Post on 04-Feb-2017
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
Caracterizarea nanoparticulelor de ZnO
in vederea evaluarii riscurilor asupra
mediului si calitatii vietii
A.Bragaru, M. Kusko, E. Vasile*, M. Simion, M. Danila, T. Ignat, I. Mihalache, R. Pascu, F. Craciunoiu
Diana Savu**
Laboratorul de Nanobiotehnologii, IMT Bucuresti, Romania
e-mail: adina.bragaru@imt.ro* UPB Bucuresti
** IFIN-HH Magurele
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
Primul pas: o analiza mai in detaliu pentru fiecare tip de NPs, in functie de aplicatia dorita (Fubini et al.Nanotoxicology 4, (2010) 347-363) :
- dimensiunea/forma (distributia de dimensiune);- aria suprafetei;- cristalinitatea;- proprietatile electrice;- compozitia chimica – reactivitatea suprafetei, grupele functionale de la suprafata, gradul de stabilitate;- solubilitatea si gradul de aglomerare;
FP7 Engineered Nanoparticles Risk Assesment (ENPRA) (2009-2012) (www.enpra.eu) :
Evaluarea riscului NPs presupune expunerea si identificarea pericolelor, hazardului !Principalele componente ale evaluarii riscului:
- identificarea pericolului (hazardului) (hazard identification)- evaluarea raspunsului in functie de doza (dose-response assesment)- expunerea riscului (risk exposure)- evaluarea si managementul riscului (risk and management assesment)
Urmatorul pas: evaluarea riscurilor expunerii NPs prin efectuarea testelor de toxicologie in vitro(S. Arora et al., Toxicology and Applied Pharacology 258 (2012) 151-165)
- studiu pulmonar, renal, hepatic, cardio-vascular, urmarindu-se:- stresul oxidativ;- genotoxicitatea;- apoptoza;- hemoliza;- etc;
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
Studii privind evaluarea gradului de toxicitate al ZnO-NPs s-au efectuat pe diferite
dimensiuni, DAR exista inca probleme nerezolvate referitoare la influenta dimensiunilor mici
de NP (5-10 nm) asupra toxicitatii (Lin et al., J Nanopart Res 11 (2009)25–39 )
Scopul acestui studiu – de a caracteriza proprietatile fizico-chimice ale
ZnO-NPs cu dimensiuni < 10 nm, si de a studia gradul de stabilitate
al dispersiilor formate din aceste NPs, primele etape pentru
viitoarele studii de toxicologie (Jiang et al., J Nanopart Res 11 (2009)77–89)
ZnO-NPs – denumirea comerciala Zincox™, de la Nanogate AG, companie partenera
in proiectul FP7 Project NanoSustain (2010-2013)
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
Caracterizarea nanoparticulelor
a(a)
Determinarea structurii cristaline - XRDDeterminarea proprietatilor optice -spectroscopia UV-Vis
Dimensiunea medie: 8.5-10 nm
Caracterizare morfologica
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150
105
106
(220)(214)
(205)
(006)
(302)
(213)
(204)
(300)
(105)(212)
(114)
(211)
(210)
DHW = 8.9nm
εWPPF = 0.16%DWPPF = 8.6nm
(203)
(104)
(202)
(004)
(201)
(112)
(200)
(103)
(110)
(102)
(002) (101)
I [co
unts
]
2θ [o]
ZnO NP(100)
200 300 400 500 600
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Abso
rban
ce (a
.u.)
Wavelength (nm)
100 µg/mL ZnO aq. sol. 50 µg/mL ZnO aq. sol. 25 µg/mL ZnO aq. sol.
λpeak~ 365 nm
λcut-off ~ 396 nm
Corelare buna a rezultatelor masuratorilor :
- spectroscopie UV-Vis - 7.8 nm
-SEM - 8.5-10.0 nm
-TEM - 6-14 nm
- XRD - 8.6-9.5 nm
D Scherer eq=9.5 nm
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
Evaluarea gradului de stabilitate a dispersiilor de ZnO-NPs
Dispersii apoase de ZnO-NPs
Diametrul hidrodinamic (dh ) si potentialul zeta (ζ ) – prima etapa in evaluarea efectelor asupra mediului sisanatatii umane – inaintea studiilor in vitro si in vivo (Murdock et al. 2008)
7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
Hyd
rodi
nam
ic d
iam
eter
(nm
)
pH
25 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml
7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0
-40
-20
0
20
40
60
80
Zeta
pot
entia
l (m
V)
pH
25 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml
IEP=8.9
IEP=9.1
IEP=9.3
Valorile max ale dh – in apropierea IEP, unde apar aglomerari
Cresterea concentratiei Cresterea dh
!Concentratie
(µg/ml)PDI
25 0.46550 0.483100 0.580
pH 7-9, ζ valori pozitivepH 9.5-11.5, ζ valori negative
( )+OHZn( )−
4OHZn ( ) −24OHZnsi
pH ≠ IEP dh - scade ζ - creste
cresterea [ZnO] ζ scade
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
Evaluarea efectului cresterii tariei ionice asupra stabilitatii dispersiilor
Influenta concentratiei si pH-ului asupra dh si ζ in momentul cresterii tariei ionice (IS) (5×10-4, 10-3, 10-2 si 10-1 M NaCl)
7 8 9 10 11 12
500
750
1000
1250
1500
1750
5x10-4 M
10-5 M
10-3 M
10-2 M
Hyd
rodi
nam
ic d
iam
eter
(nm
)
pH
10-1 M
7 8 9 10 11 12-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
10-1 M
10-2 M
10-3 M
5x10-4 M
Zeta
pot
entia
l (m
V)
pH
10-5 M
1E-5 1E -4 1E-3 0.01 0.18.7
8.8
8.9
9.0
9.1
9.2
9.3
Isoe
lect
ric p
oint
Ion ic strength (M)
IEP
1E-5 1E-4 1E-3 0.01 0.1400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800 Hydrodynamic diameter Zeta potential
Ionic strength (M)
Hyd
rodi
nam
ic d
iam
eter
(nm
)
5
10
15
20
25
30
35
Zeta potential (mV
)
Ionic strength (M)
Hydrodinamic diameter Zeta potential
(mV)dh
(nm)PDI Average
error %10-5 751.6 0.165 0.3 31.01
5×10-4 519.6 0.254 5.5 30.9310-3 1239.3 0.320 1.8 16.4210-2 1475.3 0.335 4.1 13.8310-1 1638.4 0.450 2.5 7.62
Variata dh si ζ cu IS la pH 8 si 50 µg/ml ZnO-NPs
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
Procesul de agregare – intre ZnO-NPs dispersate in sol NaCl
Forma se schimba, ZnO-NPs – forma poliedrica !
Investigarea morfologica privind efectul cresterii tariei ionice asupra stabilitatii dispersiilor
10-3 M NaCl 10-1 M NaCl
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
!Concluzii
Analiza rezultatelor privind ZnO-NPs sub forma de pulbere si dispersie – diametrele
hidrodinamice masurate pentru fiecare concentratie preparata - sunt de 10 ori mai mari decat cele ale pulberilor
Explicatia: formarea de specii instabile Zn(OH)2 si ( )−3OHZn ( ) −2
4OHZn
Rezultatele indica influenta puternica pe care o exercita mediul de dispersie/taria
ionica asupra gradului de stabilitate al ZnO-NPs, analiza cat mai completa a acestora
putand asigura un control privind dozajul in timpul testelor de bio-toxicitate!
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
Studii de toxicitate asupra efectelor biologice induse de ZnO-NPs
Prepararea probelor pentru experimentele in vitro: pulberea ZnO – suspendata in ser fiziologic (2 mg/ml); sol stoc – 30 mindispersare in baie de apa cu ultrasunete si 15 min autoclavate la 121°C; [ZnO] = 200-0.5 µg/ml in MEM, αMEM,DMEM cu 10 si20% FCS
2 linii celulare: fibroblaste de soarece (L929) si celule melanoma de soarece (B16)Medii de cultura: (i) L929 - αMEM cu 2 mM Glutamina+20%FCS si MEM cu 2 mM Glutamina+10%FCS (ii) B16 - DMEM + 10%FCS.In toate mediile de cultura folosite s-a adaugat streptomicina 100µg/ml si penicilina 100 unitati/ml.
Testul MTS (determinarea viabilitatii celulare) si testul de supravietuire clonogenica
- modificari morfologice si inhibarea viabilitatii, relatie doza-efect de tip logaritmic; - Concentratia medie letala (IC50 ) calculata pentru ZnO-NPs - 10.1 µg/ml pentru L929 crescute in MEM cu 10%FCS si 30.2 µg/ml pentru celulele crescute in alphaMEM cu 20%FCS
Suplimentarea mediului de cultura cu un procent mai mare de ser fetal are un efect de protectie impotriva efectului citotoxic indus de nanoparticule.
-pentru melanoma B16, curba doza-efect se situeaza in acelasi domeniu devalori ca si L929, cu IC50 de 22.2 µg/ml.- in conditiile experimentale folosite inacest studiu, nu putem trage o concluzierelativa la sensibilitatea semnificativdiferita a celulelor canceroase incomparatie cu celulele normale atuncicand sunt expuse la ZnO-NPs.
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
Testul de supravietuire si proliferare colonogenica
- abilitatea unei singure celule de a se divide si a produce o colonie
Pentru celulele L929 - deteriorare semnificativa a integritatii reproductive a celulelor odata cu cresterea
dozei de ZnO-NPs dupa 8 zile
Efectul expunerii la ZnO-NPs asupra integritatii reproductive (formare de colonii) a celulelor L929; Punctele reprezinta numarul de colonii
gasite dupa 8 zile de expunere la ZnO
Doza de 6 µg/ml - pierderea totala a capacitatii reproductive a celulelor dupa 8 zile de incubare cu ZnO-NPs
Celule apoptotice L929 in MEM induse dupa 20 de ore de incubare in prezenta
de ZnO-NPs
- in domeniul de doze < 10 µg/ml nivelul de celule apoptotice indus este neglijabil, apoptoza astfel pare sa nu
fie unul dintre mecanismele de inducere a toxicitatii- Pentru concentratii mai mari de ZnO nu s-a mai putut pune in
evidenta apoptoza cu metoda folosita in experiment
celulele L929 marcate si analizate prin microscopie de fluorescenta s-au dovedit a fi viabile
Masurarea gradului de apoptoza indus de incubarea celulelor cu nanoparticule
Celulele – incubate 24h (37ºC, 5%CO2), inainte de
a fi expuse ZnP-NPs pentru 20 h. Dupa
incubarea de 24 de ore, mediul de cultura a fost
extras si inlocuit cu 200 µl sol ZnO-NPs diferite
concentratii; Drept control s-a folosit celule incubate doar in mediu de cultura,
fara nanoparticule
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
Evaluarea genotoxicitatii induse de nanoparticulele de ZnO
- Genotoxicitatea indusa de ZnO-NPs asupra celulelor L929 a fost testata prin metodele cometei alcaline si formarea de micronuclei;- ZnO-NPs nu induc o alterare semnificativa a ADN-ului prin cresterea nivelului de micronuclei formati, neexistand o dependenta anumarului acestora de timp, in domeniul 0.5 – 20 µg/ml;
Determinarea genotoxicitatii prin masurarea nivelului de micronuclei la celule L929 si B16 incubate 20h cu ZnO-NPs
In cazul testului cometei - rezultatele - un efect de inducere a deteriorarii ADN-ului intr-o maniera dependenta atat de concentratia ZnO-NPs cat si de timpul de incubare in prezenta acestora. Diferente semnificative apar
la 40 de ore de expunere
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
Sunt necesare experimente suplimentare pentru o adaptare mai buna
a metodologiilor folosite in acest studiu la caracteristicile dispersiilor
de nanoparticule pentru care se urmareste raspunsul toxic
Concluzii
- Monitorizarea viabilitatii a doua tipuri de celule (L929 si B16) prin testul MTS indica un efect citotoxic
dependent atat de doza cat si de timpul de expunere la ZnO-NPs
!
!- toxicitatea nanoparticulelor studiate pare sa nu fie indusa prin apoptoza
- parametrul supravietuire clonogenica evidentiaza un efect puternic de scadere a capacitatii proliferative cu dozade expunere
A 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, BucureştiA 12-a ediţie a Seminarului Naţional de Nanoştiinţă şi Nanotehnologie,Biblioteca Academiei Române, Bucureşti
16 mai 2013
Acknowledgement
Aceste studii au fost realizate cu sprijinul proiectului finantat de Uniunea Europeana FP7/2001-2013NanoSustain - Development of sustainable solutions for nanotechnology based products based on hazardcharacterization and LCA
Multumiri Dr. Adrian Dinescu pentru caracterizarea SEM
Va multumesc!adina.bragaru@imt.ro
A. Bragaru, M. Kusko, E. Vasile, M. Simion, M. Danila, T. Ignat ,I. Mihalache, R. Pascu, F. Craciunoiu, Analytical characterization ofengineered ZnO nanoparticles relevant for hazard assessment, J Nanopart Res (2013) 15:1352, DOI 10.1007/s11051-012-1352-0