UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE „GR. T. POPA” IAŞI

FACULTATEA DE MEDICINĂ

TEZĂ DE DOCTORAT

- REZUMAT -

BIOCOMPATIBILITATEA UNOR BIOMATERIALE

DESTINATE INGINERIEI TISULARE

– MODALITĂŢI DE EVALUARE –

Conducător științific

PROF.UNIV. DR. ELENA CARMEN COTRUTZ

Doctorand

ANA MARIA MANOILESCU (HOLICOV)

IAȘI - 2015

2

CUVINTE CHEIE:

Testarea biocompatilității

Teste de viabiliate/citotoxicitate/proliferare celulară

Inginerie tisulară

3

4

5

6. APLICAREA TESTELOR DE VIABILITATE CELULARĂ / CITOTOXICITATE

ÎN PENTRU EVALUAREA BIOCOMPATIBILITĂȚII BIOMATERIALELOR CU

APLICAȚII MEDICALE – STUDIU BIBLIOGRAFIC

Motivația studiului

Pentru a evidenția importanța studiului comparativ al metodelor de evaluare a

biocompatibilității materialelor cu potențiale aplicații medicale, am efectuat un scurt studiu

bibliografic din care să reiasă numărul de articole publicate în domeniu precum și numărul de

articole care studiază aspecte ale biocompatibilității in vitro și care utilizează diferite metode,

unele dintre ele aplicate sau comparate în prezenta teză de doctorat. Scopul acestui studiu

bibliografic a fost de a releva tipurile de teste de evaluare a biocompatibilității cel mai

frecvent utilizate în publicațiile de profil. Un scop secundar al acestui studiu a fost acela de a

evidenția modul în care testele utilizate pentru evaluarea biocompatibilității (tipul de test,

subcategoria de test) sunt adaptate cerințelor prezentului. Termenii au fost căutați în titlu și

rezumat.

Rezultate

Termenul MTT este în general mai utilizat în literatura de specialitate pentru a defini

testele pe bază de săruri de tetrazoliu. Astfel, pentru termenul „biomaterial tetrazolium” am

obținut 616 rezultate față de 1443 pentru termenul „biomaterial MTT”, ceea ce demonstrează

utilizarea mai frecventă a termenului MTT pentru testele pe bază de săruri de tetrazoliu. În

același timp, căutarea defalcată după clasificarea biomaterialelor pentru termenul „biomaterial

tetrazolium” a determinat valori care, însumate, ajung la valoarea de 499, o diferență notabilă

față de căutarea cu termenul generic.

Explorând subcategoriile de teste metabolice pe bază de săruri de tetrazoliu, am

remarcat utilizarea aproape exclusivă a testului MTT (1437 rezultate) față de celelalte

variante, mai performante sau mai puțin toxice pentru celule (așa cum am demonstrat într-un

experiment ulterior). Majoritatea testelor MTT au fost aplicate materialelor polimerice (935

rezultate), urmate la egală distanță de materialele metalice (263 rezultate) și compozite (160

rezultate). Pentru materialele ceramice, căutarea pentru testul MTT a adus numai 79 rezultate.

Astfel, rezultatele globale per subcategorie de test care utilizează săruri de tetrazoliu

au arătat dominația absolută a testului MTT (1437/1443 în funcție de tipul de căutare pe

terminologie „însumate în funcție de clasificarea biomaterialelor” / „biomaterial MTT”), la

mare distanță se situează rezultatele evaluării biocompatibilității prin alte teste cum ar fi MTS

(174 rezultate), WST-1 (85 rezultate), XTT (66 rezultate) și CCK-8 (51 rezultate).

O căutare similară într-un studiu bibliografic efectuat însă pe motorul de căutare

Google Scholar și pentru teste utilizate în evaluarea viabilității celulelor tumorale, în reviste

cu tematică oncologică (87) a demonstrat că testele MTT si MTS domină și pentru respectiva

tematică, în timp ce testele WST-1 (272 citări), AlamarBlue (resazurina – 134 citări),

PicoGreen (30 citări) și CyQuant (94 citări) sunt în inferioritate.

În concluzie, abordarea prezentului studiu din teza de doctorat este perfect justificată și

regăsește doar puține corespondențe în literatura de specialitate. Se pare că testul cel mai

utilizat în evaluarea biomaterialelor rămâne testul MTT. Chiar dacă variantele sale (teste

metabolice pe bază de săruri de tetrazoliu) sunt disponibile la preturi acceptabile, utilizarea lor

este destul de redusă, insignifiantă chiar în raport cu numărul de citări pentru testul clasic

MTT. Am remarcat unele articole (citate ulterior în teză) care, în ciuda complexității

metodelor de sinteză și evaluare fizico-chimică a unui biomaterial, apelează la metode

simpliste și lipsite de precizie în realizarea testelor de biocompatibilitate in vitro. În capitolul

următor al tezei, am abordat exact acest aspect, evaluarea comparativă a unor teste de

determinare a citotoxicității unor biomateriale cu aplicații biomedicale, cu scopul de a selecta

testele optime pentru astfel de protocoale de lucru.

6

7. EXPLORAREA COMPARATIVĂ A UNOR TESTE DE VIABILITATE/

CITOTOXICITATE/PROLIFERARE CELULARĂ UTILIZATE PENTRU

EVALUAREA BIOCOMPATIBILITĂȚII UNOR BIOMATERIALE CU APLICAȚII

MEDICALE.

Motivația studiului

Având în vedere faptul că în marea majoritate a aplicațiilor clinice/experimental

biologice a biomaterialelor acestea ajung în contact și cu o componentă celulară a unui țesut

sau organ, este importantă definirea metodelor de testare specifice pentru fiecare tip de

eșantion studiat.

Descrierea studiului

Este prezentat modul de aplicare optimă a testelor de citotoxicitate pentru eșantioane

din biomateriale metalice și polimerice. Metodele de testare utilizate au fost subliniate în

capitolul de studiu bibliografic, dar problemele practice ale testării includ și momentul

discuțiilor referitoare la condiționarea biomaterialului.

În prezentul studiu am demonstrat rezultate ale aplicării unor variate teste folosite în

evaluarea biocompatibilității unor biomateriale cu aplicații medicale, alături de realizarea unor

comparații utile în alegerea unui set de teste elocvente pentru scopul propus.

Testele pe care le-am aplicat în evaluarea biocompatibilității unor materiale polimerice

sau metalice sunt enumerate și detaliate, cu expunerea detaliilor de tehnică și adaptărilor

necesare în funcție de tipul de material testat.

Teste metabolice

Cele mai multe metode din această categorie includ, așa cum s-a observat ca și consecință a

studiului bibliografic:

1. teste care exploatează reducerea sărurilor de tetrazoliu;

Am dorit să comparăm evaluarea viabilității a două linii celulare, osteoblaste umane și

celule de osteosarcom uman, cu ajutorul acestor două kituri. Inițial am testat sensibilitatea

kitului CCK-8 pe două linii celulare osoase (HOS (ostesarcom uman) și HOB (osteoblaste

umane) descrise în capitolul material și metode, des utilizate pentru testarea

biocompatibilității materialelor cu aplicabilitate medicală (în special materialele destinate

implanturilor osoase, plăcilor de osteosinteză cu/fără acoperiri speciale).

Rezultate: Pentru linia celulară tumorală, absorbanța variază linear cu concentrația

numărului de celule până la 5x105 celule per godeu (concentrația maximă testată), fapt datorat

probabil activității metabolice mult mai intense decât pentru celulele normale. Referitor la

comparația între fiabilitatea testului MTT și CCK-8 (deși fac parte din aceeași categorie,

descrisă în introducerea acestui experiment), am realizat o comparație între sensibilitățile

celor două teste atât pe celule tumorale cât și celule normale.

Influența pH-ului asupra rezultatelor testelor metabolice de viabilitate/proliferare/

citotoxicitate tip MTT Am decis efectuarea de unui experiment care să ilustreze variațiile în reducerea

sărurilor de tetrazoliu, comparativ pentru materiale polimerice neutre și ușor acide și de

asemenea pentru celule cu fenotip normal versus celule cu fenotip tumoral.

Rezultate: Așa cum au arătat și alți autori, dar pe celule tumorale, de obicei mai

rezistente la variații de pH, capacitatea celulară de reducere a formazanului (celule HepG2 –

carcinom hepatic) dispare la un pH de 5,9, pentru o incubare de 72 ore. Sub pH de 5,

capacitatea de reducere a formazanului dispare, atât pentru celulele incubate pentru o durată

redusă la pHul respectiv (sub 5) sau o durată prelungită la 72 de ore. În experimentul efectuat,

durata incubării a fost de la 24 la 192 ore. Atât acidifierea mediului prin incubarea prelungită

fără schimbarea mediului cât și aciditatea latentă a polimerului celulozic testat au determinat o

incapacitate de reducere a formazanului pentru ambele tipuri celulare testate. Testul MTT, în

7

ciuda avantajelor determinate de costul redus sau de timpul redus de lucru (în cazul kitului

CCK-8), prezintă inconvenientul unui timp de incubare de 1-4 ore (de obicei incubarea de 1

oră nu prezintă rezultate consistente, iar incubarea prelungită crește toxicitatea compusului

asupra celulelor) și, de asemenea, al dependenței de variațiile de pH. Este așadar important de

precizat, atunci când este cazul, modul de evoluție a pHului în mediul de incubare pentru

materialul de testat.

2. Teste pe bază de resazurină/resorufină – testul CellTiterBlue;

Testele bazate pe principiul transformării resazurinei în resorufină sunt similare celor

din categoria MTT, implicit sunt teste metabolice. Acest gen de teste aduce ca și avantaj

posibilitatea de cuantificare a resorufinei produse, de obicei această cantitate fiind

proporțională cu numărul de celule viabile. Cuantificarea resorufinei se poate face și prin

evaluarea absorbanței, dar această metodă nu este folosită în mod curent, deoarece evaluarea

fluorimetrică este mult mai sensibilă.

Evaluarea toxicității testului Cell TiterBlue

Pentru a evidenția acest elemente și în cazul utilizării kitului CellTiterBlue, am utilizat

pentru testarea unor pelicule de chitosan (normal total biocompatibile), două linii celulare

(una normală – HOB, una tumorală – HOS, protocoalele fiind identice ca pentru testarea cu

kiturile MTT și CCK-8).

Rezultate: Am observat o diferență de intensitate a fluorescenței în funcție de mediul

de cultură utilizat și de timpul de incubare.

Astfel, o extensie a timpului de incubare dincolo de 4 ore a determinat efecte toxice

evidente asupra celulelor cultivate pe peliculele de chitosan. Valorile RLU (unități de

luminiscență, proporționale direct cu viabilitatea celulară) au scăzut după 4 ore de incubare,

rămânând semnificative la 6 ore dar suferind o prăbușire bruscă la toate citirile mai mari de 8

ore de incubare. În același

timp, viabilitatea celulelor

din setul control (celule

HOS netratate cu

resazurină) a crescut în

timp și valorile RLU au

crescut exponențial,

corespunzător cu

proliferarea celulară.

Efectele toxice ale

resazurinei au fost

evidențiate și prin

observație microscopică în

contrast de fază.

Morfologia celulară se

modifică de la 1 la 4 ore de

expunere la reactiv,

celulele devenind rotunde,

semn de suferință celulară

accentuată. Modificările

sunt evidente la 24 de ore,

majoritatea celulelor

adoptând morfologia

sferică. Această morfologie

corespunde cu indicii de

viabilitate foarte reduși,

evidențiați cu ajutorul

kitului ATPGlo.

8

3. Testul de detectare a producției de ATP (test metabolic)

Testele de determinare a proliferării/viabilității celulare care exploatează activitatea

luciferazei sunt din ce în ce mai răspândite și utilizate și în teste de screening. ATP este un

marker extrem de util în aprecierea viabilității celulare. Acest sistem de testare este foarte

avantajos deoarece este omogen, bazându-se pe o reducere a numărului de manevre aplicat

plăcii de cultură în care se realizează testul de viabilitate. Un alt avantaj al utilizării testelor pe

bază de detectare a ATP prin chemiluminiscență este reprezentat de sensibilitatea mult mai

mare decât a testelor pe bază de tetrazoliu sau resazurină. Am testat comparativ viabilitatea cu

kiturile avute la dispoziție pentru două linii celulare (HOB și HOS, descrise mai sus,

proliferate și însămânțate după protocoalele descrise pe larg la materiale și metode) și pentru

cele două tipuri de pelicule utilizate în comparațiile testelor pe bază de săruri de tetrazoliu.

Rezultate:

Factori care influențează rezultatele testului pe baza detectării ATP

- temperatura: O etapă de congelare/decongelare nu afectează consistent rezultatele

testului. Ulterior însă, de la 2 la 4 recongelări, compusul reconstituit pierde din fiabilitatea

răspunsului și rezultatele sunt alterate. Așadar, atunci când nu se lucrează detectări de

viabilitate la scară largă și care ar impune utilizarea întregului volum reconstituit de 10mL

reactiv CellTiterGlo, este utilă și accesibilă aliquotarea acestui reactiv în vederea utilizării

raționale pentru experimente la scară redusă.

- compuși chimici care pot rezulta din degradarea parțială a biomaterialului de

studiu (în special micro/nanoparticule, hidrogeluri, scaffolduri); orice compus chimic care

influențează sau realizează depleția ATP poate modifica rezultatele acestui test. Am observat,

pentru concentrații de ATP între 1nM-10mM o reducere semnificativă a luminiscenței pentru

mediul cu roșu fenol și glucoză. Sensibilitatea maximală a fost notată pentru mediul de cultură

fără roșu fenol și fără glucoză, pentru concentrații de ATP între 10nm-10µM. La concentrații

ale ATP peste 100µM, rezultatele au fost uniforme. Având în vedere că în intervalele de

studiu în care modificările sensibilității testului sunt semnificative se încadrează marea

majoritate a probelor biologice, în funcție de sensibilitatea de care avem nevoie în realizarea

testului de biocompatibilitate, vom folosi mediul adecvat experimentului.

- tipul de placă utilizat la citirea reacției luminiscente. Pentru citirea rezultatelor la

testul CellTiterGlo, având în vedere realizarea lizei celulare, din volumele de lizat din

godeurile de lucru se preiau 40µL care sunt plasați în godeurile unei plăci de cultură cu 384

godeuri, cu pereți opaci, albi și fundul opac, producător Greiner. Spațierea godeurilor de citire

este singura soluție pentru evitarea fenomenului de cross-talk. Soluția este facilă din punct de

vedere al designului experimental, dar este un coșmar din punct de vedere practic, pentru că

pipetările se realizează manual pentru a respecta spațierea între godeuri. Din acest motiv, nu

se poate utiliza o pipeta multicanal în acest caz.

Teste de evaluare a integrității membranare includ dar nu se limitează la:

- testul de excludere cu albastru tripan;

- testul de includere a iodurii de propidiu

- testul cu roșu neutru

- testul de evaluare a pierderii de LDH

- testul cu SytoxGreen

Rezultate

Testul cu albastru tripan este util numai pentru numărarea celulelor care vor fi aplicate

pe materialele de studiu. Acea etapă rămâne una obligatorie în testarea unui biomaterial,

indiferent de natura acestuia.

Am testat remanența PI pentru celule aderente la suprafața unui biomaterial metalic

pentru o durată de 4 ore. Am remarcat că intensitatea marcării cu PI scade accelerat și

cuantificarea celulelor la un anumit interval este dificilă și presupune multe erori de

9

interpretare. Astfel, testul cu PI nu este recomandat pentru evaluarea biocompatibilității, nici

pentru materiale metalice nici polimerice.

Explorarea citotoxicității biomaterialelor cu aplicații medicale prin teste time-

course versus teste end-point Sondele fluorescente tip CellTracker sunt utile în evaluarea motilității și localizării

celulare la suprafața sau în volumul unui biomaterial. Probele CellTracker sunt non-toxice și

disponibile într-o gamă largă de fluorofori care pot fi alese în funcție de echipamentul de

citire disponibil (combinație laseri/filtre). Prin proprietățile lor chimice, aceste probe permit

co-localizare cu anticorpi și alte probe de investigare a comportamentului celular (exemplu –

alte sonde fluorescente pentru componente subcelulare). Sondele CellTracker sunt excelente

pentru monitorizarea proliferării celulare, migrării, fenomenelor chemotaxice și invazivității

celulare. Sondele pot traversa membranele biologice cu ușurință, ceea ce le face incorporabile

în celulele vii, fără a afecta viabilitatea sau expresia fenotipică a acestora (citare articol

celltracker fluor probes). Deoarece structura chimică a sondelor presupune transformarea lor

în produși care nu mai pot traversa membranele intacte, aceștia rămân localizați intracelular.

Fig. 1. Profilul de intensitate medie a fluorescenței pentru 3 tipuri de sonde fluroescente în

comparație cu profilul similar al Sytox Green, pentru un experiment de cultivare a celulelor

HOS pe pelicule polimerice PPVA-colagen pentru durate variabile de incubare (1-8 zile).

Profilul intensităților medii ale fluorescențelor sondelor studiate variază atât între ele

dar mai ales în comparație cu stabilitatea SytoxGreen. Este de menționat însă că reactivul

SytoxGreen nu pătrunde decât în celulele cu o permeabilitate a membranei afectată iar astfel

acest test este util în configurația descrisă la material și metode (evaluarea numărului total de

celule viabile prin substracția numărului de celule evaluate în etapele experimentului din

valoarea totală a celulelor obținută prin permeabilizare cu un detergent). Aceleași observații

sunt valabile și pentru celelalte variante de sonde fluorescente, cu mențiunea că pentru sonda

CTG extincția a fost mai lentă iar intensitatea fluorescenței a prezentat valori mai ridicate

decât în cazul CTB. CTG este util ca sondă individuală pentru evaluarea proliferării celulare

în cadrul testelor de biocompatibilitate dar pune probleme de interpretare în cazul folosirii

combinate cu alte sisteme de detectare a unor procese patologice, deoarece cele mai fiabile

sunt cuplate cu un fluorofor în aceeași parametri de exitație/emisie.

Pentru urmărirea individuală a proliferării celulare la suprafața unor probe de

biomateriale mecanice, CTG devine o recomandare, mai ales pentru testele cu durată de 4 -5

zile. În cazul în care există dorința și posibilitatea de a cupla această marcare cu alte teste care

să evidențieze procese patologice care ilustrează toxicitatea materialului, se recurge la sondele

10

CTB sau cel mai bine la sondele CTR cu varianta CTFR (far-red). Aceasta din urmă prezintă

o suprapunere spectrală minimă cu majoritatea fluoroforilor, neinterferând nici cu o eventuală

fluorescență intrinsecă a materialului de testat. Pentru sonda CTR am remarcat o preferință

pentru celulele NDHF care au prezentat o intensitate a marcării aproape egală cu cea pentru

CTG, dar numai până în ziua a 3-a de marcare.

Practic acest gen de marcare recomandă o durată a testului de 4 maxim 5 zile, pentru o

menținere a fluorescenței în limitele unei interpretări corecte, interpretare care nu trebuie să

influențeze efectul eventual toxic al biomaterialului de studiat. Testele cu cell tracker nu sunt

utile pentru materiale care ar putea elimina amine și tioli.

Testele de evaluare a cantității de ADN

Conținutul în acizi nucleici al unui volum de solvit în care se regăsesc celule (lizate)

este un indicator fidel al numărului de celule din respectivul volum. Mai multe teste de

proliferare speculează această proprietate; din variantele cunoscute, cităm aici testul CyQuant,

descris la material și metode și utilizat în prezentul material de studiu și testul PicoGreen.

Pentru evaluarea modului în care celulele depuse pe pelicule polimerice în plăci de

polistiren clare cu 96 godeuri (Corning) proliferează și se dezvoltă, am testat 4 linii celulare și

anume – fibroblaste dermice umane (NDHF), celule de osteosarcom uman (HOS), celule

osteoblastice normale (HOB) și celule epiteliale MCF10A. Metodele de cultivare, prol iferare

și detașare pentru pasaje sunt descrise la capitolul materiale și metode. În prezentul

experiment, numărul de celule a pornit de la 3x104 pentru ziua 0. Ulterior, am apreciat

valorile de multiplicare a cantității de ADN pentru fiecare godeu.

Aplicarea testului CyQuant NF pentru cele 4 linii celulare a permis analiza în timp real

a datelor pentru cele 8 zile ale experimentului. La finele acestuia, am interpretat și corelat

datele obținute pentru viabilitatea celulară pe pelicule de chitosan.

Pentru a compara și corela testele metabolice de apreciere a viabilității celulare cu

testele de evaluare a cantității de ADN în același scop, am aplicat, pe aceleași pelicule

polimerice folosite la testul CyQuant (pelicule de chitosan) și testele MTT și CellTiterBlue.

Rezultatele au fost din nou variabile în funcție de tipul celular folosit. Activitatea

metabolică a fost mai intensă și implicit evaluarea numărului de celule a fost mai importantă

pe măsura progresiei în timp a experimentului. Astfel, numărul estimat de celule HOS a

prezentat valori ale multiplicării celulare de la 3,2 la 9,87 ori, fapt care diferă semnificativ de

profilul estimat de aprecierea cantității de ADN realizată de testul CyQuant. Chiar evoluția

de-a lungul celor 8 zile de experiment a fost diferită, testul MTT prezentând abateri mai

importante de la evoluția teoretică linear ascendentă. De altfel, testul MTT, pe lângă

problemele de tehnică și interpretare semnalate mai sus, în raport cu materialul de testat,

evaluează activitatea metabolică celulară și, pe baza acesteia realizează a aproximare a

viabilității și proliferării celulare. Lanțul de aprecieri induce, fără îndoială, destule erori.

Deși este mult mai sensibil decât testul MTT, evoluția este de multe ori non-lineară,

variațiile numărului de celule raportat la rezultatele testului CyQuant fiind destul de mari.

Corelații între rezultatele variatelor metode de evaluare a biocompatibilității

Metodele de detectare a viabilității/proliferării celulare în cadrul unor teste de evaluare

a biocompatibilității unor materiale cu aplicabilitate în domeniul biomedical au fost prezentate

mai sus. Având în vedere multitudinea de aspecte care trebuie luate în considerare pentru

fiecare metodă în parte, am realizat o comparație între testele metabolice și cele de detectare a

conținutului ADN respectiv cele care speculează integritatea membranară pentru a determina

viabilitatea/proliferarea. Comparația a fost realizată între variațiile numărului de celule pentru

testele metabolice și variațiile conținutului de ADN pentru testele specifice (de detectare a

acizilor nucleici). Pentru testele care speculează integritatea membranară, s-a realizat direct

variația numărului de celule (așa cum s-a descris în capitolul material și metode, tehnica

SytoxGreen).

11

Având în vedere că observațiile comparative dintre aceste teste sunt pur vizuale, am

efectuat o evaluare de corelație între rezultatele acestor teste, pentru cele 4 linii celulare luate

în studiu și pentru peliculele de chitosan, ca biomaterial de studiu.

Evaluarea nivelului de corelație dintre valorile de multiplicare ale numărului de celule

pentru testele MTT și CellTiterBlue și multiplicarea cantității de ADN pentru testul CyQuant

s-a realizat prin tehnica celor mai mici pătrate, in Excel. Nu am ales o tehnică statistică prea

sofisticată, deoarece testul dorește doar să evidențieze corelațiile între cele două tipuri de

teste, pentru a putea opta ușor în cazul evaluării compatibilității unui biomaterial.

Rezultate:

Fig. 2. Corelații între estimarea proliferării celulare prin testele MTT și CyQuant pentru 4

linii celulare (HOS – human osteosarcoma; NDHF – normal dermal human fibroblast; HOB –

human osteoblast; MCF10A – celule fenotip epitelial).

Fig. 3. Corelații între estimarea proliferării celulare prin testele MTT și CellTiterBlue pentru

4 linii celulare (HOS – human osteosarcoma; NDHF – normal dermal human fibroblast; HOB

– human osteoblast; MCF10A – celule fenotip epitelial)

12

Fig. 4. Corelații între estimarea proliferării celulare prin testele SytoxGreen și CyQuant

pentru 4 linii celulare (HOS – human osteosarcoma; NDHF – normal dermal human

fibroblast; HOB – human osteoblast; MCF10A – celule fenotip epitelial)

Am remarcat, pentru celulele cu fenotip tumoral (HOS) dar și pentru fibroblastele

dermice (NDHF) crescute pe peliculele de chitosan, o bună corelație a proliferării celulare

(determinată prin tehnica MTT) cu evoluția cantității de ADN (0,7<R2<1). O corelație

similară s-a remarcat și pentru celulele NDHF (R2=0,908). Deși pare ciudat, fibroblastele

dermice au un profil corelat pentru testele metabolice și cele de detecție a ADN, posibil

datorită modului de creștere, a suprafeței atinse (sunt celule aderente cu o geometrie și cu

expansiuni ale membranei total diferite de celulele tumorale.

În ceea ce privește corelația rezultatelor, pentru toate celulele studiate, cu excepția

liniei epiteliale MCF10A, crescute pe peliculele de chitosan, am observat o corelație bună a

proliferării celulare (determinată prin cele două tehnici metabolice, MTT și CellTiterBlue -

0,75<R2<1). Pentru celulele HOS, valoarea înregistrată a corelației a fost ușor inferioară în

cazul celulelor HOB și NDHF. Valorile înregistrate au fost, în speță pentru HOS R2=0,753,

pentru HOB R2=0,83 iar pentru NDHF R2=0,82. Din aceste rezultate, putem concluziona că,

pentru celulele tumorale HOS și pentru celulele cu fenotip normal utilizate în prezentul

experiment, testele metabolice de viabilitate și proliferare celulară au dat rezultate corelate, cu

excepția liniei MCF10A care este recunoscută a fi o linie pretențioasă la care condițiile de

testare pot influența ușor viabilitatea. În cazul acestei linii R2=0,56. Astfel, în testarea

citotoxicității unor biomateriale se pot utiliza ambele tipuri de teste, cu un grad crescut de

confidență, dar alegerea testului de elecție se ba orienta spre tipul materialului de testat și pe

eventualele interferențe pe care le pot determina asupra activității celulelor testate.

Pentru corelația între testele SytoxGreen (de cuantificare numerică a celulelor viabile)

și CyQuant, modificările multiplicării numărului de celule evaluate cu testul SytoxGreen au

fost raport cu variația multiplicării cantității de ADN, evaluată prin testul CyQuant. În ceea ce

privește corelația rezultatelor, pentru toate liniile celulare luate în studiu și crescute pe

peliculele de chitosan, am remarcat o corelație bună a proliferării celulare (determinată prin

cele două tehnici SytoxGreen care speculează permeabilitatea membranară și CyQuant, de

evaluare a cantității de ADN, 0,87<R2<1). Pentru celulele HOS și NDHF, valorile înregistrate

ale corelațiilor au fost similare. Valorile înregistrate au fost de R2=0,949, pentru NDHF și

R2=0,941 pentru HOS. Corelațiile similare pentru celulele HOS și NDFH arată că aceste

celule, chiar cu fenotip diferit, pot fi utilizate cu succes pentru evaluarea proliferării celulare,

în situația în care se optează pentru unul dintre cele două teste (SytoxGreen sau CyQuant).

13

Test direct versus test indirect

Pentru evaluarea modului de citire a rezultatelor testelor de viabilitate/proliferare care

prezintă un produs de reacție solubilizabil care trebuie interpretat spectrofotometric sau

fluorimetric, am efectuat un experiment care să ilustreze profilul citirilor de

absorbanță/fluorescență în cazul citirilor directe, în godeul unde s-a efectuat experimentul

versus cazul citirilor indirecte, în care un volum din produsul de reacție este transferat într-o

altă placă destinată exclusiv interpretării rezultatelor. În cadrul acestui experiment, am ales

pelicule polimerice de chitosan deacetilat, formate prin depunerea soluției dizolvate în plăci

cu 96 godeuri. Celulele utilizate pentru această evaluare au fost selectate ca și pentru celelalte

teste din experimentele prezentate mai sus: HOS (celule de osteosarcom uman), HOB

(osteoblaste umane), NDHF (fibroblaste dermice umane), MCF10A (celule epiteliale).

Cultivarea și proliferarea celulelor menționate este descrisă la capitolul material și metode.

Testul efectuat pentru determinarea viabilității celulare a fost un test metabolic ieftin și

probabil cel mai des folosit în evaluarea de primă intenție a biomaterialelor cu aplicații

medicale – testul MTT.

Rezultate:

Fig. 5. Rezultatele citirii absorbanțelor pentru metoda directă și indirectă pentru 4

linii celulare (HOS – human osteosarcoma; NDHF – normal dermal human fibroblast; HOB –

human osteoblast; MCF10A – celule fenotip epitelial)

Pentru celulele NDHF, citirile directe au ilustrat o supraestimare a viabilității în cadrul

citirilor directe, probabil prin ușoara acțiune a DMSO folosit la dizolvarea granulelor de

formazan asupra peliculei polimerice folosite. Comparativ, rezultatele urmează același profil,

dar este recomandabilă citirea indirectă pentru o mai apreciere mai corectă a rezultatelor și

mai ales reducerea pe cât posibil a amplitudinii unuia dintre factorii de eroare ai acestui test,

atât de des utilizat. Valorile procentuale ale viabilității estimate prin testul MTT au variat de

la 6,89% pentru viabilitatea estimată la 1 zi de la cultivarea celulelor pe polimer până la

9,64% la 8 zile de cultură.

Toate celelalte evaluări pentru testul MTT în raport cu celulele HOS, HOB, MCF10A

au arătat o supraestimare de citire a absorbanței pentru testul direct. Discrepanța între cele

două tipuri de citire a fost mai importantă în cazul celulelor HOB, probabil datorită

interacțiunilor cu materialul și a unor dificultăți de dizolvare a granulelor de formazan.

14

Influența tipului celular asupra evaluării biocompatibilității unor materiale cu

aplicații medicale

Pentru a demonstra importanța alegerii liniei celulare pentru testele de

biocompatibilitate, am ales cele 4 linii celulare ilustrate la capitolul material și metode - HOS

(celule de osteosarcom uman), HOB (osteoblaste umane), NDHF (fibroblaste dermice

umane), MCF10A (celule epiteliale). Rata cea mai intensă de proliferare se regăsește la

celulele cu fenotip tumoral HOS. Urmează ca rată de proliferare, celulele HOB și NDHF, cu

mențiunea ca fibroblastele dermice umane adoptă o morfologie particulară, cu puncte multiple

de atașare la substrat și cu o inhibiție evidentă de contact după o perioadă de proliferare mai

intensă. Celulele epiteliale normale MCF10A proliferează mai lent și în condiții de cultură

speciale, ilustrate la metode.

Rezultate: Rezultatele evaluării au arătat o viabilitate excelentă a celulelor tumorale

HOS, cu o variație minimă de la 1 la 8 zile (1,13%). Pentru celulele NDHF (utilizate adesea în

testele de evaluare preliminară înainte de realizarea unor modele de testare in vivo la animal

prin implantare subcutanată), variația viabilității între limitele desfășurării experimentului a

fost de 14,48%. Pentru celelalte două linii celulare cu fenotip normal (HOB și MCF10A)

diferențele au fost similare și mai mari decât pentru celelalte două tipuri celulare (34 ,18%

pentru HOB și 34% pentru MCF10A). Fiecare linie celulară răspunde diferit la condițiile de

cultură și de contact cu biomaterialul chiar dacă acesta este biocompatibil. Din datele de mai

sus se observă că același tip de test determină rezultate diferite în funcție de tipul celular

utilizat. Deși utilizarea celulelor cu fenotip tumoral este mai convenabilă, este recomandabilă

alegerea unui tip celular corespunzător aplicației specifice a materialului de testat precum și

respectarea unor condiții de testare cât mai apropiate de mediul de utilizare a materialului. Se

observă că acele celule mai sensibile au tendința de a da rezultate subestimate odată cu

creșterea duratei studiului. Am extins durata experimentelor la 8 zile pentru a ilustra această

evoluție și pentru a recomanda, în concluzie, timpi de evaluare de 1-4 zile.

Numărul celulelor utilizate în testele de viabilitate.

Un parametru important și adesea ignorat este numărul de celule utilizabil pentru

testele efectuate pe biomateriale pentru evidențierea biocompatibilității.

Fig. 6. Profilul proliferativ al celulelor osteoblastice cu fenotip tumoral (HOS) și fenotip

normal (HOB) în funcție de densitatea celulară de distribuție pe biomaterialul polimeric depus

în godeurile unei plăci cu 96 godeuri. Error bars – Confidence interval 95%

15

Valorile numerice pentru celulele cu fenotip tumoral crescute pe pelicule sunt

apropiate dar ușor inferioare celor din godeurile de control (fără pelicule). Creșterea densității

celulare la însămânțarea pe biomaterial peste aceste valori în godeurile plăcilor de 96 poate

duce la o interpretare eronată mai ales pentru testele metabolice (care au și așa numeroase

surse de eroare internă, așa cum au subliniat experimentele de mai sus).

Influența condiționării biomaterialului de evaluat asupra rezultatelor testelor de

biocompatibilitate

Pentru materialele cu consistență crescută, condiționarea respectă norme bine-

cunoscute și statutate în standardele de biocompatibilitate. Există însă situații particulare, în

care condiționarea materialului de testat poate pune probleme de viabilitate celulară, probleme

care nu sunt relaționate cu natura materialului ci cu modul de efectuare a experimentului. Este

obiectivul prezentului experiment, de a demonstra importanța modului de dezvoltare a unui

experiment de biocompatibilitate în funcție de condiționarea materialului de lucru.

Pentru experimentul de față am ales ca material de studiu titanul, recunoscut a fi un

biomaterial de elecție atât pentru implantologia orală cât și pentru biomateriale în domeniul

ortopediei. Pentru a diferenția clar condițiile de lucru, am ales discuri de titan cu diametrul de

1cm pentru prima condiționare și pulbere de titan (Sigma #366994) (particule cu diametrul

mai mic de 40µM), pentru cea de-a doua.

Pentru acest experiment am ales una dintre liniile celulare utilizate și în experimentele

precedente: NDHF fibroblaste dermice umane pentru pulberea metalică. Fibroblastele sunt

utilizate frecvent în testarea materialelor metalice, alături de osteoblaste sau celule de

osteosarcom uman.

Pentru discurile de titan am ales varianta cu aplicarea paralelă a unei linii de celule

normale și una tumorală (HOS/HOB). Aplicarea celulelor pe suprafețele discurilor de Ti a

demonstrat o proliferare bună la suprafață.

Rezultate:

Fig. 7. Proliferarea celulelor HOS la suprafața discurilor de Ti în două momente consecutive

(4 și 6 zile de cultivare, cu evidențierea celulelor neviabile (dead) și a numărului total de

celule după permeabilizare (total)

16

Ulterior, am analizat comparativ numărul de celule obținut pentru cele două linii

celulare și am observat o creștere accelerată a celulelor cu fenotip tumoral în raport cu cele cu

fenotip normal, date concordante cu rezultatele obținute la cultivarea pe pelicule polimerice.

Profilul proliferativ este relativ linear în primele 3-4 zile, apoi indicele proliferativ este

diminuat proporțional pentru liniile normală și tumorală, prin suprapopularea suprafeței de

testat.

Adaptarea dimensiunilor probei de testat la contextul experimental este esențială.

Pentru a ilustra importanța acestui eveniment, adesea ignorat, am evaluat viabilitatea celulară

pentru celule tumorale (indice proliferativ crescut, pentru a vizualiza mai bine diferențele de

proliferare) pentru discurile de Ti de 10mm în diferite plăci de cultură în care acestea pot fi

conținute, anume plăci cu 6, 12 și 24 godeuri. De asemenea, pentru a ilustra supraaprecierea

viabilității în cazul utilizării numai a unui simplu test metabolic în plăci diferite, am folosit o

metodă de izolare a suprafeței de lucru. Astfel, în jumătate din godeurile de lucru, am utilizat

o tehnică de imobilizare a materialului de testat astfel încât celulele să poată adera și prolifera

numai la suprafața materialului de testat. Este cunoscut faptul că, celulele aderente nu sunt

viabile dacă nu descoperă, în timp util de la distribuția lor pe o suprafață, zone de aderență

unde să se ancoreze și să prolifereze. Celulele HOS sunt astfel de celule, aderente și cu un

indice de proliferare crescut, specific celulelor tumorale (celule osteosarcom uman).

Montajul experimental a constat în amplasarea pieselor de testat (discuri de Ti cu

diametrul de 10mm) în godeurile unor plăci cu 6, 12 și respectiv 24 godeuri. În jumăta te din

godeurile folosite din fiecare placă pentru experiment, piesa a fost lăsată liberă iar în cealaltă

jumătate, piesele au fost imobilizate cu ajutorul unei pelicule de agaroză. Agaroza este un

substrat la care celulele nu aderă și de la suprafața căreia pot fi îndepărtate ușor prin spălare

ușoară. Am preparat o soluție de agaroză 1,5% (wt/vol) prin combinarea a 0,15g agaroză

(Sigma #A9539) cu 10 mL PBS steril. Amestecul a fost plasat în cuptorul cu microunde și

adus în 30 de secunde aproape de punctul de fierbere, dar fără a-l atinge. Ulterior, după

dizolvarea completă a agarozei, vasul cu soluția de agaroză a fost menținut pe o placă

încălzită la 85°C pentru împiedicarea unei gelificări premature. Se distribuie agaroza rapid

pentru a nu se gelifia înainte de a realiza o peliculă în jurul și în contact cu discul metalic,

astfel încât nivelul superior al agarozei să fie la nivelul suprafeței libere (de contact cu

celulele) a discului de testat.

Rezultatele privind viabilitatea (exprimată aici nu procentual din control deoarece

variațiile ar fi fost insesizabile ci în unități de densitate optică la citirea absorbanței) prezintă

variații pentru plăcile cu godeuri supradimensionate în raport cu eșantionul de testat. Astfel, în

godeurile plăcilor de 6 se observă o supraevaluare a viabilității/proliferării exprimată prin

valori mai mari ale densității optice măsurate prin absorbanță. Aceste valori corespund unei

cantități mai mari de formazan, produsă în godeurile fără agaroză în raport cu cele în care

suprafața activă de testat s-a rezumat numai la suprafața propriu-zisă a discului de titan (diam

10mm). Celulele care se răspândesc pe lângă eșantion și care proliferează pe plasticul

godeului influențează clar rezultatul final al evaluării realizate. De altfel, valorile absorbanței

în godeurile în care s-a amplasat numai proba sunt mai mici decât cele din godeurile control

(unde s-au amplasat numai celule și mediu, fără eșantion metalic) deoarece, în primul caz,

probele acoperă o anumită suprafață a godeului și mai efectuează și mișcări la manipularea

plăcii, ceea ce afectează numărul celulelor viabile. Valorile rezultate din testul MTT pentru

constructul cu stabilizatorul din agaroză sunt mai mici, dar în același timp sunt mai apropiate

de realitatea biologică, celulele a căror viabilitate ne interesează fiind doar cele în contact

imediat cu materialul. Având în vedere că pentru plăcile cu 24 godeuri, spațiul dintre eșantion

și pereții godeului este suficient de mare pentru a permite schimbul de mediu și manipularea

fără afectarea suprafeței de testat și având în vedere că acest spațiu este suficient de mic încât

să nu altereze valorile densității optice în raport cu martorul, se recomandă utilizarea acestor

plăci fără constructul de agaroză. Practic este recomandată utilizarea unor godeuri cu

17

dimensiuni cât mai apropiate de dimensiunile eșantionului pentru a permite atât manipularea

facilă cât și o evaluare coerentă a numărului de celule cu un test de viabilitate ieftin.

Am remarcat o viabilitate extrem de redusă pentru experimentul în care celulele au

fost co-incubate și practic dispuse în godeuri în același timp cu particulele pulberii de Ti. Din

rezultatele viabilităților la 24 și 48 de ore se constată că pentru testarea unor astfel de

materiale este necesară o abordare diferită. Astfel, competiția pentru substratul de aderență

(plastic) determină în acest caz moartea celulară în proporții accentuate. Rata viabilității a fost

foarte redusă chiar și pentru concentrații reduse de pulbere de Ti. Acest lucru se poate datora

nu numai competiției pentru substratul de aderență (particulele fiind primele care se depun pe

fundul godeului împiedică aderența fibroblastelor) ci și prin afectarea ciclului multiplicativ și

interferenței cu sistemele de endocitoză/fagocitoză ale celulelor.

Pentru a evidenția vizual evenimentele la 48 ore de la co-incubare, am realizat imagini

în microscopie de contrast de fază și fluorescență după aplicarea testului cu SytoxGreen (în

plăcile unui experiment paralel, cu același număr de celule/godeu și aceleași concentrații de

pulbere de Ti).

200l MC + 50g/mL Ti

200l MC + 20g/mL Ti

200l MC + 10g/mL Ti

200l MC + 5g/mL Ti

Fig. 8. Morfologia (microscopie contrast fază) și viabilitatea (SytoxGreen – în verde celule

neviabile) celulelor NDHF co-incubate cu pulbere de Ti în diferite concentrații

Se observă paucitatea celulelor aderate și cu o morfologie specifică fibroblastelor

viabile la suprafața godeului. Cu cât concentrația particulelor de Ti a fost mai mare, cu atât

viabilitatea a fost mai redusă, fapt evidențiat de marcarea cu SytoxGreen (care pătrunde

18

numai în celulele neviabile sau cu permeabilitate membranară compromisă. Astfel, tehnica de

co-incubare a celulelor cu biomateriale metalice condiționate ca pulberi nu este indicată.

Testarea indirectă (prin difuziune) a biocompatibilității unor biomateriale

În general citotoxicitatea poate fi evaluată prin conctactul direct dintre celule și

biomaterialul de studiu sau indirect, după incubarea materialului pentru o perioadă

determinată de timp cu mediu de cultură specific celulelor cu care se va lucra.

Rezultatele evaluării comparative a citotoxicității unor materiale prin testul cu

membrană filtrantă versus aplicarea lichidului de extracție, pentru materiale metalice și

polimerice sunt prezentate în continuare.

Fig. 9. Evaluarea citotoxicității comparativ prin testul cu membrană filtrantă versus aplicarea

lichidului de extracție pentru minidiscuri de Ti. Error bars – Confidence interval 95%

Realizarea testului cu ajutorul constructului cu membrane de acetat de celuloză este

mai simplă și presupune un număr redus de manipulări, diminuând potențialele diluții și

alterări ulterioare ale celulelor, alterări care nu sunt corelate cu testul în sine efectuat.

Membranele sunt situate în permanență la aceeași distanță de materialul de testat, sunt ușor de

prelevat și de testat cu diferite kituri de evaluare a viabilității prin simplul transfer într-o nouă

placă cu godeuri. Din momentul transferului și până la efectuarea propriu-zisă a testului,

timpul scurs trebuie minimizat pe cât posibil.

Tipul celular utilizat în testarea biomaterialelor este un punct sensibil și deseori

ignorat în cadrul proceselor de evaluare a biocompatibilității. Evaluarea biomaterialelor cu

potențiale aplicații medicale (în special ortopedice) utilizează linii celulare diferite. Astfel,

folosirea de linii celulare diferite duce adesea la obținerea de rezultate diferite (134). De

exemplu, folosirea a două linii celulare diferite de osteosarcom și cultivarea lor pe compuși cu

hidroxiapatit determină expresia unor proteine de adezivitate, în timp ce folosirea celulelor

stem mezenchimale din măduva osoasă exprimă altă categorie de proteine de adezivitate. Deși

celulele MG63 aparțin unei linii tumorale, fiind osteoblaste relativ imature dar cu trăsături de

osteoblaste formatoare de os, ele sunt folosite frecvent în teste de adezivitate proliferare și

diferențiere la suprafața biomaterialelor datorită unei expresii constante a unor markeri

specifici. Celulele mezenchimale stromale primare derivate din variate țesuturi dar în special

din măduvă osoasă sunt utilizate extensiv pentru explorarea capacității biomaterialelor de

formare a osului. Utilizarea celulelor derivate din celulele stromale mezenchimale cum ar fi

celulele stem mezenchimale induse este destul de rară.

Din experiența descrisă mai sus, rezultă că un test de cuantificare a ATP (test de

integritate membranară) este o necesitate în evaluarea modernă a biocompatibilității.

În cazul în care se dorește evaluarea directă a numărului de celule viabile la suprafața

materialului, se recomandă testul SytoxGreen care nu este deloc mai scump ci doar puțin mai

laborios la citirea și interpretarea rezultatelor, acolo unde este nevoie de două citiri, una

pentru celulele neviabile și una cu numărul total de celule neviabile după permeabilizarea cu

detergent.

Astfel, apare ca deosebit de importantă alegerea tipului celular, nu numai în raport cu

potențiala aplicație tisulară a biomaterialului de studiat dar și cu potențialul proliferativ al

celulei și cu tipul de test de viabilitate/proliferare utilizat.

19

8. TESTE DE MIGRARE LA SUPRAFAȚĂ PENTRU EVALUAREA

BIOCOMPATIBILITĂȚII – EVALUARE COMPARATIVĂ

Motivația studiului

Migrarea celulară este un eveniment care, combinat cu potențialul proliferativ

caracterizează statusul fiziologic celular. Procesele de migrare celulară sunt prezente într-o

gamă largă de procese fiziologice, de la dezvoltare embrionară la regenerare tisulară sau

vindecare a leziunilor. Pentru evaluarea proliferării ȘI migrării celulare la suprafața

biomaterialelor am efectuat o serie de experimente pentru a demonstra importanța adaptării

metodelor cunoscute la condițiile experimentale. De asemenea, am realizat, în colaborare cu

colectivul de la disciplina Biologie Celulară și Moleculară, UMF Iași, un dispozitiv simplu de

realizare a testului de cicatrizare, dispozitiv experimental pe care l-am testat pentru

proliferarea și migrarea celulară la suprafața unor pelicule polimerice cunoscute a fi

biocompatibile (pentru certificarea funcționalității acestui construct). Motivația producerii și

testării acestui dispozitiv a fost reprezentată de alterarea suprafețelor biomaterialelor de testat

prin „zgârierea” cu vârful de pipetă precum și de prețul prohibitiv al unor produse similare.

Pentru biomaterialele cu acoperiri delicate, pentru cele polimerice sensibile, dispozitivul

artizanal propus este ideal pentru testarea migrării celulare, deoarece respectă mecanic și

chimic suprafața de contact cu eșantionul de testat.

Sistem artizanal de realizare a testului de cicatrizare

Fig. 10. Dop siliconic artizanal, decupat lateral, într-o placă de 96 godeuri

Pentru al doilea model de dop, tuburile de turnare au fost manufacturate prin turnare și

au prezentat un fund rectangular, cu laturile de 3mm/1mm.

Toate dopurile de silicon au fost sterilizate prin autoclavare la 120°C iar potențiala

toxicitate a fost testată prin testul MTT. Dopurile realizate s-au dovedit a fi non-citotoxice

pentru incubări de 5-7 zile. În consecință, am aplicat aceste dopuri artizanale în experimentele

următoare.

Test de cicatrizare simplu combinat cu evaluarea proliferării celulare prin testul

cu SytoxGreen

Pentru efectuarea testului de cicatrizare la suprafața unor biomateriale polimerice de

testat, am decis să efectuez o comparație între rezultatele testului clasic prin zgârierea

monostratului celular și aplicarea dispozitivului artizanal din silicon tehnic sterilizat (dop

circular). Am folosit pelicule de chitosan depuse în godeuri după metoda precizată într-un

capitol anterior

În cazul peliculelor transparente, metoda este relativ simplă, iar constructul artizanal

are avantajul de a oferi o zonă de dehiscență uniformă, cu o suprafață ușor de calculat.

Tehnica de zgâriere prezintă dezavantajul potențialei afectări mecanice a peliculei de testat,

fapt care alterează clar rezultatele.

20

Rezultate:

Fig. 11. Evaluare comparativă a ariei cicatrizate (scratch – zgâriere versus dop artizanal

rotund – circular stopper). Error bars - Confidence interval 95%

Din analiza ariilor de cicatrizare se observă că, inițial, dar mai ales la 24 de ore, ratele

de ocluzie sunt diferite, în favoarea sistemului cu dop circular. La 36 de ore, valorile de

cicatrizare sunt apropiate dar net în favoarea sistemului artizanal cu dop circular. Fără

îndoială, există sisteme comerciale care funcționează după un principiu similar, dar în cazul

sistemului experimentat în această lucrare, prețul este de circa 50 de ori mai mic. Importantă

însă este recomandarea de a renunța la efectuarea testului de cicatrizare prin zgâriere în cazul

testelor care explorează migrarea celulară pe suprafețe polimerice ale unor biomateriale cu

potențiale aplicații biomedicale. Testul cu opritor este mult mai fiabil și oferă rezultate de

acoperire mai bune și mai apropiate de realitate.

În comparație cu produsele disponibile comercial, constructul artizanal prezintă o serie

de avantaje – este netoxic pentru perioada relativ scurtă de incubare cu celulele, este ușor

customizabil dimensional, se poate autoclava și prezintă un preț de producție extrem de redus.

Astfel, produsele disponibile comercial sunt fie pentru plăci cu godeuri mai mari (plăci cu 24

godeuri CBA-120 CytoSelect™ 24-well Wound Healing Assay, CellBiolabs Cambridge, UK)

și cu dimensiune fixă (nu pot fi utilizate pentru testarea unor discuri metalice cu grosime de 1

mm), fie pentru godeuri de 96 dar cu profil exclusiv rotund. În plus, preturile acestor sisteme

la producător este absolut prohibitiv (500 euro o placă de 24 și 300 euro inserturile cu dop

rotund). Evident însă, pentru o standardizare și utilizare în evaluări de screening, sunt

necesare teste mecanice și ameliorări tehnice. Având în vedere posibilitățile actuale de

printare 3D, aceste detalii pot fi ușor rezolvate.

9. PREPARAREA ȘI TESTAREA UNUI SUPORT POLIMERIC POROS

FUNCȚIONALIZAT PENTRU PROLIFERAREA CELULARĂ

Motivația studiului

În această parte a tezei, am propus, alături de colectivul Disciplinei de Biologie

Celulară și Moleculară de la UMF Iași, funcționalizarea și evaluarea biocompatibilității unui

biomaterial polimeric sintetic, cu potențiale aplicații în terapia regenerativă.

Ideea originală a acestui experiment a fost aceea de a realiza un suport spumat

(microporos) de PVA fosforilat realizat printr-o procedură modificată și de a-i testa

biocompatibilitatea prin cele mai fiabile metode, selectate în lumina rezultatelor din studiile

comparative precedente.

21

Gradul de umflare a hidrogelului analizat crește odată cu reducerea cantității de

reticulant (glutaraldehidă) și mai ales procesul de umflare continuă și după 3 ore, moment

care reprezintă pragul limită de umflare pentru utilizarea unui grad de reticulare crescut. După

acest prag, în special pentru hidrogelul cu grad de reticulare redus, gradul de umflare scade

într-o măsură importantă. Dimensiunile porilor reprezintă un element important în generarea

unui suport poros pentru sisteme celulare. Dimensiunile medii ale porilor nu trebuie să fie

prea mari (>500µM) și nici prea mici, pentru a permite celulelor o migrare convenabilă în

interiorul acestui construct. Analiza spumelor în stare uscată și parțial hidratată în microscopie

electronică de baleiaj a demonstrat o reducere a dimensiunii porilor în cadrul procesului de

hidratare.

PPVA poros uscat PPVA parțial hidratat

Fig. 12. Variații ale dimensiunilor porilor în funcție de starea de hidratare la spuma PPVA

Analiza imagistică a porozității pentru cele două tipuri de spume a demonstrat o distribuție

mai omogenă a porilor pentru compoziția 1:1 decât pentru varianta 2:1. În schimb, traveele de

suport ale porilor au fost mai groase la compoziția 2:1 față de cea 1:1, putând favoriza mai

ușor aderența celulară.

Ca și dimensiuni medii, porii au variat mult între cele două compoziții. Dacă pentru

compoziția 2:1 dimensiunile porilor au variat între 2-51µM (valori măsurate pe un eșantion de

imagine), pentru materialul 1:1 dimensiunile au fost mult mai mari, variind între 4-51µM.

Pentru ca materialul să fie permisiv pentru celule, dimensiunile porilor trebuie să depășească

30 de microni și astfel, materialul 1:1 pare cel mai indicat pentru o dezvoltare ulterioară a

unor pori mai mari, element potențial realizabil prin varierea raportului HCl:CaCO3.

După determinarea generală a structurii și morfologiei spumelor de PPVA, etapa

următoare a constat în evaluarea biocompatibilității in vitro.

Testul de hemoliză

Am observat din graficele rezultate că hemocompatibilitatea pentru materialul

PPVA:CaCO3 2:1 este mai apropiată de controlul negativ decât materialul 1:1 și implicit este

încă un argument, alături de dimensiunile porilor, pentru utilizarea în teste de contact cu linii

celulare cu fenotip osteoblastic.

Estimarea viabilității celulare prin măsurarea absorbției și difuziei luminii sau analiza

directa in sistem FSS/SSC

Determinarea viabilității celulare este necesară pentru decelarea biocompatibilității

materialelor de testat. O metodă simplă și fiabilă de a evalua viabilitatea celulară este

excluderea unui colorant fluorescent. Iodura de propidiu (PI) este un fluorofor impermeabil

pentru celulele viabile în timp ce penetrează celulele neviabile, cuplându-se la ADN dublu-

catenar. PI este excitat de radiațiile cu lungime de undă de 488 nm și are o emisie maximă la

22

617 nm. Rezultatele au arătat o viabilitate foarte bună pentru ambele materiale în contact cu

celulele osteoblast-like, toate datele fiind raportate la controalele negative

Fig. 13. Rezultatele viabilității celulare (HOS) exprimată procentual și determinată prin

analiza FACS cu PI pentru materialele PPVA 1:1 și 2:1

Evaluarea biocompatibilității spumelor PPVA prin teste de inhibiție de contact

Pentru testele de inhibiție de contact, am realizat un experiment simplu în plăci cu 6

godeuri în care am amplasat 3 mL mediu de cultură MEM complet (10%FCS, 1% penicilină -

streptomicină, 1%Glutamax) și 1x106 celule HOS (osteosarcom uman) împreună cu probe de

1x1x1 cm din materialele de studiu. Pregătirea celulelor, cultivarea, proliferarea, detașarea și

numărarea au fost descrise la capitolul material și metode. Imaginile preluate la 72 de ore de

la incubare arată o proliferare celulară bună în imediat contact cu cele două materiale depuse

în godeurile plăcii de 6. Densitatea celulară pare ușor mai crescută în imediat contact cu

materialul de studiat. Realizarea testelor de viabilitate cu ajutorul kiturilor CellTiterBlue (pe

bază de resazurină-resorufină) și CellTiterGlo (pe bază de dozare chemiluminometrică a ATP)

au determinat obținerea de rezultate similare, cele două tipuri de spume prezentând o

biocompatibilitate foarte bună.

Fig. 14. Evaluarea comparativă a viabilității spumelor PPVA prin testul resazurină-resorufină

23

Fig. 15. Evaluarea comparativă a viabilității spumelor PPVA prin testul de dozare a ATP

Viabilitatea celulară pentru materialul PPVA 2:1 a variat de la 97,84% la 24 de ore la

92,46% la 72 de ore, ușoara reducere a viabilității în raport cu godeurile de control fiind

datorată relativ ușoarei acidifieri observată în experimentul de determinare a evoluției pH-ului

în timp.

Viabilitatea celulară în contact cu materialul PPVA 1:1 a variat de la 96,77% la 24 de

ore la 90,31% la 72 de ore. Reducerea procentuală a viabilității a fost puțin mai accentuată

decât la materialul PPVA 2:1, dar se menține la valori deosebit de ridicate (în jur de 90%).

În concluzie, viabilitatea celulară pentru celule osteoblast-like la 24 și 72 de ore este

foarte bună și recomandă utilizarea materialului produs ca și suport poros pentru proliferare

celulară și eventuala utilizare în terapia regenerativă.

Testarea in vivo este importantă pentru testarea biomaterialelor deoarece testele in

vitro nu pot înlocui testele in vivo (la testele in vitro nu se poate evalua răspunsul inflamator,

influenţa asupra sistemului imun, remodelarea tisulară).

Testele in vivo furnizează date despre interacţiunea a diferitelor tipuri de celule,

despre efectele factorilor hormonali, despre interacţiunile cu matricea extracelulară şi cele cu

celulele sanguine, proteinele ţi alte molecule din organism.

Testele suplimentare referitoare la viabilitatea celulară în contact cu materialul evaluat

au adus informații complementare utile în perspectiva utilizării acestuia ca și suport pentru

ingineria tisulară. Testele de hemocompatibilitate determină relația imediată a materialului cu

celulele sângelui iar testele de citotoxicitate completează tabloul biocompatibilității. Testele

utilizate au fost selectate dintre cele evaluate în capitolul precedent, fiind cele care au cele mai

puține surse de eroare. Ca urmare a acestor evaluări, am putut realiza diferențele între cele

două compoziții testate, din punct de vedere al biocompatibilității. În consecință, pentru

testele mai sofisticate și costisitoare au putut fi selectate numai probele cu un indice de

biocompatibilitate mai important. Apare astfel ca foarte importantă o etapizare a aplicări

testelor de viabilitate disponibile în vederea evaluării cât mai coerente a unui biomaterial cu

potențiale aplicații în domenii biomedicale (inginerie tisulară).

24

10. CONCLUZII FINALE

1. Studiul bibliografic demonstrează că testele MTT si MTS domină topul metodelor de

evaluare a viabilității/proliferării celulare, în timp ce testele WST-1 (272 citări),

AlamarBlue (resazurina – 134 citări), PicoGreen (30 citări) și CyQuant (94 citări). Pentru

testarea biomaterialelor, am obținut date diferite și interesante – am remarcat utilizarea

aproape exclusivă a testului MTT (1437 rezultate) față de celelalte variante, mai

performante sau mai puțin toxice pentru celule (testele MTS (174 rezultate), WST-1 (85

rezultate), XTT (66 rezultate) și CCK-8 (51 rezultate), LDH (275 rezultate), CyQuant (13

rezultate), PicoGreen (33 rezultate)).

2. Testele care utilizează celule aderente sunt, în mod evident, cele mai utile pentru

evaluarea biocompatibilității unor materiale care au potențial de utilizare în contact direct

cu țesuturile umane.

3. Testul MTT deși este cel mai frecvent utilizat în testarea biocompatibilității

biomaterialelor, deoarece prezintă un cost redus de utilizare, prezintă inconvenientul unui

timp de incubare de 1-4 ore )cu creșterea toxicității compusului asupra celulelor) și al

dependenței de variațiile pH. De asemenea, testul MTT este un marker al intensității

metabolice a celulelor vii și doar indirect (sau aproape deloc) un marker al proliferării

celulare.

4. Testele pe bază de resazurină-resorufină utilizate pentru determinarea biocompatibilității

pun probleme la citirea și interpretarea viabilității celulare. Incubarea peste 4 ore

determină efecte citotoxice, existând, de asemenea, inconvenientul unor

manipulări/incubări care impietează asupra unei eventuale proceduri de screening.

5. Testele de evaluare a viabilității prin determinarea cantității de ATP sunt fiabile dar

influențate de o serie de factori. La un număr de 2 - 4 recongelări, compusul reconstituit

pierde din fiabilitatea răspunsului și rezultatele sunt alterate. Compoziția mediului de

cultură și prezența roșului-fenol influențează interpretarea rezultatelor biocompatibilității.

Tipurile de plăci utilizate la interpretarea rezultatelor sunt esențiale pentru validitatea

datelor prin prezența diferitelor tipuri de interferențe.

6. Din testele de evaluare a biocompatibilității pe baza integrității membranare, testul cu PI

nu este recomandat nici pentru materiale metalice nici pentru cele polimerice, testul cu

albastru tripan realizează o supraevaluare a viabilității, fiind util numai pentru numărarea

celulelor care vor fi aplicate pe materialele de studiu.

7. Testele de aderență și migrare beneficiază de kiturile fluorescente Cell Tracker care pot

extinde durata testului pe 4 maxim 5 zile, pentru o menținere a fluorescenței în limitele

unei interpretări corecte, interpretare care nu trebuie să influențeze efectul eventual toxic

al biomaterialului de studiat. Testele cu cell tracker nu sunt utile pentru materiale care ar

putea elimina amine si tioli.

8. Pentru testarea biocompatibilității unor pulberi (metalice, metalice acoperite, particule,

nanoparticule) este necesar ca aceste eșantioane de testat să fie adăugate după obținerea

subconfluenței celulare în godeurile de test.

9. Evaluarea citotoxicității prin utilizarea metodei indirecte (cu utilizarea lichidului de

extracție) nu dă rezultate mulțumitoare, mai exact viabilitatea celulară este supraevaluată.

Pentru testele de aderență și migrare celulară se recomandă a renunța la efectuarea testului

de cicatrizare prin zgâriere în cazul testelor care explorează migrarea celulară pe suprafețe

polimerice ale unor biomateriale cu potențiale aplicații biomedicale. Testul cu opritor este

mult mai fiabil și oferă rezultate de acoperire mai bune și mai apropiate de realitate.

Constructul artizanal realizat în cadrul tezei este netoxic pentru perioada relativ scurtă de

incubare cu celulele, este ușor customizabil dimensional, se poate autoclava și prezintă un

preț de producție extrem de redus în raport cu produsele existente pe piață.

10. S-ar recomanda aplicarea unui test de citotoxicitate combinat cu explorare imagistică și

cuantificare. Eventual explorare imagistică SEM.

25

11. Un studiu personal s-a finalizat cu obținerea unui material bazat pe un polimer

biodegradabil, cu o structură poroasă demonstrată, util ca de suport pentru proliferarea

celulară a celulelor cu fenotip osteoblastic. Materialul descris a fost caracterizat fizico-

chimic și biologic și testat după metodele considerate cele mai fiabile ca urmare a

studiului precedent. Rezultatele au arătat o bună biocompatibilitate a spumei produse și un

potențial de dezvoltare pentru un scaffold destinat ingineriei tisulare.

12. Nu există o metodă unică, rapidă, ieftină, cantitativă de evaluare a viabilității la interfața

cu biomaterialul. Este necesară o selectare a metodologiei nu numai în raport cu

rezultatele urmărite ci și cu tipul materialului și costurile estimate ale investigațiilor de

urmat. Soluția ideala rămâne transfecția GFP sau utilizarea unor metode fizice care evită

transfecția.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 1. Wiese KG, Heinemann DE, Ostermeier D, Peters JH. Biomaterial properties and biocompatibility in cell culture of a

novel self-inflating hydrogel tissue expander. J Biomed Mater Res. 2001;54(2):179-88. 2. Lu J, Laudinet J, Williams S. Mechanical stimulation and evaluation of hydrogel biomaterial. Bio-medical materials and

engineering. 2008;18(4-5):335-7.

3. Nishi C, Nakajima N, Ikada Y. In vitro evaluation of cytotoxicity of diepoxy compounds used for biomaterial

modification. J Biomed Mater Res. 1995;29(7):829-34. 4. Kawagoishi N, Nojiri C, Senshu K, Kido T, Nagai H, Kanamori T, et al. In vitro evaluation of platelet/biomaterial

interactions in an epifluorescent video microscopy combined with a parallel plate flow cell. Artificial organs.

1994;18(8):588-95.

5. Ciapetti G, Cenni E, Pratelli L, Pizzoferrato A. In vitro evaluation of cell/biomaterial interaction by MTT assay. Biomaterials. 1993;14(5):359-64.

6. Cenni E, Ciapetti G, Pratelli L, Pizzoferrato A. [In vitro and in vivo evaluation of the blood-biomaterial interaction].

Minerva cardioangiologica. 1992;40(9):297-316.

7. Jacker HJ, Meyer R, Gruttner S. [The toxicologic evaluation of biomaterials. 1. Results of biomaterial tests in cultures of human amnion epithelial cells and human fibroblasts]. Die Pharmazie. 1985;40(7):472-5.

8. Park JB, Lakes RS. Introduction to Biomaterials. Biomaterials: Springer; 1992. p. 1-6.

9. Narayan RJ, Bhaduri SB, Fischman G, Michael Rigsbee J, Zhang X. Next generation biomaterials. Materials Science and Engineering: C. 2007;27(3):345-6.

10. Lakes RS. Biomaterials: an introduction: Springer; 2007.

11. Park JB, Bronzino JD. Biomaterials: principles and applications: crc press; 2002.

12. Park JB, Lakes RS. Metallic implant materials. Biomaterials. 2007:99-137. 13. Lakes R. Composite biomaterials. JD Bronzino, ed. 1995:598-610.

14. Williams D. The relationship between biomaterials and nanotechnology. Biomaterials. 2008;29(12):1737-8.

15. Colvin VL. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature biotechnology. 2003;21(10):1166-

70. 16. Collet D, Lefebvre F, Quentin C, Rabaud M. In vitro studies of elastin-fibrin biomaterial degradation: preservative

effects of protease inhibitors and antibiotics. Biomaterials. 1991;12(8):763-6.

17. Cehreli M. Biomechanics of dental implants : handbook of researchers. Hauppauge, N.Y.: Nova Science; 2011. p. p.

18. McKinney RV, Lemons JE, American Academy of Implant Prosthodontics. The Dental implant : clinical and biological response of oral tissues. Littleton, Mass.: PSG Pub. Co.; 1985. xv, 205 p. p.

19. Caswell CW, Clark AE. Dental implant prosthodontics. Philadelphia: Lippincott; 1991. xvii, 331 p., 2 p. of plates p.

20. Garg AK. Implant dentistry : a practical approach. 2nd ed. Maryland Heights, Mo.: Mosby/Elsevier; 2010. xii, 338 p. p.

21. Pivodova V, Frankova J, Ulrichova J. Osteoblast and gingival fibroblast markers in dental implant studies. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czechoslovakia. 2011;155(2):109-16.

22. Steflik DE, Parr GR, Sisk AL, Lake FT, Hanes PJ, Berkery DJ, et al. Osteoblast activity at the dental implant-bone

interface: transmission electron microscopic and high voltage electron microscopic observations. Journal of

periodontology. 1994;65(5):404-13. 23. Boyd WD, Johnson WE, 3rd, Sultan PK, Deering TF, Matheny RG. Pericardial reconstruction using an extracellular

matrix implant correlates with reduced risk of postoperative atrial fibrillation in coronary artery bypass surgery patients.

The heart surgery forum. 2010;13(5):E311-6.

24. Romanos GE, Schroter-Kermani C, Weingart D, Strub JR. Health human periodontal versus peri-implant gingival tissues: an immunohistochemical differentiation of the extracellular matrix. The International journal of oral &

maxillofacial implants. 1995;10(6):750-8.

25. Zhu Q, Safavi KE, Spangberg LS. Integrin expression in human dental pulp cells and their role in cell attachment on

extracellular matrix proteins. Journal of endodontics. 1998;24(10):641-4. 26. Charoenpanich A, Wall ME, Tucker CJ, Andrews DM, Lalush DS, Loboa EG. Microarray analysis of human adipose-

derived stem cells in three-dimensional collagen culture: osteogenesis inhibits bone morphogenic protein and Wnt

signaling pathways, and cyclic tensile strain causes upregulation of proinflammatory cytokine regulators and angiogenic

factors. Tissue engineering Part A. 2011;17(21-22):2615-27. 27. Meyer U, Meyer T, Schlegel W, Scholz H, Joos U. Tissue differentiation and cytokine synthesis during strain-related

bone formation in distraction osteogenesis. The British journal of oral & maxillofacial surgery. 2001;39(1):22-9.

26

28. Schmalz G, Arenholt-Bindslev D, SpringerLink (Online service). Biocompatibility of Dental Materials. Berlin,

Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg,; 2009. Available from: http://dx.doi.org/10.1007/978-3-540-77782-3.

29. Black J. Biological performance of materials : fundamentals of biocompatibility. 3rd ed. New York: Marcel Dekker;

1999. xii, 463 p. p. 30. Silver FH, Christiansen DL. Biomaterials science and biocompatibility. New York: Springer; 1999. x, 342 p. p.

31. Biocompatibility and performance of medical devices. Philadelphia, PA: Woodhead Pub.; 2012.

32. Ducheyne P. Comprehensive biomaterials. Amsterdam ; Boston: Elsevier; 2011.

33. Williams DF. Biocompatibility of clinical implant materials. Boca Raton, Fla.: CRC Press; 1981. 34. Lamhaut L, Apriotesei R, Combes X, Lejay M, Carli P, Vivien B. Comparison of the accuracy of noninvasive

hemoglobin monitoring by spectrophotometry (SpHb) and HemoCue(R) with automated laboratory hemoglobin

measurement. Anesthesiology. 2011;115(3):548-54.

35. Liddington RC. Structural Aspects of Integrins. I Domain Integrins: Springer; 2014. p. 111-26. 36. Daniel LL, Joyner WL, Singh M, Singh K. Integrins: Implications for Aging in Heart Failure Therapy. Aging and Heart

Failure: Springer; 2014. p. 401-10.

37. Koivisto L, Heino J, Häkkinen L, Larjava H. Integrins in Wound Healing. Advances in Wound Care. 2014.

38. Sun C-C, Qu X-J, Gao Z-H. Integrins: players in cancer progression and targets in cancer therapy. Anti-cancer drugs. 2014;25(10):1107-21.

39. Ruoslahti E, Pierschbacher MD. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 1987;238(4826):491-7.

40. Kishimoto TK, Larson RS, Corbi AL, Dustin ML, Staunton DE, Springer TA. The leukocyte integrins. Advances in

immunology. 1989;46:149-82. 41. McEver RP. Rolling back neutrophil adhesion. Nat Immunol. 2010;11(4):282-4.

42. Bromley SK, Luster AD. Turning up the heat on HEVs. Nature immunology. 2006;7(12):1288-90.

43. Pu F, Williams R, Markkula T, Hunt J. Effects of plasma treated PET and PTFE on expression of adhesion molecules by

human endothelial cells in vitro. Biomaterials. 2002;23(11):2411-28. 44. Klokkevold PR, Vandemark L, Kenney EB, Bernard GW. Osteogenesis enhanced by chitosan (poly-N-acetyl

glucosaminoglycan) in vitro. Journal of periodontology. 1996;67(11):1170-5.

45. Muzzarelli R, Zucchini C, Ilari P, Pugnaloni A, Mattioli Belmonte M, Biagini G, et al. Osteoconductive properties of

methylpyrrolidinone chitosan in an animal model. Biomaterials. 1993;14(12):925-9. 46. Lewinski N, Colvin V, Drezek R. Cytotoxicity of nanoparticles. Small. 2008;4(1):26-49.

47. Nafee N, Schneider M, Schaefer UF, Lehr C-M. Relevance of the colloidal stability of chitosan/PLGA nanoparticles on

their cytotoxicity profile. International journal of pharmaceutics. 2009;381(2):130-9.

48. Strober W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology: John Wiley & Sons, Inc.; 2001.

49. Altman SA, Randers L, Rao G. Comparison of trypan blue dye exclusion and fluorometric assays for mammalian cell

viability determinations. Biotechnology Progress. 1993;9(6):671-4.

50. Brana C, Benham C, Sundstrom L. A method for characterising cell death in vitro by combining propidium iodide staining with immunohistochemistry. Brain research Brain research protocols. 2002;10(2):109-14.

51. Newbold A, Martin BP, Cullinane C, Bots M. Detection of apoptotic cells using propidium iodide staining. Cold Spring

Harbor protocols. 2014;2014(11):pdb prot082545.

52. Hezel M, Ebrahimi F, Koch M, Dehghani F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron. 2012;43(10):1031-8.

53. Fotakis G, Timbrell JA. In vitro cytotoxicity assays: comparison of LDH, neutral red, MTT and protein assay in

hepatoma cell lines following exposure to cadmium chloride. Toxicology letters. 2006;160(2):171-7.

54. Han X, Gelein R, Corson N, Wade-Mercer P, Jiang J, Biswas P, et al. Validation of an LDH assay for assessing nanoparticle toxicity. Toxicology. 2011;287(1):99-104.

55. Jones LJ, Gray M, Yue ST, Haugland RP, Singer VL. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT®

cell proliferation assay. Journal of immunological methods. 2001;254(1):85-98.

56. Meffert RM, Langer B, Fritz ME. Dental implants: a review. Journal of periodontology. 1992;63(11):859-70. 57. Brånemark P, Adell R, Albrektsson T, Lekholm U, Lundkvist S, Rockler B. Osseointegrated titanium fixtures in the

treatment of edentulousness. Biomaterials. 1983;4(1):25-8.

58. Roth BL, Poot M, Yue ST, Millard PJ. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic

acid stain. Applied and environmental microbiology. 1997;63(6):2421-31. 59. Vohra S, Hennessy KM, Sawyer AA, Zhuo Y, Bellis SL. Comparison of mesenchymal stem cell and osteosarcoma cell

adhesion to hydroxyapatite. Journal of materials science Materials in medicine. 2008;19(12):3567-74.

60. Tenstad E, Tourovskaia A, Folch A, Myklebost O, Rian E. Extensive adipogenic and osteogenic differentiation of

patterned human mesenchymal stem cells in a microfluidic device. Lab on a chip. 2010. 61. Ridley AJ, Schwartz MA, Burridge K, Firtel RA, Ginsberg MH, Borisy G, et al. Cell migration: integrating signals from

front to back. Science. 2003;302(5651):1704-9.

62. Liang CC, Park AY, Guan JL. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration

in vitro. Nature protocols. 2007;2(2):329-33. 63. Sreenivasan K. Enhanced drug uptake and retention by surface phosporylated polyvinyl alcohol. Journal of applied

polymer science. 2004;94(2):651-6.

64. Kokubo T, Takadama H. How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity? Biomaterials. 2006;27(15):2907-15.

65. Noe DA, Weedn V, Bell WR. Direct spectrophotometry of serum hemoglobin: an Allen correction compared with a three-wavelength polychromatic analysis. Clinical chemistry. 1984;30(5):627-30.

66. Datta P, Chatterjee J, Dhara S. Phosphate functionalized and lactic acid containing graft copolymer: synthesis and

evaluation as biomaterial for bone tissue engineering applications. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition.

2013;24(6):696-713.

27

Lista lucrărilor publicate sau acceptate la publicare din subiectul tezei de doctorat

1. Comparative assessment of biocompatibility of NiCr and CoCr alloys used in metal-

fused-to-ceramic technology

Autori: Raluca Monica Comăneanu1, Violeta Hancu1, Horia Mihail Barbu1, Costin Coman1,

Cosmin Mihai Cotruț2, Mihail Târcolea2, Ana Maria Holicov3, Alina Ormenișan4

Acknowledgement: All authors had equal contributions. This work was supported by

Partnerships in priority areas program - PN II, developed with support from ANCS, CNDI -

UEFISCDI, project no. 175/02.07.2012 (Coat4Dent).

Aprobat pentru publicare în Revista de Chimie, (ISI, FI = 0,677) vol. 66, nr. 3/2015, aprobare

atașată dosarului.

2. Comparative evaluation of two viability assays on biodegradable polymer foams for

potential bone regeneration

Autori: Ana Maria Holicov, Tudor Petreuș*, Carmen Elena Cotrutz

Romanian Journal of Oral Rehabilitation, (BDI), Vol. 6, No. 1, January - March 2014, pp15-

19.

3. Cell proliferation and migration assay on polymer surfaces Autori: ANA MARIA HOLICOV, TUDOR PETREUȘ*, CARMEN ELENA COTRUTZ

Analele Ştiinţifice ale Universităţii „Alexandru Ioan Cuza”, Secţiunea Genetică şi Biologie

Moleculară, (BDI) TOM XV, 2014, pp. 35-40

http://www.gbm.bio.uaic.ro/index.php/gbm/article/view/1161/1097