev D, SpringerLink (Online service). Biocompatibility of Dental Materials. Berlin,
Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg,; 2009. Available from: http://dx.doi.org/10.1007/978-3-540-77782-3.
29. Black J. Biological performance of materials : fundamentals of biocompatibility. 3rd ed. New York: Marcel Dekker;
1999. xii, 463 p. p. 30. Silver FH, Christiansen DL. Biomaterials science and biocompatibility. New York: Springer; 1999. x, 342 p. p.
31. Biocompatibility and performance of medical devices. Philadelphia, PA: Woodhead Pub.; 2012.
32. Ducheyne P. Comprehensive biomaterials. Amsterdam ; Boston: Elsevier; 2011.
33. Williams DF. Biocompatibility of clinical implant materials. Boca Raton, Fla.: CRC Press; 1981. 34. Lamhaut L, Apriotesei R, Combes X, Lejay M, Carli P, Vivien B. Comparison of the accuracy of noninvasive
hemoglobin monitoring by spectrophotometry (SpHb) and HemoCue(R) with automated laboratory hemoglobin
measurement. Anesthesiology. 2011;115(3):548-54.
35. Liddington RC. Structural Aspects of Integrins. I Domain Integrins: Springer; 2014. p. 111-26. 36. Daniel LL, Joyner WL, Singh M, Singh K. Integrins: Implications for Aging in Heart Failure Therapy. Aging and Heart
Failure: Springer; 2014. p. 401-10.
37. Koivisto L, Heino J, Häkkinen L, Larjava H. Integrins in Wound Healing. Advances in Wound Care. 2014.
38. Sun C-C, Qu X-J, Gao Z-H. Integrins: players in cancer progression and targets in cancer therapy. Anti-cancer drugs. 2014;25(10):1107-21.
39. Ruoslahti E, Pierschbacher MD. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 1987;238(4826):491-7.
40. Kishimoto TK, Larson RS, Corbi AL, Dustin ML, Staunton DE, Springer TA. The leukocyte integrins. Advances in
immunology. 1989;46:149-82. 41. McEver RP. Rolling back neutrophil adhesion. Nat Immunol. 2010;11(4):282-4.
42. Bromley SK, Luster AD. Turning up the heat on HEVs. Nature immunology. 2006;7(12):1288-90.
43. Pu F, Williams R, Markkula T, Hunt J. Effects of plasma treated PET and PTFE on expression of adhesion molecules by
human endothelial cells in vitro. Biomaterials. 2002;23(11):2411-28. 44. Klokkevold PR, Vandemark L, Kenney EB, Bernard GW. Osteogenesis enhanced by chitosan (poly-N-acetyl
glucosaminoglycan) in vitro. Journal of periodontology. 1996;67(11):1170-5.
45. Muzzarelli R, Zucchini C, Ilari P, Pugnaloni A, Mattioli Belmonte M, Biagini G, et al. Osteoconductive properties of
methylpyrrolidinone chitosan in an animal model. Biomaterials. 1993;14(12):925-9. 46. Lewinski N, Colvin V, Drezek R. Cytotoxicity of nanoparticles. Small. 2008;4(1):26-49.
47. Nafee N, Schneider M, Schaefer UF, Lehr C-M. Relevance of the colloidal stability of chitosan/PLGA nanoparticles on
their cytotoxicity profile. International journal of pharmaceutics. 2009;381(2):130-9.
48. Strober W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology: John Wiley & Sons, Inc.; 2001.
49. Altman SA, Randers L, Rao G. Comparison of trypan blue dye exclusion and fluorometric assays for mammalian cell
viability determinations. Biotechnology Progress. 1993;9(6):671-4.
50. Brana C, Benham C, Sundstrom L. A method for characterising cell death in vitro by combining propidium iodide staining with immunohistochemistry. Brain research Brain research protocols. 2002;10(2):109-14.
51. Newbold A, Martin BP, Cullinane C, Bots M. Detection of apoptotic cells using propidium iodide staining. Cold Spring
Harbor protocols. 2014;2014(11):pdb prot082545.
52. Hezel M, Ebrahimi F, Koch M, Dehghani F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron. 2012;43(10):1031-8.
53. Fotakis G, Timbrell JA. In vitro cytotoxicity assays: comparison of LDH, neutral red, MTT and protein assay in
hepatoma cell lines following exposure to cadmium chloride. Toxicology letters. 2006;160(2):171-7.
54. Han X, Gelein R, Corson N, Wade-Mercer P, Jiang J, Biswas P, et al. Validation of an LDH assay for assessing nanoparticle toxicity. Toxicology. 2011;287(1):99-104.
55. Jones LJ, Gray M, Yue ST, Haugland RP, Singer VL. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT®
cell proliferation assay. Journal of immunological methods. 2001;254(1):85-98.
56. Meffert RM, Langer B, Fritz ME. Dental implants: a review. Journal of periodontology. 1992;63(11):859-70. 57. Brånemark P, Adell R, Albrektsson T, Lekholm U, Lundkvist S, Rockler B. Osseointegrated titanium fixtures in the
treatment of edentulousness. Biomaterials. 1983;4(1):25-8.
58. Roth BL, Poot M, Yue ST, Millard PJ. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic
acid stain. Applied and environmental microbiology. 1997;63(6):2421-31. 59. Vohra S, Hennessy KM, Sawyer AA, Zhuo Y, Bellis SL. Comparison of mesenchymal stem cell and osteosarcoma cell
adhesion to hydroxyapatite. Journal of materials science Materials in medicine. 2008;19(12):3567-74.
60. Tenstad E, Tourovskaia A, Folch A, Myklebost O, Rian E. Extensive adipogenic and osteogenic differentiation of
patterned human mesenchymal stem cells in a microfluidic device. Lab on a chip. 2010. 61. Ridley AJ, Schwartz MA, Burridge K, Firtel RA, Ginsberg MH, Borisy G, et al. Cell migration: integrating signals from
front to back. Science. 2003;302(5651):1704-9.
62. Liang CC, Park AY, Guan JL. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration
in vitro. Nature protocols. 2007;2(2):329-33. 63. Sreenivasan K. Enhanced drug uptake and retention by surface phosporylated polyvinyl alcohol. Journal of applied
polymer science. 2004;94(2):651-6.
64. Kokubo T, Takadama H. How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity? Biomaterials. 2006;27(15):2907-15.
65. Noe DA, Weedn V, Bell WR. Direct spectrophotometry of serum hemoglobin: an Allen correction compared with a three-wavelength polychromatic analysis. Clinical chemistry. 1984;30(5):627-30.
66. Datta P, Chatterjee J, Dhara S. Phosphate functionalized and lactic acid containing graft copolymer: synthesis and
evaluation as biomaterial for bone tissue engineering applications. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition.
2013;24(6):696-713.
27
Lista lucrărilor publicate sau acceptate la publicare din subiectul tezei de doctorat
1. Comparative assessment of biocompatibility of NiCr and CoCr alloys used in metal-
fused-to-ceramic technology
Autori: Raluca Monica Comăneanu1, Violeta Hancu1, Horia Mihail Barbu1, Costin Coman1,
Cosmin Mihai Cotruț2, Mihail Târcolea2, Ana Maria Holicov3, Alina Ormenișan4
Acknowledgement: All authors had equal contributions. This work was supported by
Partnerships in priority areas program - PN II, developed with support from ANCS, CNDI -
UEFISCDI, project no. 175/02.07.2012 (Coat4Dent).
Aprobat pentru publicare în Revista de Chimie, (ISI, FI = 0,677) vol. 66, nr. 3/2015, aprobare
atașată dosarului.
2. Comparative evaluation of two viability assays on biodegradable polymer foams for
potential bone regeneration
Autori: Ana Maria Holicov, Tudor Petreuș*, Carmen Elena Cotrutz
Romanian Journal of Oral Rehabilitation, (BDI), Vol. 6, No. 1, January - March 2014, pp15-
19.
3. Cell proliferation and migration assay on polymer surfaces Autori: ANA MARIA HOLICOV, TUDOR PETREUȘ*, CARMEN ELENA COTRUTZ
Analele Ştiinţifice ale Universităţii „Alexandru Ioan Cuza”, Secţiunea Genetică şi Biologie
Moleculară, (BDI) TOM XV, 2014, pp. 35-40
http://www.gbm.bio.uaic.ro/index.php/gbm/article/view/1161/1097